韓善浩, 李建輝, 祝玉婷, 高宏偉, 董 波,3??

(1. 中國海洋大學海洋生命學院 海洋生物遺傳與育種教育部重點實驗室, 山東 青島 266003; 2. 青島海關檢測技術中心, 山東 青島 266114; 3. 中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 山東 青島 266003)

惡性腫瘤嚴重威脅著人類的生命健康。在中國,癌癥發(fā)病率和死亡率一直在上升[1]。死亡率最高的癌癥為肺癌,其次是肝癌和胃癌[2]。腫瘤的治療方法主要有手術療法、放射療法以及化學藥物療法。其中化學藥物療法的成效已初步顯現(xiàn),腫瘤患者的生存時間明顯增長。但對于一些死亡率較高的癌癥,化學藥物仍具有毒副作用大、治療效率低、腫瘤細胞易耐藥等問題。因此,尋求高效、毒性小、特異性強的抗腫瘤化學藥物成為解決癌癥疾病的當務之急[3]。

海鞘作為被囊動物,在生物進化史上處于無脊椎動物到脊椎動物的進化節(jié)點[4]。由于其多樣性和廣泛的適應性,決定了海鞘次級代謝產(chǎn)物的結構新穎性和功能多樣性[5]。第一個在海鞘中發(fā)現(xiàn)的具有活性的化合物為香葉醇對苯二酚,具有抗白血病的細胞毒性[6]。此后,越來越多海鞘來源的天然活性化合物被報道,包括生物堿、多肽、聚酮、醌類以及甾體等物質(zhì),表明海鞘具有極大的藥用挖掘價值[7],是海洋天然活性產(chǎn)物的重要來源[8]。從海鞘(Trididemnumsolidum)中分離得到的環(huán)肽Didemnin B在1984年進入一期臨床試驗階段,成為第一個進入臨床研究的海洋藥物[9]。Didemnin B具有環(huán)狀脫氫肽的新穎結構,對多種腫瘤細胞具有細胞毒性,此外還具有抗病毒的生物功能[10]。Didemnin B通過抑制蛋白質(zhì)的生物合成來產(chǎn)生細胞毒性及免疫抑制作用[11]。而在這之后,又從加勒比海海鞘(Ecteinascidiaturbinate)中分離得到Ecteinascidin 743(ET-743),該化合物屬于生物堿,具有廣譜的抗癌活性,被稱為海洋藥物史上里程碑式的發(fā)現(xiàn)之一[12]。ET-743具有獨特的作用機制,在體外能夠抑制轉(zhuǎn)錄依賴的核苷酸切除修復途徑,以及通過影響細胞周期來促進非p53途徑依賴的細胞凋亡[13]。在臨床上ET-743也顯示出較高的應用價值[14]。

真海鞘屬于脊索動物門、尾索亞門、海鞘綱[15]。主要分布于日本海南鹿半島以北以及韓國東、南海岸。由于其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),例如二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、類胡蘿卜素、?；撬?、血漿原和其他微量營養(yǎng)素等[16],日本、韓國和中國都開展了真海鞘的人工養(yǎng)殖[17]。近年來,在真海鞘中發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的真海鞘內(nèi)囊酶解物[18]、抗微生物的血細胞凝集素等[19]。但關于真海鞘抗腫瘤活性的天然小分子報道甚少,且缺乏作用機制方面的研究工作[20]。

本研究采用真海鞘為原料,以乙醇為介質(zhì)提取真海鞘根索及被囊中的天然活性產(chǎn)物。利用硅膠柱層析、液相層析等方法對其進行分離純化,并利用腫瘤細胞系研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

真海鞘采于山東省榮成市尋山集團。高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和1X磷酸緩沖鹽溶液(PBS)均購買于Biological Industries (Israel)。噻唑藍(MTT)試劑盒購買于Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。有機試劑均購買于國藥。薄層層析(TLC)所用硅膠制備板來自默克。硅膠來自于青島海洋化工集團。HepG2細胞來自中國海洋大學陳西廣教授實驗室,HeLa細胞和L929細胞來自中科院上海細胞庫,HT-1080細胞來自中國海洋大學實驗中心。細胞培養(yǎng)所用耗材包括96孔細胞培養(yǎng)板(Thermo Fisher,167008)、24孔細胞培養(yǎng)板(CORNING,3524)、6孔細胞培養(yǎng)板(Thermo Fisher,140675)和細胞培養(yǎng)瓶(Thermo Fisher,156367)。

