楊 睿，程 序，趙夢竹，國倩倩，張馨月，劉夢華，魏 瓊，張冬梅

（北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院/中醫(yī)內(nèi)科學教育部和北京市重點實驗室，北京 100700）

急性心肌梗死后治療性血管新生是在原有的脈管系統(tǒng)基礎上，通過刺激新生血管網(wǎng)的生成來提高心肌側支循環(huán)的代償能力，從而改善心肌缺血癥狀。血管生成受多種因素的調(diào)控，其中微小RNA（microRNA，miRNA）是關鍵調(diào)控因子。miRNAs是一簇長度為21～23 個核苷酸的小非編碼RNA，主要在轉錄后水平調(diào)控基因表達。越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)，miRNA 可調(diào)節(jié)血管生成相關因子的表達，調(diào)控內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成［1］。而在眾多的miRNAs 中，miR-484 可能是血管生成的創(chuàng)新基因治療候選者，miR-484 可以協(xié)同調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-B 和VEGF-R2（KDR）的表達［2］。VEGF 家族主要包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、VEGFF 和胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）7 個亞型［3］，其中VEGFA 是最主要的血管調(diào)控因子，也是在血管生成中最活躍的異構體［4］?；钛鏆夥绞轻槍θ毖孕呐K病尤其是冠心病氣虛血瘀病機而構建的臨床經(jīng)驗方，前期研究表明，活血益氣方可以通過直接誘導缺血心肌局部VEGF 及其mRNA 的表達［5］，促進梗塞邊緣區(qū)血管新生或下調(diào)VEGFA mRNA 的負向調(diào)控因子miR-126 或Spred1 的表達，間接上調(diào)VEGF 及其mRNA 的表達，促進血管新生［6，7］。為明確miR-484對血管新生的調(diào)控作用并進一步探索活血益氣方促血管新生的作用機制，本研究在建立miR-484 過表達人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）模型的基礎上給予活血益氣方進行干預，探索miR-484 對HUVEC 增殖、成管和VEGFA mRNA 表達的影響及活血益氣方的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞

人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）（Cat.#：DFSC-EC-01）購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 藥物與主要試劑

ECM 培養(yǎng)基（上海中喬新舟生物有限公司，Cat.#：1001）；牛源纖維黏連蛋白（Sciencell，Cat.#：O113）；miR-484 mimics 和mimics negative control（mimics NC）由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；HiPerFect Transfection Reagent（Qiagen 公司，Cat.#：301705）；磷酸鹽緩沖液（DPBS，Solarbio 科技有限公司，Cat.#：D1040-500）；胰酶/EDTA 消化液（ScienCell，Cat.#：0103）；Matrigel 基底膠（Solarbio科技有限公司，Cat.#：M8371）；CCK-8 試劑盒（日本同仁化學研究所，Cat.#：CK04-1）；FastKing RT Kit（With gDNase）（Cat.#：KR116）、SuperReal Pre-Mix Plus（SYBR Green）（Cat.#：FP205）、miRcute miRNA Isolation Kit（Cat.#：DP501）、miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit（Cat.#：KR211-02）、miRcute Plus miRNA qPCR Kit（Cat.#：FP411-02）購自TIANGEN 公司；活血益氣方（黃芪60 g，黨參60 g，丹參10 g，川芎10 g，赤芍10 g，紅花10 g），所有藥物由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院提供飲片，水煎，過濾，濃縮，水分控制在3%以內(nèi)。濃縮液-40℃過夜，待藥液完全凝結后置于冷凍干燥機中1 d，通過低溫升華去除水分，收集活血益氣方中藥凍干粉制劑使用。

1.3 構建miR-484 過表達HUVEC 細胞模型

收集對數(shù)生長期HUVEC 制成5×104cells/mL細胞懸液，按100 μL/孔均勻接種于提前用牛源纖維黏連蛋白2 μg/cm2包被好的96 孔板中，培養(yǎng)箱中孵育24 h 使細胞貼壁。將miR-484 mimics/mimics NC 干粉離心后加入DEPC 水配置成20 μmol/L 的工作液；將2 μL miR-484 mimics/mimics NC 工作液加入到50 μL 不添加胎牛血清、生長因子及雙抗的基礎ECM 培養(yǎng)基中，混勻，再加入0.75 μL HiPer-Fect Transfection Reagent，混勻，室溫孵育5～10 min，形成轉染混合物。吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入150 μL 基礎ECM 培養(yǎng)基，再加入轉染混合物，培養(yǎng)箱轉染6 h 后換添加胎牛血清、生長因子及雙抗的完全ECM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，建立miR-484 過表達細胞模型（miR-484 mimics 組）及其陰性對照（Mimics NC 組）。通過實時熒光定量PCR 方法檢測HUVEC 中miR-484 表達情況以評價模型是否構建成功。

