蓋林林 李海波 褚錦錦 孫家梅 閆心怡 杜金珂 代文清 徐棟花

（濰坊市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261000）

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的復(fù)雜性、慢性傳染病，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）全球結(jié)核病報(bào)告估算，全球約有1/3人口感染MTB；2019年，我國約有83.3萬新發(fā)結(jié)核病病例[1-2]。結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，患者臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征多樣，目前的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)主要包括分子生物學(xué)、細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)方法，在敏感性和特異性上均不能滿足臨床需求，因此迫切需要一種快速診斷結(jié)核病的方法[3]。結(jié)核病是MTB在細(xì)胞內(nèi)形成的一種遲發(fā)型過敏反應(yīng)（Ⅳ型），檢測(cè)MTB產(chǎn)生的特異性T淋巴細(xì)胞或可成為判斷感染的新思路[4]。本研究采用化學(xué)發(fā)光干擾素-γ釋放試驗(yàn)對(duì)濰坊地區(qū)183例肺結(jié)核確診患者和33名健康體檢者進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步探討該方法在肺結(jié)核快速診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年3月1日—2020年12月31日濰坊市人民醫(yī)院住院的肺結(jié)核患者183例，根據(jù)活動(dòng)性肺結(jié)核和非活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]分為活動(dòng)性肺結(jié)核組（109例）和非活動(dòng)性肺結(jié)核組（74例）。另選取同期維坊市人民醫(yī)院健康體檢者33名（對(duì)照組），均無結(jié)核病病史、家族感染史，近6個(gè)月無活動(dòng)性結(jié)核病患者密切接觸史等。所有研究對(duì)象均無人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染和嚴(yán)重的肝、腎功能損傷。本研究經(jīng)濰坊市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)法光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)檢測(cè)

采集所有研究對(duì)象外周血5 mL（盡量空腹）于肝素鈉抗凝真空管內(nèi)，充分顛倒混勻，16 h內(nèi)送檢。將全血混勻后分別添加到本底對(duì)照管（N）、測(cè)試培養(yǎng)管（T）、陽性對(duì)照培養(yǎng)管（P）中，每個(gè)培養(yǎng)管加入肝素鈉抗凝全血1 mL。將上述培養(yǎng)管顛倒混勻5～10次后，迅速放入37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（22±2）h，將培養(yǎng)后的肝素鈉抗凝全血以1 609×g離心10 min，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒購自廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，檢測(cè)儀器為Caris200全自動(dòng)化學(xué)免疫分析儀（廈門優(yōu)邁科醫(yī)學(xué)儀器有限公司），根據(jù)試劑盒說明書要求判定結(jié)果。

1.2.2 血常規(guī)檢測(cè)

采集所有研究對(duì)象外周血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用XN-2000全自動(dòng)血液分析儀（日本希森美康公司）及配套試劑檢測(cè)血常規(guī)。

1.2.3 結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)

所有研究對(duì)象均進(jìn)行結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)。接種結(jié)核菌素純蛋白衍生物（北京祥瑞生物制品有限公司）48～72 h后，觀察硬結(jié)大小，以硬結(jié)>5 mm為陽性。

1.2.4 T-SPOT TB試驗(yàn)

采集所有研究對(duì)象外周靜脈血5 mL，肝素抗凝，4 h內(nèi)分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌2次，計(jì)數(shù)并稀釋至2.5×105/mL；向包被特異性抗體的4個(gè)微孔中分別加入陰性對(duì)照（AIMV）、10 kD培養(yǎng)濾液蛋白（culture filtrate protein 10，CFP10）、6 kD早期分泌性抗原靶蛋白（early secretary antigenic target-6 kD，ESAT6）和陽性對(duì)照（植物血凝素）各50 μL，然后每孔加入稀釋的單個(gè)核細(xì)胞懸液100 μL，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱溫孵育16～20 h；洗板4次，再加入特異性抗體，4 ℃孵育1 h；洗板4次，加入顯色液，37 ℃孵育7 min，加入蒸餾水終止反應(yīng)；37 ℃烤箱10～20 min烤干，顯微鏡下計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：1）陰性孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)，A或B孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，判定為陽性；2）陰性孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)時(shí)，A或B斑點(diǎn)數(shù)≥2×陰性孔斑點(diǎn)數(shù)，判定為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率或例表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3個(gè)組一般資料比較

活動(dòng)性肺結(jié)核組、非活動(dòng)性肺結(jié)核組、對(duì)照組年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 3個(gè)組一般資料比較

