倪曉琛 李佳楠 楊仕明 陳偉

解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部(北京 100853)

國(guó)家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(北京 100853)

聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京 100853)

聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京 100853)

MITF（microphthalmia-associated transcription factor）作為一種基礎(chǔ)螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLH-Zip)家族中的轉(zhuǎn)錄因子，其主要功能是調(diào)控基因的表達(dá)水平[1]。不僅可以參與調(diào)節(jié)神經(jīng)棘細(xì)胞的分化以及發(fā)育的過(guò)程，同時(shí)可以調(diào)節(jié)黑色素的合成。MITF突變可能導(dǎo)致多種不同的臨床綜合征[2,3]，其中以Waardenburg 綜合征（Waardenburg Syndrome，WS）最為多見(jiàn)。

WS是一種以聽(tīng)力色素異常為特征的顯性遺傳的綜合征性疾病，呈現(xiàn)高度外顯性，臨床特征具有明顯異質(zhì)性。其中以虹膜異色、前額白發(fā)、感音神經(jīng)性聾、以及內(nèi)眥異位為主要臨床表型特征。WS患者可以出現(xiàn)不同程度的感音神經(jīng)性聾，約占WS患者的90.2%[4]。其中以MITF為致病基因的WS 患者感音神經(jīng)性聾的發(fā)生率為89.6%[4]。WS 還可以表現(xiàn)出不同程度不同部位的色素異常，包括虹膜顏色，頭發(fā)，面部以及全身皮膚。

目前WS 臨床表型以及突變位點(diǎn)的相關(guān)性的研究局限于PAX3以及SOX10[5]。研究表明無(wú)義介導(dǎo)的mRNA 降解途徑（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）對(duì)截短蛋白的調(diào)控可以部分解釋臨床表型的異質(zhì)性。MITF突變導(dǎo)致WS 的原因同樣為單倍體劑量不足[6,7]。而目前有關(guān)MITF的相關(guān)研究尚未有明確報(bào)道。MITF是否也受到NMD 機(jī)制的調(diào)控，從而影響疾病的表型，仍需更多的研究探索。本研究擬采用meta 分析的方法，檢索目前已知的WS的MITF突變位點(diǎn)，并收集突變位點(diǎn)相關(guān)臨床表型，通過(guò)廣義估計(jì)方程（generalized estimating equations,GEE）對(duì)突變位點(diǎn)以及表型的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)估，探尋突變位點(diǎn)的突變規(guī)律，突變位點(diǎn)與臨床表型之間的相關(guān)性。

1 方法

1.1 建立MITF突變數(shù)據(jù)庫(kù)

1.1.1 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)

由兩名具有資質(zhì)相同的人員進(jìn)行文獻(xiàn)檢索。查找所有MITF為致病基因的WS 文獻(xiàn)，文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究中納入的人群為明確診斷為WS 的患者。WS的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：（2）已行基因檢測(cè)明確致病基因?yàn)镸ITF突變；（3）具有明確MITF的突變位點(diǎn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他有關(guān)遺傳性耳聾的致病基因；（2）報(bào)道中MITF并非新發(fā)致病性突變。

1.1.2 文獻(xiàn)檢索策略以及篩選過(guò)程

文獻(xiàn)檢索范圍從1995年至2021年11月10日，于PubMed，CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)檢索，使用檢索詞”Waardenburg syndrome”；“MITF”,“Waardenburg綜合征”；共檢索到247 篇文章，并由兩名研究人員依據(jù)文獻(xiàn)摘要進(jìn)行初步篩選，將可能符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)全文下載，閱讀全文并依據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行篩選。在初步選定的36篇文獻(xiàn)中，8篇文獻(xiàn)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)。1 篇文獻(xiàn)主要內(nèi)容為MITF突變致病機(jī)制的相關(guān)研究，其余7篇文獻(xiàn)中，有2篇文獻(xiàn)中患者攜帶除MITF外的其他遺傳性聾相關(guān)基因，5篇文獻(xiàn)中報(bào)道的致病性突變位點(diǎn)并未新發(fā)突變。故最終納入文獻(xiàn)共計(jì)28篇[8-35]。文獻(xiàn)檢索流程圖見(jiàn)圖1。

