許 蘭，黃笠紋，肖亦舒，劉春亞，杜 樂(lè)，任立成

（海南醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，海南 海口，571199）

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的主要調(diào)節(jié)器。mTOR 通路和自噬之間的功能關(guān)系涉及復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，自噬反應(yīng)由ULK 復(fù)合體啟動(dòng)。ULK1 通常與ATG13、FIP200 和ATG101 結(jié)合形成復(fù)合物參與自噬前體形成的啟動(dòng)過(guò)程。一方面，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可以激活ULK/AGT1 復(fù)合物直接激活細(xì)胞自噬。另一方面，AMPK 也可以通過(guò)磷酸化Raptor 間接激活細(xì)胞自噬，從而抑制mTOR 的活性。同時(shí)，由空泡分選蛋白34、Beclin1、Vps15 和ATG14組成的磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）復(fù)合體也可以被ULK 募集，使磷脂酰肌醇磷酸化，形成磷脂酰肌醇三磷酸，在自噬過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1-3］。

mTOR 是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵分子，參與了生物過(guò)程各個(gè)方面的調(diào)控，包括細(xì)胞的生存、死亡、增殖、分化和衰老。近年來(lái)，大量證據(jù)表明自噬的失調(diào)與致癌有關(guān)。自噬在癌癥治療中起著雙重作用，它既可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活［4，5］。

據(jù)報(bào)道，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，PI3K-Akt-mTOR 信號(hào)通路在大約50%～80%的急性髓性白血病（AML）和約87.5%的 T 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）患者中異常激活［6］。雷帕霉素作為mTOR 的有效抑制劑，可以減緩癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。促進(jìn)ALL 細(xì)胞的自噬。越來(lái)越多的臨床數(shù)據(jù)表明，雷帕霉素及其衍生物成為潛在的抗癌藥物。將自噬抑制策略與當(dāng)前的細(xì)胞毒性化療方案相結(jié)合，可以為白血病患者提供新的治療機(jī)會(huì)［7-9］。本研究以人急性白血病CD4+T-Jurkat 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，探究不同濃度雷帕霉素作用下，mTOR 信號(hào)通路中部分自噬基因表達(dá)水平變化，為治療相關(guān)疾病的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人類急性T 淋巴細(xì)胞白血?。↗urkat）細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢）；雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）購(gòu)自Macklin 公司；MTT 購(gòu)自Biosharp 生物科技公司；總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Fasting RT Kit、DNA 純化試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司；TB Green?Premix Dimer Eraser?（RR091A）購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；ATG16L2 抗體、ATG13 抗體、ULK1 抗體、PI3K3R1 抗體、MAPK1 抗體、Raptor 抗體、

GAPDH 抗體均購(gòu)自博士德生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海翊圣生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Jurkat 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)處在指數(shù)期的細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，用終濃度為10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L 的RAPA 處理細(xì)胞48 h，即可收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 將處在指數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔加入100 μL（1×106個(gè)細(xì)胞）細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行鋪板，分別加入不同終濃度的RAPA，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。到時(shí)間點(diǎn)后，每孔加入10 μL MTT 溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。水平離心吸掉上清后，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），置于搖床上低速振蕩10 min。于酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)其光密度（OD）值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=（對(duì)照組OD 值-實(shí)驗(yàn)組OD 值）/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期將指數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于6 孔板中，用不同濃度的RAPA 處理，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集1×106個(gè)細(xì)胞。預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，低速離心后，棄上清。取一部分用100 μL 1xBinding Buffer 重懸細(xì)胞沉淀，依次加入5 μL Annexin V-FITC 染料和10 μL PI 染料，輕輕混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，再補(bǔ)加400 uL 1×Binding buffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。另一部分用70%預(yù)冷的無(wú)水乙醇重懸，4 ℃靜置過(guò)夜。預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，加入500 μL 染色緩沖液重懸，再加入10 μL RNaseA 和10 μL PI 染料輕輕混勻后，室溫避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.2.4 吖啶橙熒光染色檢測(cè)細(xì)胞自噬 Jurkat 細(xì)胞用不同濃度RAPA 處理48 h 后，各取300 μL 細(xì)胞懸液加入3 μL 吖啶橙染液，室溫固定15 min，PBS 洗滌3 次。移至熒光顯微鏡下，選用藍(lán)色激發(fā)濾片進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察。