1.4 分組及給藥

建立miR-484 過表達HUVEC 模型后，將細胞分為對照組（Mimics NC 組）、模型組（miR-484 mimics 組）和藥物組（miR-484 mimics+活血益氣方凍干粉溶液組），藥物組加入含2 mg/mL 活血益氣方凍干粉的ECM 培養(yǎng)基，對照組和模型組加入等量ECM 培養(yǎng)基。

1.5 CCK-8 法檢測缺氧HUVEC 增殖情況

將細胞按5×104個/孔均勻接種于96 孔板中，按1.4 所述方法造模及干預后，吸棄上清，按CCK-8溶液∶基礎ECM 培養(yǎng)基=1∶10 的比例混勻后以110 μL/孔加入細胞中，培養(yǎng)箱中孵育3 h，多功能微孔板檢測儀測定450 nm 波長處各組的吸光度值（OD 值）。

1.6 細胞劃痕實驗檢測缺氧HUVEC 遷移的情況

將細胞按5×104cells/mL 均勻接種于包被好的6 孔板（在6 孔板底部劃標記線，使得每孔有3 條平行線穿過），每孔加入2.5 mL 細胞懸液。按照1.4 所述方法造模及分組。待細胞融合成片，無較大細胞空隙時，用200 μL 槍頭垂直于標記線在底部劃線。吸棄培養(yǎng)基，DPBS 沖洗去除劃下和凋亡的細胞后，換用基礎ECM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)0 h、X h 分別于倒置顯微鏡下拍照，每次拍照位置以提前劃好的標記線作為定位點，保證同一位置進行對比。使用Image J 軟件對兩次照片之間劃痕面積進行統(tǒng)計分析。遷移率（%）計算如下：遷移率（%）=（A0-AX）/A0×100%，其中A0 表示初始傷口面積（t=0 h），AX 表示測量時的殘留面積點（t=X h）

1.7 Matrigel 基質膠實驗檢測缺氧HUVEC 管狀形成能力的情況

將Matrigel 基質膠按50 μL/孔平鋪于提前預冷的96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)箱中孵育30 min 使其凝固。按照1.4 所述方法造模及分組。胰酶消化后收集各組細胞懸液，離心后加入基礎ECM 培養(yǎng)基重懸，按2×105cells/mL 將細胞接種于含凝固Matrigel 基質膠的96 孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)箱中孵育6 h 后，倒置顯微鏡下觀察各組HUVEC 成管情況，并拍照記錄。使用Image J 軟件對成管情況進行統(tǒng)計分析。

1.8 實時熒光定量PCR 檢測VEGFA mRNA 的表達

取2 μg 提取的總RNA，根據(jù)反轉錄試劑盒說明書操作：5×Buffer 2 μL、RNase-freewater，配置10 μL gDNA 去除反應體系混合液，在42 ℃反應3 min；RT-Mix 1 μL、10×Buffer 2 μL、FQ-RT Primer Mix 2 μL、RNase-freewater 5 μL 配置反轉錄反應體系混合液，42 ℃ 15 min、95 ℃ 3 min 條件下進行反轉錄，得到cDNA 鏈。以cDNA 為模板進行PCR 反應，按熒光定量試劑盒說明書操作：2×Pre Mix 10 μL、10 nmol/L 上下游引物各0.6 μL、cDNA 2 μL、RNase-free water 6.4 μL、50×Dye 0.4 μL，配置20 μL 的反應體系，放入PCR 儀，95 ℃ 15 min 激活FastStart DNA Taq 聚合酶后，95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，40 個循環(huán)，進行實時熒光定量PCR，接著檢測PCR溶解曲線。以GAPDH 作為內(nèi)參照。用NCBI PrimeR-BLAST 設計引物，由生工生物有限公司合成，引物序列（5'-3'）：VEGFA，上游：CTGTCTTGGGTGCATTGGAG，下游：ACCAGGGTCTCGATTGGATG；GAPDH，上游：GGGTGTGAACCATGAGAAGT，下 游 ：GACTGTGGTCATGAGTCCT。每個樣品設立3 個復孔，取均值，所得CT 值按照2-△△ct的方法，進行均一化處理后再進行統(tǒng)計學分析。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，服從正態(tài)分布兩組比較用獨立樣本t檢驗，多組比較方差齊時用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差不齊時用Welch 檢驗，方差齊時組間比較用LSD 檢驗，方差不齊時組間比較采用Dunnett's T3 檢驗；不服從正態(tài)分布者用非參檢驗，均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR 評價miR-484 過表達HUVEC 細胞模型

