韓志松 白俊艷 曾凡林 李靜云 何豫涵 陳夢(mèng)柯 盧小寧

摘要：主要分析GHR、GHRH、GHRHR基因的多態(tài)性，以及其與小尾寒羊肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)，以期為優(yōu)質(zhì)綿羊新品種培育提供一定的參考依據(jù)。采用PCR技術(shù)，檢測(cè)小尾寒羊群體中GHR、GHRH和GHRHR基因的多態(tài)性，利用SPSS軟件分析以上3種基因的不同基因型與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明，GHR與GHRHR共有3種基因型，分別為II、ID、DD，而GHRH基因僅檢測(cè)到2種基因型，分別為II、DD。GHR基因中II基因型頻率最高，為0.625，ID的基因型頻率為0.313，DD的基因型頻率最低，為0.063；多態(tài)信息含量（PIC）為0.283，處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50）；小尾寒羊GHR基因的DD基因型肉質(zhì)的色澤顯著低于ID、II基因型（P＜0.05）。GHRHR基因中II基因型頻率最高，為0.687 5，DD基因型頻率最低，為0.062 5，ID基因型頻率為0.2500；多態(tài)信息含量為0.258，處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50）；GHRHR基因的DD基因型的剪切力顯著高于ID、II基因型（P<0.05）。GHRH基因中DD基因型頻率最低，為0.437 5，II基因型頻率最高，為0.562 5；多態(tài)信息含量（PIC）為0.371，處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50）；GHRH不同基因型對(duì)于小尾寒羊的所有肉質(zhì)性狀影響不顯著（P>0.05）。綜上所述，GHR基因、GHRHR基因可以作為小尾寒羊提升肉質(zhì)品質(zhì)的候選基因之一。

關(guān)鍵詞：小尾寒羊；GHR基因；GHRHR基因；肉質(zhì)性狀；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：S826.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）08-0145-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31201777）；博士啟動(dòng)基金計(jì)劃（編號(hào)：20111148）；橫向課題（編號(hào)：橫20220047）。

作者簡(jiǎn)介：韓志松（1977—），男，遼寧阜新人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)樾竽辽鷳B(tài)模式。E-mail：hanzhisongcy@163.com。

通信作者，白俊艷，博士，副教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物分子育種。E-mail：junyanbai@163.com。

生長(zhǎng)激素受體（growth hormone receptor，簡(jiǎn)稱GHR）基因在1976年從兔的肝臟細(xì)胞的細(xì)胞膜上被發(fā)現(xiàn)［1］。GHR基因?qū)τ诩永＠麃喭玫纳L(zhǎng)性能有促進(jìn)作用［2］，可以作為候選基因，用來(lái)改善該奶牛群體的相關(guān)性能［3］。GHR-F279Y位點(diǎn)苯丙氨酸的編碼T被酪氨酸編碼A取代，導(dǎo)致其脂肪、蛋白質(zhì)和乳的產(chǎn)量有所降低［4］。GHR基因的g.914T>A的T等位基因與肌肉以及乳房的大小呈現(xiàn)出正相關(guān)性［5］。GHR基因還可以為安納托利亞水牛早期選種提供一定的優(yōu)勢(shì)［6］。 生長(zhǎng)激素釋放激素（growth hormone releasing hormone，簡(jiǎn)稱GHRH） 是在下丘腦的弓狀核中合成分泌的小分子多肽［7］。GHRH基因不僅是在種間還是種內(nèi)都具有高度保守性［8］。雄性小鼠缺乏GHRH會(huì)增加體力活動(dòng)［9］。牛的GHRH基因可能是影響體質(zhì)量的重要因素之一［10］。GHRH 基因mRNA表達(dá)和生長(zhǎng)性狀相對(duì)于基因型（+/-）均表現(xiàn)出差異不顯著［11］。GHRH類似物通過(guò)抗炎和抗氧特性使其在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙诰哂斜Ｗo(hù)神經(jīng)血管作用［12］。 生長(zhǎng)激素釋放激素受體（growth hormone releasing hormone receptor，簡(jiǎn)稱GHRHR） 在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)激素合成與分泌等方面都發(fā)揮著重要作用。迄今為止僅在異種動(dòng)物、雞和斑馬魚中發(fā)現(xiàn)的GHRHR同時(shí)容納GHRH和PRP［13］。GHRHR確定為GH1之后的第2個(gè)IGHD基因［14］。CREB3L2能夠促進(jìn)GHRHR啟動(dòng)子的活性［15］。

