零唯　楊丹　譚勇　黃鼎　林敬禎　明如宏

摘要 采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化胡椒屬藥用植物SCoT-PCR反應(yīng)體系，并運(yùn)用SCoT分子標(biāo)記對7種胡椒屬藥用植物31份樣品進(jìn)行遺傳多樣性研究。結(jié)果表明，胡椒屬藥用植物SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系：總體積20 μL，其中10×Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.20 mmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，引物0.4 μmol/L，模板DNA 100 ng，Taq聚合酶2.5 U。擴(kuò)增總條帶數(shù)為68條，其中多態(tài)性條帶為64條，多態(tài)性比率為94.12%。31份胡椒屬藥用植物個(gè)體間聚類分析結(jié)果顯示，31份胡椒屬樣品劃分為2個(gè)類群，6個(gè)亞群。SCoT可適用于胡椒屬藥用植物遺傳多樣性研究。

關(guān)鍵詞胡椒屬；SCoT；正交優(yōu)化；遺傳多樣性

中圖分類號Q949.732.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0182-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.042開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Diversity Analysis of Piper Medicinal Plants Based on SCoT Markers

LING Wei YANG Dan TAN Yong et al（1.Institute of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530000;2.Guangxi Key Laboratory of Zhuang and Yao Ethnic Medicine，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530200）

AbstractThe SCoT-PCR reaction system of medicinal plants of Piper was optimized by orthogonal design，and the genetic diversity of 31 samples of 7 species of medicinal plants of Piper was studied by SCoT molecular markers.The results showed that the best SCoT-PCR reaction system of Piper was as follows： the total volume was 20 μL，of which 10 × buffer 2.0 μL，dNTPs 0.20 mmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，primer 0.4 μmmol/L，template DNA 100 ng，Taq polymerase 2.5 U.The total number of amplified bands was 68，of which 64 were polymorphic，with a polymorphism rate of 94.12%.The clustering results showed that 31 samples of Piper were divided into 2 groups and 6 subgroups.SCoT can be used to study the genetic diversity of medicinal plants of Piper.

Key wordsPiper;SCoT;Orthogonal optimization;Genetic diversity

胡椒屬（Piper）為胡椒科（Piperaceae）最大的屬之一，在全球約有2 000 多種，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］，我國有60多種，其中30多種入藥，主要產(chǎn)地為云南、廣東、廣西、海南等省區(qū)［2］。胡椒屬藥用植物具有重要的藥用價(jià)值，在民間多用作止痛、活血和抗風(fēng)濕性疾病藥物［3］，現(xiàn)代研究表明其具有抗菌、抗抑郁、抗血栓等藥理作用［4-6］。除藥用外，胡椒屬藥用植物還作為調(diào)味品用于食品烹飪以及芳香性精油用于香水工業(yè)中［7-8］。由于胡椒屬藥用植物野生種類分布范圍狹小、資源稀少［9］，為有效保護(hù)和利用胡椒屬藥用植物資源，有必要對胡椒屬藥用植物遺傳多樣性進(jìn)行研究。

起始密碼子多態(tài)性（start condon targeted polymorphism，SCoT）是Collard等［10］根據(jù)植物基因組ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性而開發(fā)的一種目的基因分子標(biāo)記，其具有操作簡單、引物通用性強(qiáng)、遺傳信息豐富、多態(tài)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前已成功應(yīng)用于梔子［11］、地黃［12］、秦艽［13］等藥用植物的遺傳多樣性研究。因此，該試驗(yàn)運(yùn)用SCoT標(biāo)記技術(shù)對31份胡椒屬藥用植物樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，挖掘胡椒屬藥用植物遺傳信息，為胡椒屬藥用植物的種質(zhì)選育和資源保護(hù)提供理論參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料該試驗(yàn)采集31份胡椒屬藥用植物新鮮嫩葉為供試材料，采集樣品經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室戴忠華副教授鑒定，其中29份材料采自廣西各地，2份材料采自海南，樣品信息見表1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取及質(zhì)量測定。參照天根多糖多酚提取植物基因組DNA試劑盒提取步驟對胡椒屬藥用植物DNA進(jìn)行提取，將符合要求的DNA溶液稀釋至50 ng/μL，放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2單因素考察。參照尚小紅等［14］的研究，設(shè)定SCoT-PCR初始擴(kuò)增反應(yīng)體系：總體積20 μL，10×Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.25 mmol/L，Mg 1.5 mmol/L，引物 0.8 μmol/L，模板DNA 50 ng，Taq聚合酶1 U，剩余部分用ddHO補(bǔ)齊，其中DNA模板為假蔞J10，引物為SCoT 21；擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。對SCoT反應(yīng)體系中的dNTPs濃度、Mg濃度、引物濃度、模板DNA用量以及Taq聚合酶量進(jìn)行單因素考察，每個(gè)因素設(shè)置6個(gè)梯度水平，見表2。

