張玉洲 余花 文涵泳

(寧夏回族自治區(qū)森林病蟲防治檢疫總站,銀川,750001) (寧夏大學)

席娜 楊艷 任宇航 周金秋 蔣朝陽 顧沛雯 于澤洋

(寧夏回族自治區(qū)農(nóng)村科技發(fā)展中心) (寧夏大學)

木霉菌(Trichodermaspp.)是一類兼具生物農(nóng)藥、生物肥料和土壤改良劑等應(yīng)用價值的生防真菌。木霉菌具有抗菌和抑菌的廣譜性,對植物的生長發(fā)育和抗病性具有促進作用[1],且可通過螯合或降解作用溶解金屬氧化物[2],而改良土壤的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)。近年來,隨著農(nóng)藥化肥大量施用帶來的水質(zhì)富營養(yǎng)化、土壤理化性質(zhì)惡化、土壤板結(jié)等問題的不斷加重,生物防治有效緩解了化學農(nóng)藥的副作用。木霉菌作為有效的生防真菌,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛,木霉菌的資源收集與儲備已經(jīng)引起世界很多國家的重視。目前,世界各國都已開展了對木霉菌菌種的收集工作,據(jù)統(tǒng)計,中國已分離木霉種類61種[3],菌株分離省份主要集中在我國南方地區(qū),東北地區(qū)相對較少[4-5]。黑龍江省位于中國最東北部,大部分區(qū)域處于中溫帶,四季分明,獨特的氣候條件影響木霉菌的抗寒性、抗病性和適應(yīng)性等,導致北方與南方的木霉菌的特性具有差異。因此對木霉菌進行分離鑒定及功能分析,篩選適應(yīng)黑龍江氣候的優(yōu)質(zhì)木霉菌株,為黑龍江地區(qū)的生物防治提供技術(shù)支持。

楊樹(PopulusL.)外形美觀,生長迅速,種植楊樹不僅對改善和綠化環(huán)境具有重要作用,而且具有經(jīng)濟效益、生態(tài)效益和社會效益。中國是世界上楊樹人工林面積最大的國家,楊樹的病蟲害問題是制約楊樹林各種效益充分發(fā)揮的關(guān)鍵因素[6]。據(jù)統(tǒng)計,楊樹的真菌病害多達300多種[7],但目前病害的防治多以化學防治為主,化學防治不僅污染環(huán)境,還容易導致病害產(chǎn)生抗藥性,因此發(fā)展生物防治對楊樹林的健康長期發(fā)展有著重要意義。本研究從黑楊(Populusnigra)根圍土壤分離生防木霉,并對木霉種類進行種類鑒定,了解黑楊根圍木霉的分布和生防特性,為林業(yè)病害生物防治提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集東北林業(yè)大學校園內(nèi)人工黑楊林根圍土壤土樣15份,密封于無菌塑料袋,帶回實驗室,置于冰箱內(nèi)-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌種分離

分別從每份土樣中稱取10 g,置于100 mL的無菌水中溶解,搖勻,采用稀釋平板法,依次稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4倍。用移液器分別吸取不同稀釋倍數(shù)的土壤懸浮液0.15 mL,用無菌涂布器均勻涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上,每個稀釋倍數(shù)涂布5皿,放置培養(yǎng)箱中28 ℃倒置培養(yǎng)3 d后,挑出木霉菌落,轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上,進行純化培養(yǎng)。

1.3 形態(tài)學及分子生物學鑒定

將分離純化的木霉菌,接種到PDA培養(yǎng)基平板上,溫度28 ℃暗培養(yǎng)144 h,觀察描述其形態(tài)和培養(yǎng)特征(包括生長速度、菌落形狀及色素的有無等);培養(yǎng)48～72 h時,挑取少量白色菌絲,用棉藍染液染色后,在顯微鏡下觀察并記錄木霉菌產(chǎn)孢區(qū)的分生孢子梗及分生孢子的形態(tài)特征(分生孢子的形狀、大小、長寬比及表面紋飾的有無等[2,8])。