InDel多態(tài)性分子標(biāo)記是基于插入/缺失位點(diǎn)2側(cè)的序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的標(biāo)記，其本質(zhì)仍屬于長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記，可利用便捷的電泳平臺(tái)進(jìn)行分型。InDel標(biāo)記準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，避免了由于特異性和復(fù)雜性導(dǎo)致的后續(xù)分析模糊。此外，InDel標(biāo)記能擴(kuò)增混合DNA樣品和高度降解的微量DNA樣品，并進(jìn)行有效分型。InDel標(biāo)記目前已開始應(yīng)用于動(dòng)植物群體遺傳分析、分子輔助育種以及人類法醫(yī)遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域［16］。本研究以小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)GHR、GHRH、GHRHR基因的InDel多態(tài)性與肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以此來(lái)探討GHR、GHRH、GHRHR基因?qū)π∥埠蛉赓|(zhì)性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取遼寧省沙地治理與利用研究所阜瑤牧業(yè)公司阜新市種羊場(chǎng)的小尾寒羊164只，通過(guò)頸靜脈采血，并作ACD抗凝處理后的血樣至于冰盒中，放入冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 肉質(zhì)性狀指標(biāo)測(cè)定 測(cè)定指標(biāo)包括滴水損失、水分、蒸煮損失、色澤、粗蛋白、粗脂肪，測(cè)量方法參考張沅主編的《家畜育種學(xué)》［17］。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)參考Wu等的研究［18］。并由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司合成，引物信息見表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析 PCR擴(kuò)增體系 15 μL：上下游引物各 1 μL，DNA 2 μL，2×Tap PCR Master Mix 7.5 μL，dd H2O 3.5μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)SPSS 26.0軟件中的一般線性模型方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，最終以作圖形式展示關(guān)聯(lián)結(jié)果。

1.2.4 試驗(yàn)地點(diǎn)與時(shí)間 試驗(yàn)地點(diǎn)為河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)時(shí)間為2021年4月至2022年4月。

2 結(jié)果與分析

2.1 小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因的多態(tài)性檢測(cè)

從圖1可以看出，GHR基因具有3種基因型，分別為II基因型、ID基因型、DD基因型。從圖2可以看出，GHRH基因具有2種基因型，分別為II基因型、DD基因型。從圖3可以看出，GHRHR基因具有3種基因型，分別為II基因型、ID基因型、DD基因型。

2.2 小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因的群體遺傳多樣性

從表1可以看出，GHR基因的II基因型頻率最高，為0.625；DD基因型頻率最低，僅有0.063。等位基因I的頻率最多，為0.781；D的頻率較少，為0.219。純合度為0.685，雜合度為0.342，多態(tài)信息含量為0.283，在群體中處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50），χ2為0.235，P值為0.628>0.05，說(shuō)明GHR基因符合Hardy-Weinberg平衡。

GHRH基因II基因型頻率最高，為0.563；DD基因型頻率較低，為0.437。等位基因I的頻率最高，為0.536；D的頻率最小，為0.437。純合度為0.508，雜合度為0.492，多態(tài)信息含量為0.371，在群體中處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50），χ2為32.000，P值為0.000<0.001，說(shuō)明GHRH基因極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。

