曾艷芬 吳泉明 周 歡 張秋琴 康艷麗 李 瑤 陳喜軍 黃建剛 陳發(fā)林

（1.福建省立醫(yī)院福建省臨床檢驗中心，福建 福州 350001；2.福建省立醫(yī)院檢驗科，福建 福州 350001）

新型冠狀病毒感染是引發(fā)新型冠狀病毒肺炎的病原體[1]，新型冠狀病毒核酸檢測是確定新型冠狀病毒感染的金標準。在實驗室進行新型冠狀病毒核酸檢測的過程中，存在試劑優(yōu)化不充分、批間差異大，以及結(jié)果假陰性等問題[2]。關(guān)于結(jié)果假陰性問題，除受檢測試劑的靈敏度和檢測體系的性能影響外，試劑的檢出限至關(guān)重要。《醫(yī)療機構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊（試行第二版）》[3]要求選擇國家藥品監(jiān)督管理部門批準的試劑，并在選擇標本采樣管和核酸提取試劑時，使用試劑盒說明書建議的配套標本采樣管和提取試劑；在用于臨床標本檢測前，實驗室應(yīng)對由提取試劑、提取儀和擴增試劑、擴增儀等組成的檢測系統(tǒng)進行性能驗證。但在實際工作中，多數(shù)實驗室的檢測體系均為非配套體系。本研究對上海之江生物科技股份有限公司新型冠狀病毒核酸檢測試劑的檢出限（200 拷貝/mL）在不同檢測體系中的性能進行驗證，以幫助實驗室提升新型冠狀病毒核酸檢測質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 標準物質(zhì)和檢測體系

標準物質(zhì)為中國計量科學(xué)研究院新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標準物質(zhì)（編號為NIM-RM5207，批號2102），具體賦值見表1。選擇4個檢測體系，均為自動提取儀（磁珠法）提取后進行逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴增的方法，其中體系1為配套體系，體系2、3、4為非配套體系，4個體系擴增試劑均為同一品牌產(chǎn)品，各體系中的儀器、試劑均取得國家藥品監(jiān)督管理局注冊證。

表1 新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標準物質(zhì)賦值

1.2 方法

1.2.1 檢出限驗證

用中國計量科學(xué)研究院新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標準物質(zhì)對4個檢測體系進行檢出限的性能驗證。由于所用標準物質(zhì)ORF1ab基因、N基因、E基因的濃度賦值不同，因此對3個基因分別進行驗證。驗證方法：分別使用各檢測體系病毒采樣管的保存液梯度稀釋標準物質(zhì)（以標準值計算）到試劑盒說明書標注的檢出限（200 拷貝/mL），每批重復(fù)測定5次，記錄檢測結(jié)果的陽性數(shù)，以100%檢出為驗證通過。

1.2.2 重新驗證

考慮到標準物質(zhì)賦值存在不確定度，按照標準值與不確定度的差值重新稀釋后進行驗證，方法和判斷標準同檢出限的驗證。觀察2次驗證均未通過的體系，修改提取程序，再次驗證。第1次和第2次驗證實驗使用優(yōu)化的核酸提取試劑，提取程序（提取程序1）見表2；第3次驗證實驗使用優(yōu)化前的核酸提取試劑，提取程序（提取程序2）見表3；第4次驗證實驗將步驟2作用時間改為15 min，其他步驟同提取程序1；第5次驗證實驗提前預(yù)熱儀器至70 ℃，確保步驟2的作用時間達4 min，步驟3重復(fù)3次，其他步驟同提取程序1。實驗方法和判斷標準同檢出限的驗證。

表2 提取程序1步驟

表3 提取程序2步驟

2 結(jié)果

2.1 檢出限驗證結(jié)果

4個檢測體系檢出限驗證結(jié)果顯示，非配套體系1通過驗證，配套體系和非配套體系2、3均未通過。見表4、圖1。

圖1 4個檢測體系標準值稀釋檢出限驗證結(jié)果擴增曲線

表4 4個檢測體系標準值稀釋檢出限驗證結(jié)果

2.2 重新驗證結(jié)果

2.2.1 第2次驗證實驗結(jié)果

未通過驗證的3個檢測體系以中國計量科學(xué)研究院新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標準物質(zhì)標準值與不確定度的差值稀釋驗證檢出限，結(jié)果顯示，配套體系和非配套體系2通過驗證，非配套體系3未通過。見表5、圖2。

圖2 3個檢測體系以標準值與不確定度差值稀釋檢出限驗證結(jié)果擴增曲線圖

表5 3個檢測體系以標準值與不確定度差值稀釋檢出限驗證結(jié)果

2.2.2 第3次驗證實驗結(jié)果

以中國計量科學(xué)研究院新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標準物質(zhì)的標準值與不確定度的差值稀釋驗證非配套體系3檢出限，結(jié)果顯示，使用提取程序2的第3次驗證實驗通過；更改提取程序的第4次、第5次實驗均未通過。見表6、圖3。

圖3 非配套體系3以標準值與不確定度的差值稀釋和更改提取程序后檢出限驗證結(jié)果擴增曲線

表6 非配套體系3以標準值與不確定度的差值稀釋和更改提取程序后檢出限驗證結(jié)果

表6（續(xù)）

3 討論

新型冠狀病毒核酸檢測是疫情防控的關(guān)鍵，檢測試劑的檢出限能否在相應(yīng)的檢測體系復(fù)現(xiàn)是控制假陰性結(jié)果的重要指標。目前，我國新型冠狀病毒核酸檢測實驗室所用檢測體系多為非配套體系，且各實驗室均存在多個非配套體系共用的情況。為了解配套與非配套檢測體系檢測性能的差異及其實際檢出能力，本研究選擇上海之江生物科技股份有限公司新型冠狀病毒核酸檢測試劑，依據(jù)說明書對1個配套體系和3個非配套體系的檢出限進行性能驗證。