如表1 所示，與Mimics NC 組相比，miR-484 mimics 組miR-484 表達顯著升高（P＜0.01）。miR-484 過表達HUVEC 細胞模型構建成功。見表1。

表1 各組HUVEC 中miR-484 表達情況（n=3，±s）Tab 1 miR-484 expression in HUVEC of each group（n=3，±s）

表1 各組HUVEC 中miR-484 表達情況（n=3，±s）Tab 1 miR-484 expression in HUVEC of each group（n=3，±s）

注：與Mimics NC 組相比，*P＜0.01；。

miR-484 相對表達量1.003±0.092 140.341±20.068*12.026 0.007組別Mimics NC 組miR-484 mimics 組tP

2.2 各組HUVEC 增殖情況

與對照組（Mimics NC 組）相比，模型組（miR-484 mimics 組）HUVEC 增殖下降（P＜0.01）；與模型組相比，藥物組（miR-484 mimics+活血益氣方凍干粉溶液組）HUVEC 增殖上調(diào)（P＜0.01）。見表2。

表2 各組HUVEC 增殖情況（n=8，±s）Tab 2 HUVEC proliferation in each group（n=8，±s）

表2 各組HUVEC 增殖情況（n=8，±s）Tab 2 HUVEC proliferation in each group（n=8，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.01；與模型組相比，**P＜0.01。

OD 值0.534±0.039 0.485±0.011*0.561±0.042**10.356 0.001組別對照組模型組藥物組FP

2.3 各組HUVEC 遷移情況

與對照組相比，模型組HUVEC 遷移面積下降（P＜0.05）；與模型組相比，藥物組HUVEC 遷移面積增加（P＜0.05）。與對照組相比，模型組HUVEC遷移率有下降的趨勢；與模型組相比，藥物組HUVEC 遷移率有下調(diào)的趨勢，但差異均不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）見表3、圖1。

圖1 各組HUVEC 遷移情況（50×）Fig 1 HUVEC migration in each group （50×）

表3 各組HUVEC 遷移情況（n=3，±s）Tab 3 HUVEC migration in each group（n=3，±s）

表3 各組HUVEC 遷移情況（n=3，±s）Tab 3 HUVEC migration in each group（n=3，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.01；與模型組相比，**P＜0.01。

組別細胞遷移面積（μm2）細胞遷移率（%）對照組模型組藥物組FP 15 713 666.85±810 625.50 10 806 475.68±866 937.12*15 472 260.32±3 839 918.07**4.265 0.010 37.9±2.3 28.81±7.5 27.0±6.4 3.000 0.125

2.4 各組HUVEC 成管情況

與對照組相比，模型組HUVEC 參與成管的長度、分支數(shù)、節(jié)點數(shù)減少，成管能力顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，藥物組HUVEC 參與成管的長度、分支數(shù)、節(jié)點數(shù)增多，成管能力顯著提升（P＜0.05）。見表4、圖2。

圖2 各組HUVEC 成管情況（100×）Fig 2 Formation of HUVEC tubes in each group （100×）

表4 各組HUVEC 成管情況（n=4，±s）Tab 4 HUVEC tube formation in each group（n=4，±s）

表4 各組HUVEC 成管情況（n=4，±s）Tab 4 HUVEC tube formation in each group（n=4，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.01；與模型組相比，**P＜0.01。

Nodes（個）5 829.000±606.671 855.753±75.571*4 710.500±718.509**91.781 0.000組別對照組模型組藥物組FP Branching length（μm）384 021.230±43 246.070 84 264.700±6 782.770*320 800.610±38 718.220**87.722 0.000 Branches（個）513.000±71.754 231.753±17.727*548.000±43.259**49.178 0.000

2.5 各組中VEGFA mRNA 表達情況

與對照組相比，模型組VEGFA mRNA 表達水平下調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，藥物組VEGFA mRNA 表達水平上調(diào)（P＜0.01）。見表5。

表5 各組中VEGFA mRNA 表達情況（n=3，±s）Tab 5 VEGFA mRNA expression in each group（n=3，±s）

表5 各組中VEGFA mRNA 表達情況（n=3，±s）Tab 5 VEGFA mRNA expression in each group（n=3，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.01；與模型組相比，**P＜0.01。