1.2.3正交優(yōu)化試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L16（45）正交表優(yōu)化SCoT-PCR反應(yīng)體系，每處理2次重復(fù)（表3）。正交試驗(yàn)的反應(yīng)體系以及反應(yīng)程序與單因素試驗(yàn)相同。

1.2.4引物篩選以及退火溫度的優(yōu)化。采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對61條SCoT引物進(jìn)行篩選，引物選用 Collard等［10］開發(fā)設(shè)計(jì)SCoT的引物。選用PCR儀的退火溫度梯度模式，設(shè)置溫度區(qū)間為引物TM值±5 ℃，對引物進(jìn)行退火溫度優(yōu)化。

1.2.5SCoT-PCR擴(kuò)增與數(shù)據(jù)處理。利用篩選出的引物對31份胡椒屬藥用植物進(jìn)行擴(kuò)增。對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，建立0/1矩陣。利用POPGENE 3.2軟件進(jìn)行分析獲得遺傳相似系數(shù)，采用NTSYS 2.10軟件對胡椒屬7個(gè)品種31份樣品進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1dNTPs濃度對SCoT-PCR擴(kuò)增效果的影響。如圖1所示，6條泳道均能擴(kuò)增出條帶。dNTPs濃度在0.15～0.30 mmol/L，條帶清晰可辨，亮度適中；當(dāng)濃度在0.35～0.40 mmol/L，條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，清晰度下降。因此選定0.15～0.30 mmol/L 為正交優(yōu)化試驗(yàn)梯度水平。

2.1.2Mg濃度對SCoT-PCR擴(kuò)增效果的影響。從圖2可以看出，Mg濃度在1.5～2.5 mmol/L時(shí)，條帶較為清晰，分離度較好；當(dāng)Mg濃度為3.5 mmol/L時(shí)，雖擴(kuò)增條帶數(shù)量多、亮度適中，但與1.5、2.0 mmol/L相比，無明顯優(yōu)勢。為了節(jié)約成本，因此選擇1.5～3.0 mmol/L為正交優(yōu)化試驗(yàn)梯度水平。

2.1.3引物濃度對SCoT-PCR擴(kuò)增效果的影響。從圖3可以看出，當(dāng)引物濃度在0.3～0.6 μmol/L時(shí)，隨著濃度的增加，擴(kuò)增條帶亮度、清晰度隨之增強(qiáng)；當(dāng)濃度超過0.7 μmol/L時(shí)，部分條帶出現(xiàn)黏連情況，無法區(qū)分。因此選用0.3～0.6 μmol/L為正交優(yōu)化試驗(yàn)梯度水平。

2.1.4模板DNA用量對SCoT-PCR擴(kuò)增效果的影響。從圖4可以看出，模板DNA用量為25和150 ng時(shí)，條帶彌散、模糊；用量為50～125 ng，擴(kuò)增譜帶相似，譜帶清晰且數(shù)量較多。綜合考慮，選擇50～125 ng為正交優(yōu)化試驗(yàn)梯度水平。

2.1.5Taq聚合酶用量對SCoT-PCR擴(kuò)增效果的影響。從圖5可以看出，當(dāng)Taq聚合酶用量為0.5和3.0 U時(shí)，部分條帶存在模糊現(xiàn)象；當(dāng)用量為1.0～2.5 U時(shí)，擴(kuò)增條帶較為清晰，條帶帶型差異性較小。因此選擇1.0～2.5 U為正交優(yōu)化試驗(yàn)梯度水平。

2.2SCoT正交試驗(yàn)正交電泳結(jié)果（圖6）表明在16個(gè)組合2次重復(fù)中，所有的組合均能擴(kuò)增出條帶，大小在250～2 000 bp。從圖6可以看出，16個(gè)組合對擴(kuò)增結(jié)果的影響存在一定的差異。組合1和14都存在只擴(kuò)增出2條條帶的情況；組合2、3、7、8、9、11、12、13、14、15、16條帶模糊；組合5、6擴(kuò)增結(jié)果較好，條帶清晰，分離度、亮度適中。其中組合5的2次擴(kuò)增結(jié)果較為穩(wěn)定，因此選擇組合5為SCoT-PCR最佳反應(yīng)組合，SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系為10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.20 mmol/L、Mg 1.5 mmol/L、引物0.4 μmol/L、模板DNA 100 ng、Taq聚合酶2.5 U，用無菌水補(bǔ)足20 μL。