圖1 文獻(xiàn)檢索過(guò)程Fig.1 Flow Diagram

1.2 數(shù)據(jù)收集

收集納入文獻(xiàn)中患者的突變位點(diǎn)信息，納入數(shù)據(jù)庫(kù)中致病性突變位點(diǎn)共計(jì)34 例。并同時(shí)于ClinicalVariant數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行MITF致病性突變位點(diǎn)檢索，檢索到致病性突變位點(diǎn)共計(jì)53 例并納入數(shù)據(jù)庫(kù)。將納入數(shù)據(jù)庫(kù)中所有研究中的突變位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，利用MutationTaster[36]對(duì)突變位點(diǎn)編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化，參考MITF-205（NM_000248.4）編碼區(qū)堿基序列進(jìn)行編號(hào)。突變位點(diǎn)相同時(shí)則進(jìn)行合并。基于Ensembl 平臺(tái)[37]（https://www.ensembl.org/index.html）明確突變位點(diǎn)的功能區(qū)位置，以及突變基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列、可能影響的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。收集整理研究中WS患者的臨床表型以及聽(tīng)力學(xué)特征。

1.3 數(shù)據(jù)整理

突變類型：依據(jù)以下突變類型進(jìn)行分類：錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變、剪切突變、插入突變、缺失突變。

表型描述：依據(jù)研究中描述的臨床表型進(jìn)行描述以及分類。根據(jù)WS 表現(xiàn)出的主要臨床特征，大致分為三類，虹膜顏色改變（Heterochromia irides；Normal），皮膚色素異常改變，頭發(fā)顏色改變（Abnormality of the hair；Normal）。其中，進(jìn)一步將皮膚色素異常分類，分為面部雀斑（Freckles），皮膚脫色素白斑(hypopigmentation)，二者均有（Both），以及二者均無(wú)（None），共計(jì)四種類型。由于研究中多數(shù)患者均為重度感音神經(jīng)性耳聾，未進(jìn)一步描述聽(tīng)力學(xué)信息。

1.4 數(shù)據(jù)分析

若以突變位點(diǎn)進(jìn)行分組，各組中患者數(shù)量較少，易產(chǎn)生偏倚，故不適宜針對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行分組，故而采用突變基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及功能的改變分組，分析不同組間與臨床表型之間的相關(guān)性。依據(jù)MITF-M 蛋白的功能以及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[38]，將突變蛋白氨基酸改變,分為以下八種，DNA 結(jié)合閾的氨基酸替代（AA substitution in the DNA binding region，AA of DNA），HLH 結(jié)構(gòu)閾的AA 替代（AA substitution in the HLH region,AA of HLH），核定位信號(hào)的AA 替代（AA substitution in the Nuclear location signal(NLS)region,AA of NLS），缺失DNA結(jié)合閾（deletion of DNA binding region,deletion of HLH region,deletion of DNA），缺失HLH 結(jié)構(gòu)閾（deletion of HLH region,deletion of HLH），缺失核定位信號(hào)（deletion of the NLS region,deletion of NLS），缺失全部bHLH-Zip 結(jié)構(gòu)閾（deletion of the subtotal region,deletion of subtotal），以及未缺失bHLH-Zip 結(jié)構(gòu)閾（deletion of none of the above region,deletion of none）。家系中不同成員之間攜帶相同的致病基因突變位點(diǎn)，就不同致病位點(diǎn)而言，屬于重復(fù)多次測(cè)量資料，但是由于家系中各成員之間具有相關(guān)性，不具備Logistic 回歸的數(shù)據(jù)獨(dú)立性條件，故采用廣義估計(jì)方程（generalized estimating equations,GEE）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以SPSS17.0 軟件進(jìn)行GEE 數(shù)據(jù)分析。將不同突變蛋白中的氨基酸改變的類型作為自變量，臨床表型作為因變量進(jìn)行分析，比較分析不同的氨基酸改變與表型之間的關(guān)系。首先進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，將氨基酸改變這一自變量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，生成虛擬變量。導(dǎo)入所有數(shù)據(jù)后，進(jìn)行GEE 分析。設(shè)定患者編碼作為主變量?；跍?zhǔn)似然獨(dú)立準(zhǔn)則(quasi-likelihood under the independence model criterion,QIC)選定最佳矩陣模型，在本研究中采用獨(dú)立矩陣模型進(jìn)行分析。由于因變量屬于二分類數(shù)據(jù)，在回歸分析時(shí)采用二元回歸分析（Binary logistic）。選擇不同自變量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，研究不同氨基酸改變與表型之間的相關(guān)性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選結(jié)果

