林彩星，陳 罡，楊振東，蔣偉哲，言柯柯，伍小薇，韋祝新

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是來源于鼻咽部被覆上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病具有明顯的地區(qū)聚集性，在我國以廣東、廣西、香港等為鼻咽癌高發(fā)地區(qū)[1]。據(jù)最新發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計報告，鼻咽癌2020 年新發(fā)病例約為13.3 萬，占全部新診斷腫瘤的0.7%，其中死亡病例約為8 萬（占0.8%）[2]。目前認(rèn)為，鼻咽癌的發(fā)生與遺傳易感性、EB 病毒感染、環(huán)境因素等相關(guān)[3]。隨著放療技術(shù)和綜合治療的不斷發(fā)展，Ⅰ期鼻咽癌5 年生存率可達(dá)95%以上，但是鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是患者治療失敗的主要原因。放療是鼻咽癌患者最主要的治療方式，但是對于一些晚期患者需行聯(lián)合治療方可提高治療療效。中藥治療配合放化療可減輕放化療所引起的副作用，但中藥對腫瘤的直接殺滅作用尚未得到充分驗證。漢黃芩素是傳統(tǒng)中草藥黃芩的有效成分之一，具有消炎、抗病毒、抗氧化、抗癌和神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[4-7]，且在多種腫瘤中顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤作用，如胰腺癌[8-10]、結(jié)腸癌[11]、乳腺癌[12]、胃癌[13]、肺癌[14]以及卵巢癌[15]等。有報道稱[16]，漢黃芩素可抑制鼻咽癌CNE2 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但其對鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲作用尚未明確?；诖?，本研究擬在2株鼻咽癌細(xì)胞株C666-1、HK-1 中研究漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的作用，進(jìn)一步了解漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞的影響，以期為開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人C666-1、HK-1 均來源于廣西醫(yī)科大學(xué)耳鼻喉實驗室。RPMI-1640、0.25%胰酶購于美國Gibco 公司，胎牛血清購于依科賽生物公司，CCK8試劑盒購于中國白鯊公司，Transwell 細(xì)胞小室購于康寧公司，Matrigel 基質(zhì)膠購于美國BD 公司，漢黃芩素購于成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞融合率達(dá)到85%～95%時使用胰酶進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。稱取20 mg 漢黃芩素粉末，漢黃芩素分子質(zhì)量為284.27，溶于0.70356 ml DMSO 溶液中配置成濃度為100 mmol/L 母液，置于-20 ℃中貯存，使用時再用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的漢黃芩素工作液。

1.3 CCK8 實驗測定漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞的抑制作用 取處于對數(shù)生長期的鼻咽癌細(xì)胞，胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，每孔100 μl 細(xì)胞懸液種植4000 個細(xì)胞于96 孔板中，每組設(shè)置5 個重復(fù)孔。在細(xì)胞周圍放入100 μl PBS 以防止揮發(fā)。在培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h 后，以換液的形式加入含有不同濃度藥液的培養(yǎng)基，分別設(shè)置5 個組：0、10、20、40、80 μmol/L。隨后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48 h 后取出細(xì)胞，使用PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞2 遍，隨后以換液的形式加入100 μl CCK8 工作液（CCK8試劑∶基礎(chǔ)培養(yǎng)基=1∶9）。再將細(xì)胞避光孵育于培養(yǎng)箱中1.5 h 左右，隨后使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的吸光度（OD 值）。細(xì)胞相對活性=[OD（加藥）-OD（空白）]/[OD（未加藥）-OD（空白）]×100%。實驗結(jié)果重復(fù)3 次，結(jié)果使用GraphPad Prism 8.0 軟件分析。