2.3引物篩選以及最佳退火溫度的確定依據(jù)正交優(yōu)化得到的最佳反應(yīng)體系，對61條SCoT引物進(jìn)行篩選試驗(yàn)。對各引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，其中有9條引物能夠擴(kuò)增出清晰且多態(tài)性較好的條帶，引物信息及其最佳退火溫度見表4。

2.4SCoT擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析對31份胡椒屬藥用植物總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，部分?jǐn)U增圖如圖7所示。擴(kuò)增結(jié)果如表5所示，9條引物擴(kuò)增出68條條帶；引物SCoT 24、SCoT 45、SCoT 49擴(kuò)增條帶數(shù)量最多，SCoT 61和SCoT 63最少；多態(tài)性條帶為64條，多態(tài)性比率為94.12%。

2.5遺傳相似性分析及聚類分析利用NTSYS 2.10軟件算出31份胡椒屬藥用植物的遺傳相似系數(shù)在0.37～0.91。其中親緣關(guān)系最近的2份植物分別為采自廣西中醫(yī)藥大學(xué)仙葫校區(qū)的假蔞J1與廣西民族大學(xué)相思湖校區(qū)的假蔞J2，遺傳相似系數(shù)為0.91；而親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的2份植物分別為廣西南寧市賓陽縣思隴鎮(zhèn)水村的風(fēng)藤F2和廣西桂平市蒙圩鎮(zhèn)新陽村龍?zhí)渡降募偈VJ12，遺傳相似系數(shù)為0.37。

聚類分析結(jié)果（圖8）顯示，當(dāng)遺傳相似系數(shù)0.54為閾值時(shí)，可將31份胡椒屬植物分為2個(gè)大類，其中假蔞、蓽茇、大葉蒟、苧葉蒟、胡椒聚為一類，蓽茇、風(fēng)藤、山蒟聚為一類；遺傳相似系數(shù)為0.63時(shí)，大葉蒟單獨(dú)聚為一類；胡椒和苧葉蒟在遺傳相似系數(shù)為0.68時(shí)，可分為2個(gè)亞類。

3討論與結(jié)論

SCoT標(biāo)記是Collard等［10］開發(fā)的一種新型基因分子標(biāo)記技術(shù)，具有操作簡單、重復(fù)性好、遺傳信息豐富、多態(tài)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以作為其他分子標(biāo)記技術(shù)的有效補(bǔ)充［15］。SCoT分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于許多藥用植物種屬的遺傳多樣性分析中。程虎印等［16］采用 SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)對陜西產(chǎn)重樓屬 6 個(gè)類群 48 份樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示重樓屬植物在物種水平上具有較高的遺傳多樣性。馬利奮等［17］采用SCoT分子標(biāo)記對 17 個(gè)枸杞品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，聚類分析結(jié)果顯示可將17個(gè)枸杞品種分為3個(gè)群類。陳大霞等［18］采用 SCoT 分子標(biāo)記分析 4 種黃連屬藥用植物的遺傳多樣性，揭示出黃連屬藥用植物具有豐富的遺傳多樣性，種間存在高度的遺傳分化。

SCoT聚類分析顯示山蒟和風(fēng)藤為一類，說明這2個(gè)品種遺傳差異性小、親緣關(guān)系接近。這與蔡誠誠等［19］基于ITS序列分析的研究結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)藤與山蒟的同源性高達(dá)97.65%，在形態(tài)和化學(xué)成分組成上也具有較高的相似度。由于在進(jìn)行植物的遺傳多樣性分析時(shí)，所用材料的品種數(shù)量、樣品數(shù)量和采集區(qū)域等因素均會(huì)對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。該試驗(yàn)僅研究了31份胡椒屬藥用植物，在后續(xù)工作中應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步豐富材料來源和數(shù)量，從多個(gè)層面深入挖掘廣西胡椒屬藥用植物的遺傳信息，為胡椒屬藥用植物種質(zhì)資源保護(hù)與品種選育提供參考。

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