在進(jìn)行文獻(xiàn)檢索以及篩選納入過(guò)程后，共計(jì)納入文獻(xiàn)28 篇，收集MITF致病性突變位點(diǎn)共計(jì)34個(gè)。進(jìn)一步于ClinicalVariant 數(shù)據(jù)庫(kù)再次行MITF致病性突變位點(diǎn)檢索，并經(jīng)突變位點(diǎn)編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化后，最終建立包含58 個(gè)致病性突變位點(diǎn)的MITF突變數(shù)據(jù)庫(kù)。并進(jìn)一步收集到32個(gè)家系共計(jì)96名患者的臨床表型，包括虹膜顏色、皮膚色素改變、頭發(fā)顏色以及聽(tīng)力下降情況。

在58 例致病性突變位點(diǎn)中，以無(wú)義突變最多（21/58，36.2%），其次為錯(cuò)義突變（13/58，22.4%），移碼突變（13/58，22.4%），剪切位點(diǎn)改變（4/58，6.90%），內(nèi)含子替代（3/58，5.20%），缺失突變（2/58，3.40%），插入突變（2/58，3.40%）無(wú)義突變的突變位點(diǎn)分布較為均勻在各個(gè)外顯子中均可見(jiàn)無(wú)義突變，而錯(cuò)義突變多位于7，8 號(hào)外顯子（圖2）。以上外顯子均部分參與了MITF特征性結(jié)構(gòu)域bHLH的編碼。在突變位點(diǎn)的改變中則以單堿基改變?yōu)橹?，編碼的蛋白以截短蛋白最為多見(jiàn)。而錯(cuò)義突變的編碼氨基酸替代均在這一特征性結(jié)構(gòu)域中。這一結(jié)構(gòu)域中包含了DNA 結(jié)合域、MITF-M 的核定位信號(hào)（Nuclear location signal）以及二聚化的結(jié)合位點(diǎn)，乙?；男揎椢稽c(diǎn)。錯(cuò)義突變導(dǎo)致的氨基酸替代均發(fā)生在bHLH結(jié)構(gòu)中。

2.2 突變種類與表型的關(guān)系

依據(jù)突變基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)以及功能改變，將32個(gè)家系分為兩類，共計(jì)7組。

聽(tīng)力下降作為WS 的主要臨床特征，在96 名患者中，有75 名患者呈現(xiàn)出這一臨床特征，約占78%，與既往文獻(xiàn)報(bào)道中的89.6%的結(jié)果相近。其次為虹膜異色，約占66%。在這其中，以缺失核定位信號(hào)組出現(xiàn)比例最高。進(jìn)一步將GEE 分析結(jié)果匯總于表2。就虹膜異色而言，有四種突變類型與虹膜異色的出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；面部雀斑以及頭發(fā)顏色異常均只與一種突變類型的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；聽(tīng)力下降與氨基酸替換中的兩種類型的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，包括HLH結(jié)構(gòu)閾以及NLS的氨基酸改變。