1.4 平板克隆實驗測定漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞獨(dú)立生存能力的影響 使用胰酶消化細(xì)胞，6 孔板每孔大約種植500 個細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，按照0、10、20、40 μmol/L 的濃度配置相應(yīng)濃度的漢黃芩素工作液，分別加入細(xì)胞中，48 h 后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每天于顯微鏡下觀察細(xì)胞集落形成情況，大約1 周后，可形成肉眼可見的細(xì)胞克隆隨后終止培養(yǎng)。使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定20 min，PBS 緩沖液清洗后用結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色，使用PBS 緩沖液清洗多余的染液，最后在顯微鏡下計算＞50 細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.5 細(xì)胞劃痕實驗測定漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的影響 用馬克筆在6 孔板每孔背面用直尺畫直線，每間隔約0.5 cm 畫上1 條直線，每孔畫5 條直線，以便于后期拍照。用胰酶消化細(xì)胞，6 孔板每孔大約種植50 萬個細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞鋪滿6 孔板底部時，將直尺垂直于畫的直線放在6 孔板上，用1000 μl 的槍頭緊貼直尺邊緣，在每個孔的底部劃出3 條劃痕。制好劃痕后用PBS 清洗每孔5 次，并加入含有不同濃度漢黃芩素的無血清培養(yǎng)基，分別在0、24 h 用倒置顯微鏡在相同的位置點(diǎn)觀察拍照，記錄劃痕愈合的距離。用Image J 軟件測量計算各組細(xì)胞在不同時間點(diǎn)向劃痕愈合的相對面積。

1.6 Transwell 遷移實驗測定漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的影響 用胰酶消化細(xì)胞并用不同濃度藥物溶液制備單細(xì)胞懸液。Transwell 小室的下室中加入400 μl 含20%血清的完全培養(yǎng)基，在上室中加入200 μl 細(xì)胞懸液，每個小室內(nèi)含有10×104個細(xì)胞。將細(xì)胞放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后用PBS 緩沖液清洗Transwell 小室3 次。用400 μl 4%多聚甲醛固定小室20 min 后用PBS 緩沖液清洗Transwell 小室3 次，然后用結(jié)晶紫染液染色20 min。染色后用PBS 緩沖液清洗每個小室3 次，隨后用醫(yī)用棉簽將上室未穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞擦去，注意手法要輕柔，并在室溫下晾干小室。倒置顯微鏡下對Transwell 小室進(jìn)行拍照，用Image J 軟件計數(shù)各組細(xì)胞穿過小室的數(shù)量。

1.7 Transwell 侵襲實驗測定漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞侵襲能力的影響 使用RPMI-1640 培養(yǎng)基將基質(zhì)膠按1∶8 的比例在冰上稀釋。然后將100 μl 稀釋后的基質(zhì)膠放入Transwell 上室，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜，直至基質(zhì)膠凝固。下室放入400 μl 含10%血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，上室放入200 μl 含10 萬個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱中孵育36 h。隨后的細(xì)胞染色和固定步驟與Transwell 遷移實驗相同。穿膜細(xì)胞數(shù)代表各組細(xì)胞的侵襲能力。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用GraghPad Prism 8.0 進(jìn)行繪圖分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗或F檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞活性的影響 漢黃芩素對C666-1 和HK-1 細(xì)胞的活力均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，隨藥物濃度增加，抑制效果明顯增強(qiáng)；同一藥物濃度下，藥物作用48 h 的抑制效果高于24 h，抑制效果表現(xiàn)為劑量時間依賴性（圖1）。通過GraphPad Prism 8.0 軟件計算不同時間的IC50，結(jié)果顯示漢黃芩素作用于C666-1 細(xì)胞24 h 的IC50值為37.15 μmol/L、48 h 為20.75μmol/L；漢黃芩素作用于HK-1 細(xì)胞24 h 的IC50值為29.09 μmol/L、48 h為20.46 μmol/L。

圖1 漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞的抑制作用

2.2 漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響 漢黃芩素干預(yù)后，鼻咽癌細(xì)胞C666-1 細(xì)胞形成肉眼可見集落的數(shù)目更少，體積更小，見圖2。