1.2 活性物質(zhì)制備與純化

1.2.1 真海鞘根索和被囊乙醇提取物的制備 解剖取真海鞘根索和被囊,破碎機打碎約40目,將碎屑在95%乙醇中震蕩浸泡1周。

1.2.2 硅膠柱層析 乙酸乙酯-石油醚體系作為流動相。將乙醇提取物原液拌于200～300目硅膠中。待樣品干于硅膠中后進行干法裝柱。最下端為300～400目硅膠,高度約為40 cm,上層為樣品,最上層為60～80目硅膠用于緩沖。裝好層析柱之后,使用極性較小的石油醚對硅膠柱進行浸潤。浸潤完成后依次采用洗脫劑石油醚∶乙酸乙酯=1∶3(800 mL)、1∶2(400 mL)、1∶1(200 mL)、甲醇(500～700 mL)進行洗脫,得到ST-Ⅱ。采用二氯甲烷-甲醇體系進行制備型薄層層析(PLC)。將ST-Ⅱ點于默克制備型硅膠板上,流動相條件為二氯甲烷∶甲醇=30∶1。層析結束后得到目的樣品。

1.2.3 制備液相純化 以色譜級甲醇(國藥)、純水為流動相,流動相極性由小到大(甲醇含量逐漸減小)進行分離條件的摸索,在甲醇∶水=7∶3時對ST-Ⅱ-Ⅱ的分離效果最佳。制備時每次進樣量為200 μL,按照各樣品出峰時間手動接樣。制備液相所用色譜柱為Kromasil C18反向色譜柱,液相型號為日立L-2000型液相。

1.2.4 化合物的結構解析1H NMR譜,1H-1H COSY譜均來自BRUKER AVANCE III HD 600 MHz核磁共振波譜儀。約1 mg樣品加入含有0.03%四甲基硅烷(Tetramethylsilane,TMS)的氘代DMSO,混合均勻,裝入核磁管中待測,室溫測定。NMR譜圖通過Bruker Topspin 4.0.8及Mest Re Nova9.0.1軟件處理。

1.3 體外活性及機理研究

1.3.1 細胞培養(yǎng) HeLa細胞和HepG2細胞均使用含15%胎牛血清(BI)和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。L929細胞使用含15%胎牛血清(Gibco)和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞在提供95%空氣,5%二氧化碳的37 ℃培養(yǎng)箱(Thermo scientific)中培養(yǎng)。

1.3.2 MTT(噻唑藍)比色法 采用MTT體外檢測法檢測ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)Ω骷毎档脑鲋骋种坡蔥21]。將各細胞系種在96孔板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,待細胞的密度長到60%左右時吸去舊培養(yǎng)液,加入含有不同濃度ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液。繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)48 h后吸去舊培養(yǎng)液,加入配置好的MTT染液,MTT染液由90%無血清的DMEM培養(yǎng)基和10%的MTT染液組成。37 ℃孵育4 h后吸去染液,每孔加入100 μL DMSO,37 ℃孵育5 min后在490 nm吸光度下檢測對照組和實驗組的吸光度值,并計算增殖抑制率。

1.3.3 DAPI細胞核染色 使用4,6-二脒基-乙-苯基吲哚(DAPI)染細胞核,觀察細胞核形態(tài)的方法作為細胞凋亡的一種指標[22]。將HepG2細胞種在6孔板上,6孔板底部放置一片細胞爬片,使HepG2細胞爬片,便于后續(xù)拍照,37 ℃孵育24 h。待細胞密度達到孔的60%～70%后,吸去舊的培養(yǎng)液,加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液。之后37 ℃孵育24 h,取出細胞爬片,放置于載玻片上,DAPI染色后封片,激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM-900)拍照。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI染色檢測細胞凋亡 將HepG2細胞種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實驗組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,然后37 ℃再次孵育24 h。用胰蛋白酶消化細胞并收集于EP管中后,加入染料,避光染色15 min,隨后置于冰浴中。1 000 r/min離心去除染液,加入適量PBS重懸細胞,使用流式細胞儀(貝克曼庫爾特Cyto FLEX)檢測對照組和實驗組凋亡細胞比例。