GHRHR基因的ID基因型頻率為0.250；DD基因型頻率最低，為0.062；II基因型頻率最高，為0.688。等位基因I頻率最高，為0.813；等位基因D頻率最低，為0.187。純合度為0.695，雜合度為0.305，多態(tài)信息含量為0.258，在群體中處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50），χ2為1.031，P值為0.310>0.05，說(shuō)明小尾寒羊GHRHR基因位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

從圖4可以看出，小尾寒羊GHR基因的DD基因型肉質(zhì)色澤顯著低于ID、II基因型（P＜0.05），而滴水損失、剪切力、水分、蒸煮損失、粗蛋白、粗脂肪在GHR基因的不同基因型之間無(wú)顯著差異（P>0.05）。從圖5可以看出，GHRH不同基因型對(duì)于小尾寒羊的所有肉質(zhì)性狀影響不顯著（P>0.05）。從圖6可以看出，GHRHR基因的DD基因型個(gè)體的剪切力顯著高于ID、II基因型個(gè)體（P<0.05），而滴水損失、水分、蒸煮損失、色澤、粗蛋白、粗脂肪在GHRHR基因的不同基因型之間無(wú)顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

目前，對(duì)于GHR、GHRH、GHRHR這3種基因的研究大多數(shù)都集中在其生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析，但是對(duì)于這3種基因的關(guān)于肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析卻較少，而且多數(shù)的研究都集中在牛等其他動(dòng)物身上，有關(guān)綿羊類的研究非常少。

3.1 GHR基因的多態(tài)性

在不同年齡的西羅希山羊品種中，GHR基因的1個(gè)SNP與體質(zhì)量存在顯著影響［19］。GHR基因T229C位點(diǎn)對(duì)牛的宰前活質(zhì)量、屠宰率、胴體質(zhì)量、凈肉率、肉骨比、脂肪覆蓋率、頭質(zhì)量、胴體產(chǎn)肉率、前蹄質(zhì)量、后蹄質(zhì)量、大理石花紋評(píng)分和剪切力影響顯著［20］。在家兔群體中，GHR基因的外顯子上發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn)，分別是2 067（C/T）、1 797（T/C），在1 797（T/C）位點(diǎn)中不同基因型肉用性狀之間使用最小二乘分析結(jié)果顯示，在不同基因型個(gè)體間差異不顯著（P>0.05），而2 067（C/T）突變位點(diǎn)在胴體質(zhì)量、背腰質(zhì)量、35日齡體質(zhì)量、70日齡體質(zhì)量、前腿質(zhì)量、皮質(zhì)量和后腿質(zhì)量等屠宰性狀及肌內(nèi)蛋白質(zhì)含量和干物質(zhì)含量等肉質(zhì)性狀的最小二乘均值雜合型MN型個(gè)體顯著優(yōu)于MM型、NN型個(gè)體（P<0.05）［21］。本研究中GHR基因僅與小尾寒羊的肉質(zhì)色澤存在顯著相關(guān)性，可以推測(cè)出GHR基因可以作為小尾寒羊提升肉質(zhì)品質(zhì)的候選基因之一。