形態(tài)學鑒定后,每種選取1株木霉進行后續(xù)的分子生物學鑒定。將木霉菌的分生孢子接種到PD液體培養(yǎng)基中,溫度25～28 ℃,轉(zhuǎn)速180 r/min,搖瓶培養(yǎng)48 h,無菌紗布過濾收集菌絲體。利用奧美嘉生物技術(shù)公司(Omega)DNA提取試劑盒提取木霉菌絲體DNA。根據(jù)White et al.[9]的方法,選用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’);再參照O’Donnell et al.[10]的方法,選用轉(zhuǎn)錄延長因子(tef1)引物EF1(5’-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3’)和EF2(5’-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3’)。分別以木霉菌基因組DNA為模板,擴增不同菌種的ITS、tef1-α序列。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)體系(50 μL):雙蒸水(ddH2O,25.5 μL)、緩沖液(10×Ex Buffer,5 μL)、tef1引物EF1(2.5 μL)、tef1引物EF2(2.5 μL)、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP,4 μL)、DNA聚合酶(Ex Taq,0.5 μL)、模板DNA(10 μL)。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)程序為:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,50 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s 35個循環(huán),72 ℃總延伸7 min。用普洛麥格(Promega)膠回收試盒回收純化獲得的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物,并送至上海生物工程有限公司進行序列測定。測序結(jié)果經(jīng)BioEdit等軟件分析和手工校正后,通過上海交通大學木霉菌菌種保藏管理中心(http://mmit.china-cctc.org/action1.php)[11]進行在線比對。

將木霉分離株的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)、轉(zhuǎn)錄增強因子(tef1-α)序列與美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)部分序列通過MEGA7.0軟件分別構(gòu)建進化樹,分析其親緣關(guān)系。構(gòu)建進化樹的方法為最大似然法(ML),設(shè)置3個水平、1 000次重復。

1.4 短密木霉T09生防特性

在花盆中移入組培山新楊幼苗,培養(yǎng)約15 d,挑選長勢相近的幼苗備用。將分離到的短密木霉(Trichodermabrevicompactum)T09培養(yǎng)至產(chǎn)孢,用無菌水沖洗制備孢子懸浮液(1 010個孢子/L),孢子懸浮液即配即用。將山新楊苗分為處理組和對照組:處理組山新楊,每株澆灌孢子懸浮液200 mL,噴施孢子懸浮液100 mL;對照組山新楊,每株澆水200 mL,噴施水100 mL;溫度28 ℃、光照16 h、黑暗8 h以及濕度50%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)30 d,兩組樹苗每隔5 d補澆自來水100 mL。隨后測定山新楊株高、莖粗,并取葉片測定葉綠素質(zhì)量分數(shù)[12]、可溶性糖質(zhì)量分數(shù)[13]、可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)[14],葉片中硝酸還原酶活性、過氧化氫酶活性和超氧化物歧化酶活性分別用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的硝酸還原酶活性檢測試劑盒BC0085、超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒BC0170和過氧化氫酶測定試劑盒BC0205測定,設(shè)置3個重復。處理組和對照組種植后的土樣留存?zhèn)溆谩?/p>

在花盆中裝土,花盆規(guī)格和土均與種植山新楊的相同,隨后將盛有土的花盆分為處理組和對照組,處理組花盆每盆澆灌孢子懸浮液200 mL,對照組花盆每盆澆灌水200 mL,在溫度28 ℃、光照16 h、黑暗8 h、空氣濕度50%的條件下放置30 d,每隔5 d補澆100 mL自來水。隨后取土,連同在種植后留存的土樣,測定土壤的速效氮和速效磷質(zhì)量分數(shù),測定方法參照《土壤學實驗》[15],設(shè)置3個重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌的分離與形態(tài)學初步鑒定

由圖1可知,從黑楊根圍土壤分離純化,獲得27株木霉菌,依據(jù)菌落顏色、產(chǎn)孢簇、輪紋有無、色素產(chǎn)生與否、分生孢子梗特征等形態(tài)學特點,結(jié)合《木霉分類與鑒定》[2]中的描述,初步將這27株木霉鑒定為5種:哈茨木霉(T.harzianum)(圖1a),棘孢木霉(T.asperellum)(圖1b),長枝木霉(T.longibrachiatum)(圖1c),擬康氏木霉(T.koningiopsis)(圖1d),短密木霉(T.brevicompactum)(圖1e)。

木霉菌培養(yǎng)48 h:短密木霉菌絲生長速度最慢,菌落半徑為19.5 mm;長枝木霉菌絲生長最快,菌落半徑為33 mm;棘孢木霉已經(jīng)從接種點開始產(chǎn)孢。