表1 臨床表型匯總Table 1 Summary of clinical phenotypes

表2 統(tǒng)計(jì)結(jié)果匯總Table 2 Summary of statistical results

對(duì)于不同的突變類型來(lái)說(shuō)，當(dāng)突變類型為HLH 結(jié)構(gòu)閾的氨基酸替代時(shí)，與頭發(fā)顏色改變的出現(xiàn)呈現(xiàn)正相關(guān)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而與虹膜異色、面部雀斑、聽(tīng)力下降呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本研究通過(guò)建立MITF致病性突變數(shù)據(jù)庫(kù)，以GEE的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)一步探索并分析MITF致病性突變與臨床表型出現(xiàn)之間的關(guān)系。

研究結(jié)果顯示，突變基因編碼的截短蛋白與聽(tīng)力下降等均未見(jiàn)相關(guān)性。這可能與人體中的截短蛋白監(jiān)控機(jī)制相關(guān)，即無(wú)義介導(dǎo)的mRNA 降解（nonsense-mediated decay，NMD)。鑒于NMD 在人體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的重要作用以及對(duì)mRNA 質(zhì)量的監(jiān)控機(jī)制[39]，NMD 機(jī)制可以清除截短蛋白的mRNA，以減少截短蛋白的編碼，降低截短蛋白的負(fù)性效應(yīng)，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)遺傳性疾病的相關(guān)表型[39]。

本研究中的錯(cuò)義突變則與臨床表型的出現(xiàn)具有相關(guān)性，這一結(jié)果可能與MITF的作用過(guò)程以及作用特點(diǎn)相關(guān)。MITF致病性突變中錯(cuò)義突變位點(diǎn)大多位于MITF基因的外顯子7，8，均影響MITF蛋白的bHLH-Zip結(jié)構(gòu)閾。bHLH-Zip在MITF發(fā)揮作用的過(guò)程中具有十分重要的作用，主要參與蛋白質(zhì)的二聚化，包括同源以及異源二聚化。MITF只有在形成二聚體后才可以與DNA 結(jié)合，發(fā)揮功能[7]。就MITF-M 而言，其主要在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。因而核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS）在MITF-M 的作用過(guò)程中具有重要作用。MITF-M 在NLS 介導(dǎo)下，經(jīng)由核孔小體進(jìn)入細(xì)胞核中，與DNA結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用[38]。鑒于HLH、NLS 的重要作用，故當(dāng)錯(cuò)義突變位點(diǎn)位于以上結(jié)構(gòu)的編碼區(qū)時(shí)時(shí)，盡管未產(chǎn)生氨基酸數(shù)目的改變，但是影響了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，編碼蛋白質(zhì)出現(xiàn)功能異常，導(dǎo)致疾病相關(guān)表型的出現(xiàn)。