1.2.5 RT-qPCR 及Western Blot 分析 收集不同藥物濃度處理的細(xì)胞懸液，按照細(xì)胞總RNA 提取試劑盒的說(shuō)明提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT公式計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量，不同處理組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。引物序列由Primer 3 在線設(shè)計(jì)，如表1 所示。相關(guān)蛋白表達(dá)水平通過(guò)Western Blot 分析，各組細(xì)胞加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，提取總蛋白并用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白質(zhì)變性處理后，樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，于搖床上封閉1 h，一抗4 °C 過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，ECL 發(fā)光試劑盒顯影，Image J 軟件分析條帶灰度值。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer information for RT-qPCR

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 收集0 nmol/L～50 nmol/L RAPA 處理48 h 后的細(xì)胞懸液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，提取細(xì)胞總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA 的完整性，分光光度計(jì)測(cè)其RNA 純度，樣品檢測(cè)合格后，送至諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序及分析。

1.2.7 甲醛輔助分離調(diào)控元件（FAIRE）分析FAIRE 樣品制備方法參考Simon 等［10，11］報(bào)道的方法。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入甲醛溶液，使其終濃度為1%，室溫下交聯(lián)固定10 min，加入終濃度為0.125 M 的甘氨酸，室溫振蕩5 min，淬滅甲醛。PBS 洗滌3 次，加入5 mL NP-40 細(xì)胞裂解液，在冰上裂解1.5 h，離心收集交聯(lián)的細(xì)胞核，每管約含107個(gè)細(xì)胞。對(duì)樣品進(jìn)行超聲波打短處理，將其剪切到200～300 bp的平均大小。取上述樣品的10%作為Input 分析。剩余樣品4 ℃離心，去除細(xì)胞碎片后，通過(guò)酚氯仿抽提純化DNA，即可獲得FAIRE 樣品。qPCR 實(shí)驗(yàn)分析FAIRE 樣品中的DNA 富集效率。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30s，95 ℃ 5s，60 ℃ 25s，72 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)。定量PCR 引物序列如表2 所示。

表2 FAIRE 引物序列Tab 2 Primer sequences for FAIRE

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)比較，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAPA 抑制Jurkat 細(xì)胞的生長(zhǎng)

分別用0、5、10、20、40、80、100 nmol/L 濃度的RAPA 處理Jurkat 細(xì)胞24 h、48 h 和72 h 后，MTT法檢測(cè)波長(zhǎng)在490 nm 處的OD 值，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。隨著藥物處理時(shí)間和濃度的增加，RAPA對(duì)Jurkat 細(xì)胞的增殖抑制作用也隨之提高。RAPA呈濃度和時(shí)間依賴性方式抑制Jurkat 細(xì)胞的增殖（圖1）。采用GraphPad Prism 8.0 軟件繪制其增殖抑制曲線并計(jì)算出RAPA 作用于Jurkat 細(xì)胞24 h、48 h 和72 h 的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為507.20 nmol/L、89.51 nmol/L、12.01 nmol/L。與正常對(duì)照組相比，RAPA處理Jurkat 細(xì)胞48 h 時(shí)，其增殖抑制率從（22.96±13.48）%提高到（53.80±9.90）%，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異義（P＜0.05）。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇濃度為10 nmol/L、20 nmol/L 和50 nmol/L 濃度的RAPA 處理Jurkat 細(xì)胞48 h 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。

圖1 RAPA 對(duì)Jurkat 細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effect of RAPA on the proliferation of Jurkat cells