本研究結(jié)果顯示，不同檢測體系檢測性能存在差異，對檢測結(jié)果，特別是低濃度樣本的檢測結(jié)果影響較大；4個檢測體系中，檢出能力最強的是非配套體系1，其次為配套體系和非配套體系2。配套體系檢出能力較非配套檢測體系差的原因可能為：1）新型冠狀病毒核酸檢測試劑審批的過程中，由于沒有充足的臨床樣本和體系性能確認時間，且早期國家標準物質(zhì)為純化后新型冠狀病毒核酸體外轉(zhuǎn)錄RNA，不能反映核酸提取效率，造成配套體系構(gòu)建不完整；2）新型冠狀病毒核酸檢測需求不斷加大，可能導(dǎo)致試劑生產(chǎn)所用原料、耗材和工藝發(fā)生改變，批間差異大；3）試劑生產(chǎn)廠商在構(gòu)建體系時無法對所有的儀器設(shè)備組合進行性能確認，存在未進行確認的設(shè)備組合性能更佳的可能。

比較本研究非配套體系3的2種提取程序，主要區(qū)別是步驟2由15 min降至4 min；步驟3由3次減至1次。步驟2主要完成細胞裂解、核酸釋放并結(jié)合至磁珠的過程，本研究提取程序1從步驟1到步驟2，儀器從室溫升至70 ℃需2～3 min，步驟2真正的作用時間只有1～2 min，導(dǎo)致細胞裂解不全、核酸釋放及磁珠結(jié)合不充分，降低了提取效率。查閱儀器說明書，發(fā)現(xiàn)并未對升降溫速度進行規(guī)定，而本研究發(fā)現(xiàn)，作用時間越短，升降溫的速率對實際作用時間造成的影響就越大。我們未查閱到核酸提取儀相關(guān)參數(shù)的生產(chǎn)標準，且2021年實施的《（自動）核酸提取儀校準規(guī)范》（JJF 1874—2020）[4]亦僅對溫度示值誤差、均勻性、穩(wěn)定性進行規(guī)定，未提及升降溫的速率，因此迫切需要相關(guān)部門出臺相關(guān)標準，規(guī)范核酸提取操作細節(jié)，指導(dǎo)實驗室和試劑生產(chǎn)廠商日常工作，保證核酸檢測的質(zhì)量。步驟3是洗滌的過程，通常需使用不同的洗滌液洗滌2～4次，分別去除無機鹽離子和蛋白、脂類等抑制物，達到純化的目的[5]，僅使用1種洗滌液洗滌1次，存在洗滌不充分、干擾物質(zhì)殘留導(dǎo)致提取效率降低和抑制后續(xù)擴增的可能。在疫情暴發(fā)流行期間，新型冠狀病毒核酸檢測樣本量大，要求出報告時間短，為加快速度，實驗室一般會通過減少裂解時間、洗滌或磁吸次數(shù)等方法縮短提取時間，通過減少逆轉(zhuǎn)錄和各個循環(huán)的時間，或添加加速劑等方法縮短擴增時間，給檢測體系的性能造成負面的影響，而檢出限本身就處于試劑分析敏感性的極限，任何環(huán)節(jié)的變化都可能對其產(chǎn)生較大的影響，因此實驗室不可為了縮短出報告時間，突破速度與質(zhì)量的平衡點，以犧牲質(zhì)量為代價換取速度的提升。

本研究比較了4個體系的加樣量，發(fā)現(xiàn)配套體系和非配套體系1、2的加樣量均為300 μL，非配套體系3的加樣量為200 μL，非配套體系3加樣量低于其他3個體系也可能是其第1、2次驗證未能通過的原因之一，因此實驗室在選擇提取試劑時應(yīng)考慮起始加樣量對檢測性能的影響。非配套檢測體系變量多，每個環(huán)節(jié)都會影響檢出限，實驗室在應(yīng)用非配套檢測體系之前，必須進行性能驗證，如未能通過，建議逐一梳理各個環(huán)節(jié)，如更換采樣管、更換提取試劑或優(yōu)化提取程序、優(yōu)化擴增程序，探索最佳檢測體系，保證檢驗質(zhì)量。另外，本研究性能驗證是在對所選檢測體系中的儀器設(shè)備進行維護保養(yǎng)、校準后進行的，但實際工作中，新型冠狀病毒核酸檢測實驗室日常工作量非常大，可能存在儀器設(shè)備長時間疲勞運轉(zhuǎn)而影響檢測性能的情況，提示實驗室工作越是繁重，越要關(guān)注儀器設(shè)備的運行狀態(tài)，加強日常維護保養(yǎng)和校準。

綜上所述，本研究選擇的新型冠狀病毒核酸檢測試劑在4個檢測體系中的檢出限驗證均能通過，但存在非配套檢測體系性能優(yōu)于配套體系的情況?？s短細胞裂解和核酸釋放與磁珠結(jié)合時間，減少核酸洗滌次數(shù)會影響試劑檢出限，實驗室不可為追求速度輕易更換檢測體系中的任一環(huán)節(jié)。相關(guān)機構(gòu)應(yīng)建立覆蓋核酸檢測全流程相關(guān)儀器設(shè)備生產(chǎn)校準標準，規(guī)范核酸檢測操作，指導(dǎo)實驗室和廠商日常工作。同時，實驗室應(yīng)關(guān)注加樣量、非配套體系的優(yōu)化和儀器設(shè)備的維護、保養(yǎng)、校準，保證檢驗質(zhì)量。