2.2 3個(gè)組化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)結(jié)果

活動(dòng)性肺結(jié)核組化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)陽性率最高（92.66%），3個(gè)組陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 3個(gè)組化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 不同方法診斷肺結(jié)核的效能

化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)和T-SPOT TB試驗(yàn)診斷肺結(jié)核的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均高于結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)，但僅敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）?；瘜W(xué)發(fā)光干擾素-γ釋放試驗(yàn)敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均稍高于T-SPOT TB試驗(yàn)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 不同方法診斷肺結(jié)核的效能 %（例/例）

2.4 活動(dòng)性肺結(jié)核組干擾素-γ釋放試驗(yàn)陽性和陰性患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞百分比檢測(cè)結(jié)果比較

活動(dòng)性肺結(jié)核組化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)陽性和陰性患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

2019年，全球約有1 000萬結(jié)核病新增病例，且平均每年約有140萬例患者死于結(jié)核病[6-7]。我國居結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家的第3位，但近年來發(fā)病率呈逐漸下降的趨勢(shì)[7-9]。早期診斷和及時(shí)治療是控制MTB傳播的主要措施。干擾素-γ釋放試驗(yàn)是近20來年發(fā)展起來的檢測(cè)特異性T淋巴細(xì)胞的技術(shù)，主要以MTB特有的RD1基因編碼的ESAT6和CFP10作為刺激原來檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌干擾素-γ，因卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌無RD1基因，因此，該方法可有效區(qū)分卡介苗或大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。2006年，瑞士的抗腫瘤壞死因子α治療前結(jié)核病篩查指南[10]肯定了干擾素-γ釋放試驗(yàn)的作用，推薦對(duì)潛伏性結(jié)核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）患者可進(jìn)行預(yù)防性治療。2013年，美國開始采用干擾素-γ釋放試驗(yàn)篩查LTBI[11]。目前，已經(jīng)有16個(gè)國家將干擾素-γ釋放試驗(yàn)列入結(jié)核病臨床應(yīng)用指南，用于結(jié)核病的輔助診斷，WHO也建議使用結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)和干擾素-γ釋放試驗(yàn)用于結(jié)核病的篩查[12]。

目前，化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)因操作簡單，可在采血后24 h內(nèi)獲得結(jié)果，誤差小，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作等優(yōu)勢(shì)，成為臨床診斷MTB感染的主要方法。

本研究結(jié)果顯示，3種方法中，化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)的敏感性最高（92.66%），特異性為90.91% ，陽性預(yù)測(cè)值為97.12%，陰性預(yù)測(cè)值為78.95%。與王新寧等[13]和AI等[14]研究結(jié)果一致。本研究中，活動(dòng)性肺結(jié)核組有8例患者化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)檢測(cè)為陰性，分別為4例肺惡性腫瘤化療患者和1例咳嗽患者、1例乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者、1例骨質(zhì)疏松伴病理性骨折患者、1例肺炎性假瘤伴細(xì)支氣管炎患者，假陰性原因可能與樣本采集時(shí)間、機(jī)體發(fā)生細(xì)胞免疫反應(yīng)的時(shí)間、機(jī)體自身免疫力、淋巴細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量等因素有關(guān)[15]。陳誠等[16]發(fā)現(xiàn)，干擾素-γ釋放試驗(yàn)假陽性結(jié)果與陳舊性結(jié)核、肺癌等密切相關(guān)。本研究對(duì)照組中有3例假陽性，分別為1例肺惡性腫瘤術(shù)后、1例不明原因、1例既往感染者。提示對(duì)于化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)假陰性和假陽性結(jié)果，臨床應(yīng)根據(jù)各種輔助檢查和臨床癥狀綜合分析，以作出準(zhǔn)確診斷。

本研究結(jié)果顯示，化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)陰性與陽性活動(dòng)性肺結(jié)核患者之間外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與馬進(jìn)寶等[17]和LV等[18]的研究結(jié)果不一致，可能與患者個(gè)體差異和淋巴細(xì)胞具體的免疫功能不同有關(guān)。

本研究尚存在一定的局限性：1）樣本量相對(duì)較小，結(jié)果可能存在偏差；2）未對(duì)免疫功能受損患者進(jìn)行分析。

綜上所述，對(duì)于化學(xué)發(fā)光法干擾素-γ釋放試驗(yàn)陽性的患者，應(yīng)考慮結(jié)核病的可能。