圖2 漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞遷移的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，漢黃芩素處理后，C666-1 及HK-1 細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制，且藥物濃度越高，抑制作用越強(qiáng)（圖3）。0、10、20、40 μmol/L 的漢黃芩素處理C666-1 及HK-1 細(xì)胞干預(yù)24 h 后細(xì)胞遷移面積的相對比率比較 [HK-1：（67.72±2.43）%、（45.87±2.00）%、（38.48±2.66）%、（25.98±1.23）%；C666-1：（73.07±2.30）%、（58.52±7.76）%、（43.98±2.10）%、（36.08±6.30）%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與劃痕實驗結(jié)果相一致，Transwell 細(xì)胞遷移實驗也表明，不同濃度漢黃芩素處理C666-1 及HK-1 細(xì)胞后，從上室遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目明顯降低，藥物濃度越高，抑制作用越明顯（圖4）。

圖3 劃痕實驗檢測漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞細(xì)胞劃痕的影響

圖4 Transwell 細(xì)胞遷移實驗檢測漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的影響

2.4 漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞侵襲的影響 漢黃芩素干預(yù)后，穿過基質(zhì)膠后遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，見圖5。

圖5 Transwell 侵襲實驗檢測漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

盡管化療和靶向藥物的應(yīng)用以及放療技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，使得鼻咽癌患者的5 年總體生存率有了很大的提高，其中Ⅰ期鼻咽癌患者5 年生存率可達(dá)95%，Ⅱ期達(dá)85%，然而對于就診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者來說，預(yù)后仍然較差，Ⅳ期鼻咽癌患者5 年生存率僅有50%。目前對于局部晚期鼻咽癌患者，在放療基礎(chǔ)上聯(lián)合化療是其主要的治療模式，然而化療所導(dǎo)致的耐藥或者患者不能耐受化療是化療失敗的主要原因，從而導(dǎo)致了腫瘤的進(jìn)展。因此，迫切需要研發(fā)有效且毒副作用小的抗腫瘤藥物。

漢黃芩素是來源于中草藥植物中的一種純天然化合物，因其所具備的多種藥理作用而廣泛地在多種炎癥性和腫瘤性疾病中進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素通過IRF3 介導(dǎo)的Hippo 信號通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的致癌行為和EMT 過程[11]；通過抑制MMP1 表達(dá)和調(diào)控PI3K/AKT 信號通路，從而抑制肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移潛能并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]；通過調(diào)控miRNA-135b-3p 靶向SIX4 抑制A549 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和EMT 過程[6]。除此之外，漢黃芩素還能通過阻滯腫瘤細(xì)胞的周期，從而發(fā)揮抑癌作用[16，17]，使細(xì)胞周期阻滯于G1/G0期[18]或G2/M 期[19]。漢黃芩素還能通過增加惡性腫瘤的放化療敏感性進(jìn)一步增強(qiáng)其本身的抗腫瘤作用[15，20]。本研究通過CCK8 實驗證明漢黃芩素能夠有效抑制鼻咽癌細(xì)胞C666-1 和HK-1 的活性，并根據(jù)實驗結(jié)果估算出藥物的IC50，進(jìn)而初步明確后續(xù)實驗研究的藥物濃度。細(xì)胞活性降低是細(xì)胞增殖受到抑制的重要原因之一，因此為進(jìn)一步明確漢黃芩素對鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響，通過平板克隆形成實驗來評估鼻咽癌細(xì)胞的增殖和生存能力，結(jié)果表明漢黃芩素能有效抑制C666-1 細(xì)胞的增殖和生存能力，與陳琳等[21]研究結(jié)果一致。鼻咽癌細(xì)胞的遷移以及侵襲能力的異常升高是鼻咽癌侵襲性強(qiáng)及易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因，也是導(dǎo)致鼻咽癌患者預(yù)后變差的重要因素。本研究通過劃痕實驗以及Transwell 實驗發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，漢黃芩素能抑制鼻咽癌細(xì)胞HK-1、C666-1 的活性、增殖、遷移還有侵襲能力，后續(xù)將進(jìn)一步探究其在鼻咽癌細(xì)胞中的分子機(jī)制。