3.2 GHRH基因的多態(tài)性

GHRH激動(dòng)劑可以減輕誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)抑郁、焦慮和認(rèn)知缺陷，并且降低氧化應(yīng)激標(biāo)志物，促紅細(xì)胞生成素和胰島素生長(zhǎng)因子-1表達(dá)上調(diào)，并明顯降低了小鼠在睡眠期間的間歇性缺氧時(shí)的水迷宮缺陷［22］。GHRH除了影響內(nèi)分泌作用和代謝以外，在炎癥和疼痛的調(diào)節(jié)中同樣發(fā)揮作用?？梢酝ㄟ^(guò)注射GHRH表達(dá)質(zhì)粒的方法來(lái)提高綿羊的增質(zhì)量和生長(zhǎng)速率。PCR結(jié)果顯示，經(jīng)pM-GHRH處理后的綿羊中幾乎沒(méi)有質(zhì)粒殘留，并且也不存在器官腫大或相關(guān)的病理 ［23］。在朝鮮牛群體中，GHRH基因在9 kb全基因區(qū)域內(nèi)共發(fā)現(xiàn)12個(gè)單核苷酸多態(tài)性，結(jié)果顯示-4241A>T與EMA和CW呈顯著相關(guān)，表明GHRH基因多態(tài)性可能是影響肉牛胴體產(chǎn)量的重要遺傳因素之一［24］。本試驗(yàn)結(jié)果與之存在差異，這可能是由于所選的動(dòng)物種類不同，而導(dǎo)致的結(jié)果存在差異，本試驗(yàn)結(jié)果中的GHRH基因與小尾寒羊肉質(zhì)性狀的無(wú)顯著相關(guān)性，故不可以作為小尾寒羊肉質(zhì)形狀的候選基因。

3.3 GHRHR基因的多態(tài)性

GHRHR基因的2種單倍型的效應(yīng)大于其他任何基因，表明GHRHR可能是迄今為止發(fā)現(xiàn)的影響人類身高正常變異的最重要基因之一［25］。 在南陽(yáng)牛、陜縣紅牛和秦川牛中發(fā)現(xiàn)GHRHR的4個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)出10個(gè)SNPs，而且對(duì)陜縣紅牛的管圍存在極顯著的影響（P<0.01），對(duì)其體高、體斜長(zhǎng)、腰角寬、體質(zhì)量、十字部高、尻長(zhǎng)和胸圍有顯著影響（P<0.05）；對(duì)南陽(yáng)牛0～6月齡平均日增質(zhì)量、6月齡體質(zhì)量、體斜長(zhǎng)和6～12月齡平均日增質(zhì)量有明顯的影響（P<0.05）［26］。本研究中GHRHR基因僅與小尾寒羊的剪切力存在顯著相關(guān)性，可以推測(cè)出GHRHR基因可以作為小尾寒羊提升肉質(zhì)品質(zhì)的候選基因之一。

參考文獻(xiàn)：

［1］Tsushima T. Technics of growth hormone receptor assay［J］. Nihon Rinsho，1976，34（3）：461-465.

［2］Gencheva D G，Velikov K P，Veleva P M. Association analysis of nucleotide polymorphisms in growth hormone （GH） and its receptor （GHR） with body weight in Californian rabbits［J］. World Rabbit Science，2022，30（1）：95-102.

［3］Cobanoglu O，Kul E，Gurcan E K，et al. Determination of the association of GHR/AluI gene polymorphisms with milk yield traits in Holstein and Jersey cattle raised in Turkey［J］. Archives Animal Breeding，2021，64（2）：417-424.

［4］Komisarek J，Michalak A，Walendowska A. The effects of polymorphisms in DGAT1，GH and GHR genes on reproduction and production traits in Jersey cows［J］. Animal Science Papers and Reports，2011，29（1）：29-36.

［5］Fedota O M，Lysenko N G，Ruban S Y，et al. The effects of polymorphisms in growth hormone and growth hormone receptor genes on production and reproduction traits in Aberdeen-Angus cattle （Bos taurus L.，1758）［J］. Cytology and Genetics，2017，51（5）：352-360.[HJ0]

［6］Erdogˇ[DD）]an M，TekerlI[DD（-*2/3][HT6H]·[DD）] M，elI[DD（-*2/3][HT6H]·[DD）]kelogˇ[DD）]lu K，et al. Associations of SNPs in GHR gene with growth and milk yield of Anatolian buffaloes［J］. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences，2021，45（6）：1080-1086.

［7］馬冬梅，韓林強(qiáng)，白俊杰. 大口黑鱸GHRH基因啟動(dòng)子區(qū)域序列分析及其活性檢測(cè)［J］. 海洋漁業(yè)，2016，38（4）：383-390.