2.2 RAPA 不能有效誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞發(fā)生凋亡

用Annexin VFITC 和PI 雙標(biāo)記細(xì)胞后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)0 nmol/L、10 nmol/L 和50 nmol/L RAPA 處理Jurkat 細(xì)胞48 h 后的凋亡細(xì)胞比例。檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示，10 nmol/L 和50 nmol/L 濃度的RAPA 作用于Jurkat 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞早期凋亡率（Q3）分別為（0.06 ± 0.01）%、（0.14 ± 0.04）%；晚期凋亡率（Q2）分別為（6.13 ± 0.24）%、（6.78 ±0.03）%。細(xì)胞總凋亡率（Q2+Q3）分別為（6.18 ±0.25）%、（6.92 ± 0.02）%。與未處理組（0 nmol/L）（5.65 ± 0.18）%相比，各組細(xì)胞的總凋亡率升高不明顯（P＞0.05）。說(shuō)明在50 nmol/L 濃度內(nèi)，RAPA不能有效地誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖2 RAPA 處理Jurkat 細(xì)胞48 h 的凋亡情況Fig 2 Apoptosis of Jurkat cells treated with RAPA for 48 h

2.3 RAPA 阻滯Jurkat 細(xì)胞周期

為進(jìn)一步確定RAPA 對(duì)Jurkat 細(xì)胞周期的影響。本實(shí)驗(yàn)采用PI 單染法檢測(cè)10 nmol/L 和50 nmol/L RAPA 處理Jurkat 細(xì)胞48 h 后的周期變化情況。檢測(cè)結(jié)果表明（圖3），與空白對(duì)照組相比，G1期細(xì)胞占比從32.74%上升至44.81%，S 期細(xì)胞占比從48.96%下降至35.22%。Jurkat 細(xì)胞在G1 期的比例顯著增加，S 期比例明顯降低（P＜0.05）；且隨著藥物處理濃度的增加，G1 期細(xì)胞比例逐漸增加。表明RAPA 能夠?qū)urkat 細(xì)胞周期阻滯在G1期，并且具有藥物濃度依賴性。

圖3 RAPA 對(duì)Jurkat 細(xì)胞周期的影響Fig 3 Effect of RAPA on Jurkat cell cycle

2.4 RAPA 誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞自噬

吖啶橙染料可以滲透進(jìn)入到自噬溶酶體中，經(jīng)熒光激發(fā)后呈現(xiàn)紅黃色點(diǎn)狀體，能夠間接反應(yīng)細(xì)胞的自噬水平。為了探究RAPA 對(duì)Jurkat 細(xì)胞自噬水平的影響，本實(shí)驗(yàn)用吖啶橙染色觀察細(xì)胞形態(tài)（圖4）。經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后，在熒光顯微鏡下可觀察到對(duì)照組（0 nmol/L）細(xì)胞呈圓球形，發(fā)綠色熒光，胞質(zhì)均勻；給予10 nmol/L 濃度藥物處理后，染色質(zhì)DNA開始凝縮，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅黃色熒光（白色箭頭所示），表明有自噬溶酶體產(chǎn)生。與空白組相比，50 nmol/L 處理組的紅黃色熒光最為顯著。由此可見，自噬溶酶體的數(shù)量呈劑量依賴性增加。

圖4 吖啶橙熒光染色檢測(cè)細(xì)胞自噬（×400）Fig 4 Autophagy was detected by acridine orange fluorescence staining（×400）

2.5 自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

0～50nmol/L RAPA 處理Jurkat 細(xì)胞48 h 后，提取細(xì)胞總RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)按照“|log2 Fold Change | ＞0，P-value ＜0.05”的標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因（圖5）。共篩選出27個(gè)表達(dá)基因，包括ATG 基因家族（8 個(gè)）、MAPK 基因家族（10 個(gè)）、PI3K 激酶家族（6 個(gè)）和ULK 激酶家族（3 個(gè)）。其中上調(diào)的基因共有17 個(gè)，下調(diào)基因有10 個(gè)。在ATG 基因家族中，ATG3/7/10/13/16L2 這5 個(gè)基因經(jīng)RAPA 誘導(dǎo)后被上調(diào)，ATG12/14/16L1 這3 個(gè)基因下調(diào)；MAPK 基因家族中，MAPK1/6/8/9/13 這5 個(gè)基因下調(diào)，MAPK3/7/11/12/14 這5 個(gè)基因上調(diào)；PI3K 激酶家族中，PIK3R1/3/4/6 這4 個(gè)基因上調(diào)，PIK3R2/5 下調(diào)；ULK 激酶家族（ULK1/2/3）經(jīng)RAPA 誘導(dǎo)后全部上調(diào)。綜上所述，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，RAPA 作為mTOR 的天然抑制劑，可以調(diào)控自噬基因的表達(dá)，改變基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響自噬通路在細(xì)胞中所發(fā)揮的作用。