VEGFA mRNA 1.016±0.336 0.522±0.120*1.327±0.268**11.247 0.009組別對照組模型組藥物組FP

3 討論

急性心肌梗死屬于祖國醫(yī)學“胸痹”、“真心痛”等范疇，由于脈絡的突然痹阻，血液不得濡養(yǎng)心肌，不通、不榮皆可導致胸痛。故而在心肌梗死初期，血瘀為主要損傷，血液不能循常道濡養(yǎng)四周，日久則心失所養(yǎng)而致心氣虛，心氣不足則行血之力愈弱，血流緩慢而易淤堵成瘀，如此循環(huán)往復而成氣虛血瘀之本虛標實之證。《血證論》中言，“凡血者必先以去瘀為要”，瘀血不去，新血不生，“祛瘀”是“生新”的前提基礎，而“生新”則既包括了生成新的血液，又包括了生成新的血管［8］；萬物生長皆賴氣的充足，氣虛不補，則無力生發(fā)，又氣為血之帥，氣旺則血暢，血為氣之母，血足則氣才得以充足，血不足則生發(fā)無源，氣血互根，相輔相成。許多學者認為“心氣虛證”與心肌能量代謝障礙有關，補氣可以提高能量代謝，加快瘀血的祛除以及新血的生成［9，10］。可見益氣活血法在心肌梗死后血管新生階段發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)代研究證實，益氣、活血類中藥能夠直接作用于內(nèi)皮細胞，通過促進增殖、抑制凋亡或上調(diào)VEGF 表達等途徑來顯著地促進血管的生成?；钛鏆夥郊a中益氣之黃芪［11］、黨參，活血祛瘀之丹參［12，13］、赤芍、紅花、川芎［14］于一方之中，可以益氣活血，化瘀生新。在課題組前期的研究結果中發(fā)現(xiàn)，活血益氣方可以通過多靶點多途徑的方式作用于血管新生的各個相關環(huán)節(jié)，促進缺氧后內(nèi)皮細胞增殖、遷移、成管等，達到促進血管新生的作用，并且2 mg/mL 活血益氣方凍干粉溶液使細胞活力明顯上調(diào)。

研究顯示，miRNAs 可以直接靶向促血管新生因子或其上游因子，如miR-195［15］、miR-150［16］可以直接與VEGF mRNA 的3‘UTR 結合，抑制其表達，從而抑制血管生成；也可以通過靶向VEGF 下游而負調(diào)控VEGF 信號通路，如miR-23、miR-132、miR-221 促進血管生成［17］。由于miRNA 的作用方式是多靶點、多途徑的，可能同時靶向多個mRNA，部分miRNA 對血管新生的調(diào)控可有兩種趨勢，如內(nèi)皮細胞特異性表達的miR-126 既可以抑制VEGF表達從而抑制血管性新生［18］，又可以靶向VEGF 的負性調(diào)控因子的表達，對血管新生過程起協(xié)同作用［19］。以往的研究發(fā)現(xiàn)，miR-484 在缺血性心臟病及腫瘤疾病患者/實驗模型中存在顯著地差異性表達，其差異表達可能會影響到血管的生成［20，21］。Li等［22］研究證實miR-484 可以抑制胃癌組織的血管新生，而在另一項研究中miR-484 可能與抗血管新生藥物有協(xié)同作用［23］。本研究中繼續(xù)以2 mg/mL 活血益氣方凍干粉溶液干預miR-484 過表達HUVEC細胞模型。結果發(fā)現(xiàn)，活血益氣方可以減輕過表達miR-484 后對內(nèi)皮細胞增殖、遷移和成管能力的抑制作用，表明活血益氣方對miR-484 靶向VEGFA抑制血管新生的過程有一定的負向調(diào)控作用，并可以改善miR-484 對VEGFA mRNA 表達的抑制作用，進而促進VEGFA 的表達，促進血管新生。

VEGFA 主要通過與三種酪氨酸激酶受體（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3）和兩種非酪氨酸酶激酶的跨膜受體（NP-1、NP-2）結合來傳遞信號。VEGFR2（Flk-1/KDR）是促血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和有絲分裂過程主要的VEGF 信號轉導受體［24］，可通過下游PLCγ/Ca2+、MAPK 信號通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的增殖，通過Src、FAK 信號通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的遷移，通過PI3K/Akt 信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的存活。MiR-484 靶向VEGFA 抑制血管新生或許與這些信號通路有關［25］。

綜上所述，活血益氣方可促進HUVEC 增殖、遷移和成管，其機制可能與減輕miR-484 對HUVEC增殖、遷移、成管和VEGFA mRNA 表達的抑制作用有關，這可能是活血益氣方促進血管新生的作用機制之一。然而活血益氣方是否直接抑制miR-484尚不十分清楚。本課題組將在在今后的實驗中進一步驗證活血益氣方通過miR-484 調(diào)控心肌梗死后血管新生的分子機制。

作者貢獻度說明：

張冬梅：負責實驗設計，實驗指導及文章審校；趙夢竹，國倩倩：對實驗提供技術指導；楊睿，程序，張馨月，劉夢華，魏瓊負責實驗實施、指標檢測、數(shù)據(jù)分析；楊睿、程序：執(zhí)筆撰寫文章。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。