木霉菌培養(yǎng)72 h:哈茨木霉出現(xiàn)產(chǎn)孢簇,開始產(chǎn)孢;棘孢木霉產(chǎn)孢量繼續(xù)增加,呈同心輪紋;長枝木霉從接種點開始產(chǎn)孢;擬康氏木霉從菌落外緣開始產(chǎn)孢;短密木霉沒有產(chǎn)孢。

a.哈茨木莓(Trichodermaharzianum),b.棘孢木霉(Trichodermaasperellum),c.長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum),d.擬康氏木霉(Trichodermakoningiopsis),e.短密木霉(Trichodermabrevicompactum);A.48 h正面圖,B.72 h正面圖,C.96 h正面圖,D.144 h正面圖,E.產(chǎn)色素情況(背面圖),F.分生孢子梗,G.分生孢子。

圖1 5種木霉的形態(tài)學鑒定

木霉菌培養(yǎng)96 h:哈茨木霉、棘孢木霉、擬康氏木霉和短密木霉的菌落呈同心輪紋狀;哈茨木霉產(chǎn)孢量豐富,表面呈粉狀;棘孢木霉的同心輪紋由密集的分生孢子組成;長枝木霉的菌落呈粘狀,分生孢子堆呈黑綠色,有白色菌絲條紋產(chǎn)生;擬康氏木霉的分生孢子分布于氣生菌絲上,形成比較寬的分生孢子帶;短密木霉以產(chǎn)孢簇狀態(tài)形成同心輪紋,中心不育。

木霉菌培養(yǎng)144 h:哈茨木霉的孢子由淺綠色變至暗綠色,有分泌物產(chǎn)出,菌落背面乳黃色;棘孢木霉的孢子變?yōu)樯罹G色,有分泌物產(chǎn)出,沒有明顯氣味,菌落背面無色;長枝木霉不形成分生孢子簇,菌落背面暗黃色;擬康氏木霉的產(chǎn)孢簇呈絮狀,無明顯氣味,菌落背面淡黃色;短密木霉孢子變?yōu)榛揖G色,沒有明顯氣味,菌落背面無色。

5種木霉的顯微形態(tài)特征:哈茨木霉分生孢子梗第一級分支幾乎呈直角,向頂部彎曲,分生孢子倒卵形;棘孢木霉菌的分生孢子梗產(chǎn)生成對的側(cè)生分支,分生孢子球形;長枝木霉菌分生孢子叢生;擬康氏木霉菌分生孢子梗有主軸,分支依次對生,分枝與主軸呈銳角,分生孢子球形;短密木霉菌分生孢子梗分枝對生,分生孢子卵圓形。

2.2 分子生物學鑒定

將5種木霉的基因組DNA經(jīng)PCR擴增獲得ITS片段和tef1-α片段,其中長枝木霉的tef1-α片段未能成功擴增,將這些序列在上海交通大學木霉菌菌種保藏管理中心(http://mmit.china-cctc.org/action1.php)網(wǎng)站進行在線比對后,發(fā)現(xiàn)哈茨木霉(T21)、擬康氏木霉(T02)和短密木霉(T09)的比對結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果相吻合,而形態(tài)學鑒定為棘孢木霉(T18)的木霉在線比對結(jié)果顯示為類棘孢木霉(T.asperelloides),長枝木霉(T22)由于僅有ITS序列,無法準確比對。

由圖2、圖3可知,根據(jù)ITS序列構(gòu)建的進化樹和tef1-α序列構(gòu)建的進化樹結(jié)果相近,5種木霉分別為哈茨木霉、類棘孢木霉、擬康氏木霉、長枝木霉和短密木霉。同時發(fā)現(xiàn),棘孢木霉和類棘孢木霉的親緣關(guān)系非常近,有的甚至沒有遺傳距離的出現(xiàn)。

分支點上的數(shù)字表示基于1 000次Bootstrap重復的自舉值,括號中的序號表示GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號;方框標注本研究中鑒定的木霉。

結(jié)合形態(tài)學鑒定結(jié)果和比對結(jié)果,最終5種木霉被鑒定為哈茨木霉(T.harzianum)、類棘孢木霉(T.asperelloides)、長枝木霉(T.longibrachiatum)、擬康氏木霉(T.koningiopsis)和短密木霉(T.brevicompactum)。將這些序列提交于GenBank,獲得相應(yīng)的登錄號。