本研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，聽(tīng)力下降與位于NLS以及HLH 的錯(cuò)義突變具有相關(guān)性。這與MITF-M 在聽(tīng)力形成的重要作用密切相關(guān)。目前有關(guān)WS 發(fā)病機(jī)制的研究多認(rèn)為與神經(jīng)嵴細(xì)胞的異常遷移以及分化相關(guān)，尤其黑色素細(xì)胞的分化[40]，在黑色素細(xì)胞的相關(guān)調(diào)節(jié)通路中，大多通過(guò)MITF 將細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，進(jìn)而調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞的功能[41,42]。因而MITF在WS 致病機(jī)制中有著不可替代的作用。其中MITF-M 則是主要表達(dá)在黑色素細(xì)胞中的一種亞型[43]。MITF-M 不僅是黑色素細(xì)胞分化過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子，還影響黑色素合成過(guò)程中的多種基因的表達(dá)水平[44,45]，導(dǎo)致相關(guān)色素異常表型出現(xiàn)。MITF突變導(dǎo)致聽(tīng)力下降則與主要與中間細(xì)胞有關(guān)[46]。黑色素細(xì)胞在分化過(guò)程中遷移至內(nèi)耳血管紋中，形成中間細(xì)胞，與邊緣細(xì)胞以及基底細(xì)胞等其他種類細(xì)胞，共同組成血管紋，維持耳蝸內(nèi)電位的穩(wěn)定。研究表明影響血管紋中這三種主要細(xì)胞的突變基因可能通過(guò)影響耳蝸內(nèi)電位，使得耳蝸內(nèi)電位失衡，進(jìn)而導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡，最終出現(xiàn)聽(tīng)力損失。尤其中間細(xì)胞中的內(nèi)向回收鉀離子通道Kir4.1 在耳蝸內(nèi)電位的維持中有著必要的作用[47]。鑒于MITF在聽(tīng)力形成以及黑色素合成中的重要作用，當(dāng)發(fā)生錯(cuò)義突變后，MITF的功能以及結(jié)構(gòu)則會(huì)受到影響，導(dǎo)致臨床表型的出現(xiàn)。結(jié)合以上研究，我們有理由推測(cè)HLH 以及NLS 在MITF-M作用過(guò)程中的重要作用。但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

MITF突變后由于單倍體劑量不足導(dǎo)致WS 相關(guān)臨床表型的出現(xiàn)。但MITF在表達(dá)過(guò)程中受到多種正向以及負(fù)向調(diào)控，這些調(diào)控途徑能否通過(guò)調(diào)節(jié)MITF表達(dá)水平而影響疾病表型仍需研究[48]。故而對(duì)于同一家系而言，患者出現(xiàn)不同的表型可能與多種調(diào)節(jié)途徑相關(guān)。

本研究也具有一定的局限性。首先MITF數(shù)據(jù)庫(kù)的建立過(guò)程中，未將患者的人群以及種族納入考慮范圍。因?yàn)椴煌娜巳阂约胺N族之間，相關(guān)臨床表型的出現(xiàn)具有一定的差異。如面部雀斑則更易在亞洲人群當(dāng)中出現(xiàn)。而在本研究納入的人群中，亞洲人群較多，故可能存在一定的偏倚；其次突變類型之間納入的患者數(shù)量具有一定的差異，會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。盡管在數(shù)據(jù)分析時(shí)，采用的GEE方程進(jìn)行分析，對(duì)各類型包含的患者數(shù)量不具有要求，但是錯(cuò)義突變的患者數(shù)量較少，可能具有一定程度的局限性；最后在進(jìn)行表型分析時(shí)，由于一些明確突變位點(diǎn)的患者未獲取到表型信息，所以未納入進(jìn)一步的研究中。而在這些人群中，較多突變屬于錯(cuò)義突變，可能會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)分析造成一定影響，進(jìn)而產(chǎn)生偏倚。盡管我們研究中表明特定位置的突變類型與一些臨床表型相關(guān)，但是這些表型出現(xiàn)的過(guò)程中不僅僅受到MITF的調(diào)控，還受到其他多種基因的調(diào)控。

本研究中，我們對(duì)MITF的突變位點(diǎn)與臨床表型之間的相關(guān)性進(jìn)行了初步分析，得出了表型與突變位點(diǎn)之間的初步分析結(jié)果，即致病性突變中錯(cuò)義突變影響MITF的特征性結(jié)構(gòu)閾bHLH-Zip 編碼區(qū)從而影響MITF蛋白的功能，導(dǎo)致疾病的出現(xiàn)。bHLH-Zip 結(jié)構(gòu)閾中包含的DNA 結(jié)合域，NLS 等重要結(jié)構(gòu)，在蛋白的作用過(guò)程中有著重要意義。尤其NLS 有著重要作用。位于NLS 以及HLH 編碼區(qū)的錯(cuò)義突變，與WS中聽(tīng)力下降的出現(xiàn)具有相關(guān)性。