［8］王金玲，王 永，劉魯蜀，等. 草地藏系綿羊生長(zhǎng)激素釋放激素基因部分cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（3）：595-599.

［9］Leone S，Shohreh R，Manippa F，et al. Behavioural phenotyping of male growth hormone-releasing hormone （GHRH） knockout mice［J］. Growth Hormone & IGF Research，2014，24（5）：192-197.

［10］Zhang B，Zhao G F，Lan X Y，et al. Polymorphism in GHRH gene and its association with growth traits in Chinese native cattle［J］. Research in Veterinary Science，2012，92（2）：243-246.

［11］Ma D M，Han L Q，Bai J J，et al. A 66-bp deletion in growth hormone releasing hormone gene 5′-flanking region with largemouth bass recessive embryonic lethal［J］. Animal Genetics，2014，45（3）：421-426.

［12］Thounaojam M C，Powell F L，Patel S，et al. Protective effects of agonists of growth hormone-releasing hormone （GHRH） in early experimental diabetic retinopathy［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2017，114（50）：13248-13253.

［13］Tam J K，Chow B K，Lee L T.Structural and functional divergence of growth hormone-releasing hormone receptors in early sarcopterygians：lungfish and Xenopus［J］. PLoS One，2013，8（1）：e53482.

［14］Cohen E，Belkacem S，F(xiàn)edala S，et al. Contribution of functionally assessed GHRHR mutations to idiopathic isolated growth hormone deficiency in patients without GH1 mutations［J］. Human Mutation，2019，40（11）：2033-2043.

［15］Ariyasu D，Kubo E，Higa D，et al. Decreased activity of the GHRHR and GH promoters causes dominantly inherited GH deficiency in humanized GH1 mouse models［J］. Endocrinology，2019，160（11）：2673-2691.

［16］楊 潔，赫 佳，王丹碧，等. InDel標(biāo)記的研究和應(yīng)用進(jìn)展［J］. 生物多樣性，2016，24（2）：237-243.

［17］張 沅. 家畜育種學(xué)［M］. 2版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2018.

［18］Wu M L，Zhao H D，Tang X Q，et al. Novel InDels of GHR，GHRH，GHRHR and their association with growth traits in seven Chinese sheep breeds［J］. Animals，2020，10（10）：1883.

［19］Sharma A，Dutt G，Sivalingam J，et al. Novel SNPs in IGF1，GHR and IGFBP-3 genes reveal significant association with growth traits in Indian goat breeds［J］. Small Ruminant Research，2013，115（1/2/3）：7-14.

［20］施雪奎. 肉牛CAPN1、CAST、GHR、SCD1基因多態(tài)性及與胴體、肉質(zhì)性狀的相關(guān)性研究［D］. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2011.

［21］喬西波. 家兔GH、GHR及MSTN基因多態(tài)性及其與產(chǎn)肉性狀的關(guān)系［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［22］Nair D，Ramesh V，Li R C，et al. Growth hormone releasing hormone （GHRH） signaling modulates intermittent hypoxia-induced oxidative stress and cognitive deficits in mouse［J］. Journal of Neurochemistry，2013，127（4）：531-540.

［23］Meng Q Y，Chen Z Q，Yu Z Q，et al. Increased body weight via injecting myogenic expression growth hormone-releasing hormone （GHRH） plasmid DNA into sheep［J］. Animal Biotechnology，2004，15（2）：175-192.

［24］Cheong H S，Yoon D H，Kim L H，et al. Growth hormone-releasing hormone （GHRH） polymorphisms associated with carcass traits of meat in Korean cattle［J］. BMC Genetics，2006，7：35.

［25］Johansson A，Jonasson I，Gyllensten U.Extended haplotypes in the growth hormone releasing hormone receptor gene （GHRHR） are associated with normal variation in height［J］. PLoS One，2009，4（2）：e4464.

［26］張存芳.黃牛PTHRP、GHRH和GHRHR基因SNP及其與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析［D］. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.