2.3 黑楊根圍木霉種類及數(shù)量

從黑楊根圍共獲得15份土樣中共獲得27株木霉,分離效率每個土樣1.8株。其中短密木霉(T.brevicompactum)17株,占分離總數(shù)的63%;哈茨木霉(T.harzianum)3株,占分離總數(shù)的11%;類棘孢木霉(T.asperellum)4株,占分離總數(shù)的15%;擬康氏木霉(T.koningiopsis)1株,占分離總數(shù)的4%;長枝木霉(T.longibrachiatum)2株,占分離總數(shù)的7%。

2.4 短密木霉T09對山新楊(Populus davidiana×P. alba var. pyramidalis)生理指標的的影響

由表1可知,短密木霉為所獲木霉當中的優(yōu)勢種,對短密木霉T09進行后續(xù)生防特性研究發(fā)現(xiàn),短密木霉T09對山新楊處理30 d后(處理組),莖粗達到3.73 mm,與對照(3.04 mm)相比差異極顯著(p<0.01);處理組的葉綠素質(zhì)量分數(shù)為4.48 mg·g-1,與對照(3.96 mg·g-1)相比差異極顯著(p<0.01);處理組的可溶性糖質(zhì)量分數(shù)為2.70 mg·g-1,與對照(2.10 mg·g-1)相比差異顯著(p<0.05);處理組可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)為0.56 mg·g-1,與對照組(0.44 mg·g-1)相比差異極顯著(p<0.01);處理組硝酸還原酶活性為2.95 nmol·g-1·min-1,顯著高于對照組(2.40 nmol·g-1·min-1)(p<0.05);處理組過氧化氫酶活性為3 425.84 nmol·g-1·min-1,與對照組(2 461.75 nmol·g-1·min-1)差異極顯著(p<0.01);處理組的超氧化物歧化酶活性為66.80 nmol·g-1·min-1,與對照組(58.80 nmol·g-1·min-1)相比差異顯著(p<0.05)。

分支點上的數(shù)字表示基于1 000次Bootstrap重復的自舉值,括號中的序號表示GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號;方框標注本研究中鑒定的木霉。

表1 山新楊(Populus davidiana×P. alba var. pyramidalis)生理指標

2.5 短密木霉T09對土壤養(yǎng)分的影響

由表2可知,T處理(短密木霉T09處理)的土壤速效氮質(zhì)量分數(shù)顯著高于對照組(CK,沒有種植山新楊也沒有經(jīng)過短密木霉T09處理的土壤)(p<0.05),表明短密木霉T09能夠增加土壤中的速效氮質(zhì)量分數(shù);P處理(只種植山新楊的土壤)土壤的速效氮質(zhì)量分數(shù)顯著低于對照組(p<0.05),表明植物生長會吸收土壤中的速效氮,導致土壤速效氮質(zhì)量分數(shù)減小;T+P處理(經(jīng)過短密木霉T09處理種植山新楊的土壤)的土壤速效氮質(zhì)量分數(shù)顯著低于P處理(p<0.05),短密木霉T09的存在有利于山新楊對土壤速效氮的吸收。

T處理的土壤速效磷質(zhì)量分數(shù)與對照組(CK)差異不顯著,表明短密木霉T09不能增加土壤的速效磷的質(zhì)量分數(shù)。同時,P處理的土壤中速效磷質(zhì)量分數(shù)要顯著低于對照組(p<0.05),山新楊生長吸收土壤速效磷導致速效磷含量減少。用短密木霉T09處理山新楊后土壤速效磷含量(表2,T+P組)與只種植山新楊的土壤(表2,P組)相比差異不顯著,表明短密木霉不能促進山新楊吸收更多的速效磷。

表2 不同處理的土壤養(yǎng)分質(zhì)量分數(shù)

