高瑞晗,邱 菲,叢 航

(貴州省大環(huán)化學及超分子化學重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

琥珀酰膽堿是一種煙堿型乙酰膽堿受體阻斷劑,常作為骨骼肌松弛劑在臨床手術(shù)中用作麻醉劑[9-10];但在人體內(nèi)過量吸收會導致心律失常,嚴重時甚至會危及生命。因此出于安全考慮,它的使用應受到嚴格控制。利用色譜法[11-12]和光譜法[10]測定琥珀酰膽堿的含量,具有檢測耗時長、檢測范圍窄、靈敏度低等缺點。這促使我們探索一種更靈敏的方法來分析琥珀酰膽堿。

本文通過引入H2O2增敏發(fā)光主體的電化學發(fā)光強度,構(gòu)建基于羧甲基取代benzo[3]uril的電化學發(fā)光傳感器,并利用電化學發(fā)光手段考察膽堿類物質(zhì)與其主客體作用及靈敏性識別?；谥骺腕w相互作用,利用其空腔包結(jié)琥珀酰膽堿,在H2O2增敏條件下,大環(huán)主體羧甲基取代benzo[3]uril的電化學發(fā)光強度增強,從而建立了一種新的、靈敏的方法以檢測琥珀酰膽堿。

1 實驗部分

1.1 試劑

30% H2O2,琥珀酰膽堿,氫氧化鈉,磷酸鹽緩沖溶液(PBS),試劑均購于Aldrich Alfa Aesar化學試劑公司、北京伊諾凱公司;所有實驗用水為超純水。羧甲基取代benzo[3]uril由我們課題組開發(fā)方法[8]合成。

1.2 儀器

ECL測試和電化學信號測試均使用LK5100電化學發(fā)光分析系統(tǒng)(天津蘭力科高科技公司);實驗用常規(guī)三電極體系,工作電極為玻碳電極(Φ=3 mm),參比電極為Ag/AgCl電極,對電極為鉑絲電極。

1.3 電極預處理

將玻碳電極用直徑為3 mm的α-Al2O3拋光粉進行打磨,后依次用超純水、無水乙醇分別超聲5 min,直至玻碳電極表面呈鏡面般光滑。實驗采用的是工作電極為玻碳電極,參比電極為Ag/AgCl電極,對電極為鉑絲電極的經(jīng)典三電極體系。

1.4 電化學發(fā)光測試

每次量取2 mL的測試液于比色皿中,用裸電極測試在不同pH條件、不同濃度共反應試劑下進行羧甲基取代Benzo[3]uril電化學發(fā)光實驗。電化學發(fā)光實驗參數(shù)設置:光電倍增管電壓(PMT)為800 V,電壓掃描范圍為-0.2～0.9 V,靈敏度為4檔。

1.5 電化學發(fā)光滴定

配制2.0×10-4mol/L羧甲基取代Benzo[3]uril與琥珀酰膽堿濃度比分別為1∶0,1∶0.25,1∶0.5,1∶0.75,1∶1.0,1∶1.25,1∶1.5,1∶1.75,1∶2.0的溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧甲基取代benzo[3]uril電化學發(fā)光性質(zhì)研究

羧甲基取代benzo[3]uril在中性和堿性介質(zhì)中具有優(yōu)異的水溶性,通過測試在不同pH值下的電化學發(fā)光性質(zhì),考察其在不同pH條件下的電化學發(fā)光行為,如圖1所示。

圖1 不同pH條件下羧甲基取代benzo[3]uril的電化學發(fā)光強度-時間曲線圖Fig.1 ECL intensities-time curves of carboxymethyl substituted benzo[3]uril at different pH

實驗發(fā)現(xiàn)pH值在7.0～12.0時,其電化學發(fā)光呈現(xiàn)不同的強度。當pH為7.0時,羧甲基benzo[3]uril的電化學發(fā)光幾乎不能被觀察到。羧甲基取代benzo[3]uril的陰極電化學發(fā)光強度隨著酸性的逐漸減弱呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。當pH=10.0時,開始觀察到在+753 mV時出現(xiàn)陽極發(fā)光。在pH=10.0～12.0時,隨著氫氧根離子濃度的增加,陽極發(fā)光增強并伴隨其陰極電化學發(fā)光的逐步減弱。因此,其電化學發(fā)光可以歸因于不同pH條件下溶液發(fā)生電化學反應產(chǎn)生的超氧自由基與大環(huán)化合物羧甲基benzo[3]uril形成激發(fā)態(tài)分子的弛豫現(xiàn)象,這類似于魯米諾在堿性溶液條件下的發(fā)光機理[13-14]?；趯嶒灲Y(jié)果的啟發(fā),我們設想在溶液中加入H2O2,通過電化學反應生成超氧自由基,增強羧甲基benzo[3]uril的電化學發(fā)光,從而建立一個H2O2增敏的高靈敏響應的電化學發(fā)光傳感器,并用于識別環(huán)境體系中低濃度的膽堿類物質(zhì)。H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril電化學發(fā)光傳感器檢測琥珀酰膽堿示意圖如圖2所示。