圖5 自噬相關(guān)基因差異表達(dá)熱圖Fig 5 Heatmap of the differential expression of autophagy related genes

2.6 RAPA 影響自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平

采用終濃度為10 nmol/L、20 nmol/L 和50 nmol/L 的RAPA 處理細(xì)胞48 h 后，qPCR 檢測(cè)自噬基因ULK1、ATG13、ATG16L2、MPKA1、PIK3R1、Raptor 在Jurkat 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示（圖6），經(jīng)不同濃度RAPA 處理后，除MPKA1 基因的轉(zhuǎn)錄水平呈明顯下降趨勢(shì)外，低濃度（10 nmol/L、20 nmol/L）的RAPA 可上調(diào)基因ULK1、ATG13、ATG16L2、PIK3R1、Raptor 的表達(dá)，上調(diào)約2～3 倍，具有濃度依賴性。其中，ULK1 和TG16L2 基因表達(dá)尤其顯著，上調(diào)約4～6 倍；高濃度（50 nmol/L）時(shí)，轉(zhuǎn)錄水平開始下調(diào)。這說(shuō)明低濃度的RAPA 抑制mTOR 信號(hào)通路后，會(huì)促進(jìn)部分自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬；高濃度的RAPA 則會(huì)抑制自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而阻斷細(xì)胞自噬。

圖6 RAPA 誘導(dǎo)后自噬基因的轉(zhuǎn)錄水平變化Fig 6 Transcript level changes of autophagy genes after RAPA induction

2.7 RAPA 影響自噬相關(guān)基因的蛋白質(zhì)水平

Jurkat 細(xì)胞經(jīng)10 nmol/L、20 nmol/L 和50 nmol/L RAPA 處理48 h 后收集細(xì)胞樣品，通過(guò)Western Blot 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析自噬基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化趨勢(shì)（圖7）。與對(duì)照組相比，在10 nmol/L 和20 nmol/L 濃度誘導(dǎo)下，ULK1、ATG13、ATG16L2、PIK3R1、Raptor 基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平逐漸上升，50 nmol/L 時(shí)，表達(dá)水平開始下降；MPKA1 基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平隨著藥物濃度的增加而下降。從整體趨勢(shì)分析，蛋白質(zhì)表達(dá)水平與qPCR 結(jié)果趨勢(shì)基本一致。Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，低濃度的RAPA 可以誘導(dǎo)ULK1、ATG13、ATG16L2、PIK3R1、Raptor 蛋白質(zhì)的表達(dá)；高濃度則會(huì)降低蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

圖7 RAPA 對(duì)自噬蛋白表達(dá)的影響Fig 7 Effect of RAPA on autophagy protein expression

2.8 RAPA 誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因染色質(zhì)可及性改變

基因表達(dá)是一個(gè)高度調(diào)控的過(guò)程，可以從多個(gè)水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄是這一復(fù)雜過(guò)程的第一步。染色質(zhì)在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中扮演著重要的角色，其DNA與核小體之間相互作用的動(dòng)態(tài)改變影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序的調(diào)控［12，13］。為了進(jìn)一步研究自噬相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，本文通過(guò)FAIRE-qPCR 技術(shù)對(duì)自噬基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)的開放狀態(tài)進(jìn)行分析（圖8）。與對(duì)照組相比，10 nmol/L 和20 nmol/L RAPA 處理48 h 后，ULK1、ATG13、ATG16L2、PIK3R1、Raptor 基因的染色質(zhì)可及性增加，MAPK基因的染色質(zhì)可及性降低，隨著藥物處理濃度的增加，染色質(zhì)可及性也呈現(xiàn)梯度變化；50 nmol/L 時(shí)，由于藥物處理濃度過(guò)高使細(xì)胞發(fā)生自噬，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果虛高。整體來(lái)看，自噬基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)可及性變化趨勢(shì)基本與基因表達(dá)的變化趨勢(shì)一致。結(jié)果表明，RAPA 可以影響自噬基因染色質(zhì)的開放狀態(tài)，改變細(xì)胞內(nèi)的表觀遺傳環(huán)境，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。