3 結(jié)論與討論

從黑楊根圍土壤中分離獲得27株木霉菌,依據(jù)形態(tài)學初步鑒定為短密木霉、哈茨木霉、長枝木霉、擬康氏木霉和棘孢木霉5個種。傳統(tǒng)的真菌分類鑒定主要依據(jù)菌絲及孢子的生長特性和表型差異(如:菌落形態(tài)、生長速度、分生孢子梗的形態(tài)等),但是木霉菌株之間形態(tài)特征復雜多樣,缺乏穩(wěn)定性,相近種間鑒定易混淆,所以木霉菌種類鑒定比較困難。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,基于保守功能區(qū)(如ITS序列、翻譯延伸因子tef序列等)序列的分子鑒定已經(jīng)在木霉菌的分類和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究上的廣泛應(yīng)用[16]。Dou et al.[11]建立了木霉菌多樣性鑒定系統(tǒng),極大的方便了對木霉的鑒定。本研究應(yīng)用了分子鑒定技術(shù)來確保鑒定結(jié)果的準確性,短密木霉、哈茨木霉、長枝木霉、擬康氏木霉分子生物學鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致。但是棘孢木霉(T.asperellum)在分子生物學鑒定中為類棘孢木霉(T.asperelloides),通過文獻查閱,Samuels et al.[17]研究發(fā)現(xiàn)類棘孢木霉是棘孢木霉的姊妹種,形態(tài)極為相近,并表明這兩種無法在形態(tài)上區(qū)分,因此本研究以分子鑒定結(jié)果為準,認為形態(tài)學鑒定為棘孢木霉的分離株應(yīng)該為類棘孢木霉(T.asperelloides)。

Zhou et al.[4]分離了黑龍江省胡桃楸(Juglansmandshurica)、糖槭(Acersaccharum)和榆樹(Ulmuspumila)根圍木霉,發(fā)現(xiàn)深綠木霉(T.atroviride)為優(yōu)勢種。Yu et al.[18]分離了黃菠蘿(Phellodendronamurense)根圍土樣木霉,發(fā)現(xiàn)棘孢木霉(T.asperellum)和哈茨木霉(T.harzianum)為優(yōu)勢種。而在對黃菠蘿、紫丁香、水曲柳、香蕉根圍木霉的研究中,短密木霉均為數(shù)量最少的木霉種[4-5,18-19]。本研究分離到的27株木霉,短密木霉占63%,為黑楊根圍木霉的優(yōu)勢種。這些研究結(jié)果不同,表明不同植物根圍木霉種類和數(shù)量有差異,這與植物根部分泌的代謝物有關(guān),因此短密木霉更適應(yīng)黑楊的根圍環(huán)境,更加適用于黑楊乃至其他楊樹病害的生物防治。

短密木霉BF06能夠顯著促進黃瓜側(cè)根形成和黃瓜生長,給黃瓜接種短密木霉BF06后,對黃瓜枯萎病、莖基腐病、菌核病、根腐病和疫病的防效達60%以上[20]。深綠木霉MUCL45632能夠顯著增加番茄株高和根部干重[21]。非洲哈茨木霉(T.afroharzianum)處理丁香后,丁香過氧化氫酶活性顯著升高,H2O2質(zhì)量分數(shù)也顯著降低[5]。經(jīng)過哈茨木霉處理的南瓜,南瓜的過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性和多酚氧化酶活性顯著提升[22];經(jīng)哈茨木霉處理的番茄,顯著提升了番茄可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)和脯氨酸質(zhì)量分數(shù),使番茄對逆境的抗性增加[23]。因此木霉能夠使植物抗性相關(guān)指標升高,從而提升植物抗性。本研究中,短密木霉T09也具有類似的功能,經(jīng)過短密木霉T09處理的山新楊莖直徑顯著增大,山新楊葉片的葉綠素質(zhì)量分數(shù)、可溶性糖質(zhì)量分數(shù)和可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)顯著提高,硝酸還原酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性更強,因此短密木霉T09能夠使山新楊具有更好的長勢和更強的抗性,具有生防潛力。深綠木霉能促進植物吸收氮元素,并使植物根、莖重量增加[20];棘孢木霉能夠提升煙草對氮素的利用率[24];短密木霉可促進木質(zhì)素的降解,增加土壤養(yǎng)分[25]。短密木霉T09能夠提升土壤的速效氮質(zhì)量分數(shù),并促進植物對速效氮的吸收,從而保證植物更好的生長。但是短密木霉并不能增加土壤的速效磷質(zhì)量分數(shù),也不能促使植物對速效磷的吸收。

綜上所述,黑楊根圍木霉的優(yōu)勢種為短密木霉,短密木霉T09具有較強的生防能力,能夠成功誘導山新楊產(chǎn)生抗病性,同時也能提升土壤的速效氮質(zhì)量分數(shù)并促進植物吸收利用氮元素。