圖2 H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril電化學發(fā)光傳感器檢測琥珀酰膽堿示意圖Fig.2 Diagram of H2O2 sensitized carboxymethyl substituted benzo[3]uril electrochemiluminescence sensor for the detection of succinylcholine

2.2 H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril電化學傳感器條件優(yōu)化

考慮到電化學發(fā)光傳感器普遍應用在生物分析和免疫檢測領域,我們嘗試在pH=7.0的中性水溶液條件下構(gòu)建以羧甲基取代benzo[3]uril為主體的電化學發(fā)光傳感器,并通過加入H2O2來達到增強羧甲基取代benzo[3]uril電化學發(fā)光的目的。如圖3所示,未加入H2O2時,大環(huán)化合物的電化學發(fā)光很弱。隨著雙氧水的加入,羧甲基取代benzo[3]uril的電化學發(fā)光強度逐漸升高。在濃度為0.100 mol/L時,電化學發(fā)光強度達到峰值16 000,可能由于H2O2電化學反應提供了反應所需的超氧自由基。但是,隨著H2O2的加入(0.500或1.000 mol/L),發(fā)光強度下降,表明高濃度的超氧自由基發(fā)生自淬滅。因此,后續(xù)實驗采用0.100 mol/L H2O2進行增敏。

圖3 電化學發(fā)光傳感器在不同濃度H2O2下共反應的電化學發(fā)光強度-電壓曲線Fig.3 ECL intensity-voltage curves of the ECL sensor at different concentrations of H2O2 co-reaction

在上述優(yōu)化條件下,采用包含0.100 mol/L H2O2的羧甲基取代benzo[3]uril-H2O2電化學發(fā)光傳感器定量檢測pH=7.0溶液中琥珀酰膽堿的含量。我們通過測試不同琥珀酰膽堿濃度下的電化學發(fā)光性質(zhì),考察傳感器電化學發(fā)光行為。如圖4所示,羧甲基取代benzo[3]uril的電化學發(fā)光強度隨著琥珀酰膽堿濃度的增加而降低,這可能是benzo[3]uril和琥珀酰膽堿發(fā)生主客體作用形成穩(wěn)定的包結(jié)物,由此減少了羧甲基取代benzo[3]uril激發(fā)態(tài)產(chǎn)生的結(jié)果。在琥珀酰膽堿濃度為1.0×10-12～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi),羧甲基取代benzo[3]uril的電化學發(fā)光強度變化值與琥珀酰膽堿濃度的負對數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關系,得到相應的線性校正曲線:I=-354.12lgC-959.38,其中R2=0.993 7,如圖5所示。通過相應的計算得到該傳感器對琥珀酰膽堿實現(xiàn)超低檢測限為1.0×10-15mol/L (S/N=3 ),其靈敏度遠高于以往研究中采用的熒光光譜、紫外光譜和高效液相色譜檢測方法(表1),表明羧甲基取代benzo[3]uril電化學發(fā)光傳感器具有優(yōu)越的性能。

圖4 電化學發(fā)光傳感器與不同濃度琥珀酰膽堿的響應電化學發(fā)光強度-時間曲線Fig.4 ECL intensity-time curves of the ECL sensor in response to different concentrations of succinylcholine

圖5 電化學傳感器電化學發(fā)光強度與琥珀酰膽堿濃度的線性關系Fig.5 Linear relationship between the intensity of electrochemiluminescence and the concentration of succinylcholine

表1 不同檢測手段對琥珀酰膽堿檢出限比較Tab.1 Comparison of detection limits of succinylcholine by different detection methods

3 結(jié)論

基于羧甲基取代benzo[3]uril這種新型的水溶性電化學發(fā)光載體,初步考察了羧甲基取代benzo[3]uril的電化學發(fā)光機理,通過溶液中的超氧自由基促進電子轉(zhuǎn)移,進而生成羧甲基取代benzo[3]uril激發(fā)態(tài)分子,激發(fā)態(tài)分子躍遷至基態(tài)時產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。為提高超氧自由基濃度,引入共反應試劑H2O2,制備了一種基于H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril的電化學發(fā)光傳感器,并將其應用于琥珀酰膽堿的靈敏檢測,檢出限低至1.0×10-15mol/L?；诖嗽斫⒘艘粋€基于H2O2敏化羧甲基取代benzo[3]uril傳感器實現(xiàn)對琥珀酰膽堿的高靈敏高選擇性識別。將大環(huán)化合物羧甲基取代benzo[3]uril應用在電化學發(fā)光領域,提高電化學分子檢測的篩選性,對拓寬超分子化學研究領域具有重要意義。