圖8 自噬基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)可及性分析Fig 8 Analysis of chromatin accessibility in the promoter region of autophagy gene

3 討論

mTOR 通過(guò)參與體內(nèi)多種信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、自噬和凋亡。研究表明，mTOR 信號(hào)在高達(dá)80 %的人類癌癥中被過(guò)度活躍，并且在維持癌細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤代謝方面發(fā)揮著重要作用。癌癥是與自噬調(diào)節(jié)失調(diào)有關(guān)的主要疾病之一。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞更依賴于自噬生存。通過(guò)自噬循環(huán)過(guò)程，癌細(xì)胞在快速增殖過(guò)程中克服了新陳代謝壓力。此外，自噬在腫瘤中起著“雙刃劍”的作用。它在癌癥早期抑制腫瘤的形成，而在晚期，則促進(jìn)腫瘤發(fā)展。由于其在癌癥發(fā)病機(jī)制中的動(dòng)態(tài)和雙重作用，自噬為開發(fā)新型有效的癌癥療法提供了很好的機(jī)會(huì)［14-17］。

抑制自噬成為一種新興的治療選擇，通過(guò)藥理學(xué)手段抑制自噬可以促進(jìn)癌癥細(xì)胞死亡。眾所周知的mTOR 抑制劑RAPA 具有有效的自噬激活作用。多項(xiàng)研究表明，多種新型mTOR 抑制劑在臨床研究中表現(xiàn)出較高的抗腫瘤活性，與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用效果顯著。然而，mTOR 信號(hào)通路的作用尚未被明確研究，許多自噬相關(guān)基因在各種癌細(xì)胞中的分子調(diào)控機(jī)制也尚未完全破譯。腫瘤的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多條信號(hào)通路。抑制某些信號(hào)通路可能會(huì)導(dǎo)致其他信號(hào)通路的反饋激活。盡管聯(lián)合治療更有效，但其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的能力有限。因此，了解腫瘤微環(huán)境與自噬之間的相互作用至關(guān)重要，通過(guò)對(duì)mTOR 信號(hào)通路作用機(jī)制的研究，開發(fā)選擇性的mTOR 抑制劑，有利于阻止腫瘤的發(fā)展和對(duì)抗治療耐藥性［18-20］。

本研究使用天然化合物-RAPA 作為目標(biāo)分子，研究其誘導(dǎo)自噬基因潛在的分子機(jī)制。通過(guò)MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RAPA 對(duì)Jurkat 細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且抑制程度與藥物濃度呈正相關(guān)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，10 nmol/L 和20 nmol/L 的RAPA 能夠提高自噬相關(guān)基因ULK1、Atg13、Atg16L、PIK3R 和Raptor 的表達(dá)，50 nmol/L 則會(huì)下調(diào)自噬基因的表達(dá)，推測(cè)在細(xì)胞自噬進(jìn)程中，自噬體的水解和來(lái)自溶酶體的氨基酸外排導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨基酸增加，受到其最終產(chǎn)物的抑制，使得相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)下調(diào)的現(xiàn)象。

綜上所述，RAPA 能夠抑制Jurkat細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。從分子機(jī)制上看，RAPA 改變了自噬基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)的開放狀態(tài)，進(jìn)而影響了基因的表觀遺傳環(huán)境，這種空間結(jié)構(gòu)的變化在功能上調(diào)控了基因的表達(dá)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

許蘭：參與部分實(shí)驗(yàn)操作，分析數(shù)據(jù)，撰寫文章；黃笠紋、肖亦舒：進(jìn)行RT-qPCR 及Western Blot 實(shí)驗(yàn)；劉春亞：培養(yǎng)細(xì)胞和MTT 法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率實(shí)驗(yàn)；杜樂(lè)：對(duì)實(shí)驗(yàn)工作進(jìn)行技術(shù)指導(dǎo)；任立成：提供技術(shù)支持和指導(dǎo)，并負(fù)責(zé)文章的修改指正。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。