1.3.5 細胞活性氧(ROS)檢測 將HepG2種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實驗組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,再次37 ℃孵育24 h。使用DCFH-DA探針染色15 min。15 min后,使用不含血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌染料3次。洗滌完成后,板中加入適量PBS緩沖液,倒置于熒光顯微鏡(品牌:尼康)拍攝。

1.3.6 細胞線粒體膜電位檢測 將HepG2接種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實驗組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,再次37 ℃孵育24 h。使用JC-1探針對HepG2細胞進行染色,染色時在37 ℃培養(yǎng)箱中染色20 min。使用JC-1染色緩沖液洗滌2次,隨后孔內(nèi)加入適量PBS緩沖液防止細胞干燥。最后采用酶標儀(Tecan Infinite E Plex)檢測熒光強度。JC-1單體采用490 nm激發(fā)波長,530 nm發(fā)射波長。JC-1聚合物采用525 nm激發(fā)波長,590 nm發(fā)射波長。

1.3.7 Western Blot檢測 將HepG2接種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實驗組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,37 ℃再次孵育24 h。孵育完成后,用胰蛋白酶消化細胞,并收集于EP管中。隨后裂解細胞提取蛋白。蛋白提取完成后,上樣進行SDS-PAGE電泳。電泳完成后,濕法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后,使用5%脫脂牛奶封閉1 h。隨后將一抗按照1∶500比例稀釋后4 ℃過夜孵育。一抗孵育完成后,將PVDF膜(默克)取出,使用TBST清洗3次,每次15 min。二抗按照1∶1 000比例稀釋后在室溫下孵育1 h。二抗孵育完成后,再次在TBST中清洗3次,每次15 min。清洗完成后,顯色拍照。

2 結果

2.1 真海鞘根索被囊乙醇提取物活性物質(zhì)的分離與活性驗證

真海鞘的構造可以分為3部分:外部包圍著一層堅硬的殼,呈橙紅色;殼頂部有生殖根;殼內(nèi)部為其身體組織,呈橙色(見圖1A)。

(A. 真海鞘成體及其3個組成部分;B. 根索和被囊乙醇提取物與內(nèi)囊乙醇提取物對HepG2細胞的細胞毒性,2組實驗組濃度均為200 μL/mL ,對照組加入含有與實驗組等量乙醇的培養(yǎng)液,p<0.001,0.01

首先本文作者使用95%乙醇提取根索被囊以及內(nèi)囊中的天然活性產(chǎn)物。利用MTT比色法檢測兩部分的乙醇提取物是否具有細胞毒性。MTT比色法檢測結果表明根索被囊乙醇提取物對HepG2細胞具有極強的細胞毒性,內(nèi)囊乙醇提取物對HepG2細胞具有較弱的細胞毒性(見圖1B)。同時根索被囊乙醇提取物對L929細胞的毒性較小(見圖1C)。采用硅膠柱層析分離根索被囊乙醇提取物得到兩部分,第一部分命名為ST-Ⅰ,第二部分命名為ST-Ⅱ。MTT比色法檢測結果表明ST-Ⅱ?qū)epG2細胞具有較強的細胞毒性(見圖1D)。

2.2 ST-Ⅱ的分離與活性驗證

得到ST-Ⅱ后,采用PLC法,在二氯甲烷∶甲醇=30∶1的情況下對ST-Ⅱ進行分離得到9個組分(見圖2A)。MTT比色法對HepG2細胞的細胞毒性檢測結果表明,在加樣濃度為50 μg/mL、作用時間為48 h時,第二組樣品的細胞毒性較為明顯(見圖2B),并將其命名為ST-Ⅱ-Ⅱ。對小鼠成纖維細胞L929的MTT比色法實驗結果表明,ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)ζ錈o明顯細胞毒性(見圖2C)。同時本文作者選擇發(fā)病率和死亡率較高的癌癥細胞系-人宮頸癌細胞系HeLa細胞、人纖維肉瘤細胞系HT1080細胞、人乳腺癌細胞系MCF-7細胞和人肝癌細胞系HepG2細胞,來檢測ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)λ鼈兊募毎拘?結果表明,100 μg/mL濃度下,ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)eLa細胞、MCF-7細胞和HepG2細胞均顯示出細胞毒性,其中HepG2細胞對ST-Ⅱ-Ⅱ最為敏感(見圖2D)。后續(xù)實驗均利用HepG2細胞進行實驗。

(A. PLC分離ST-Ⅱ得到1～9組組分;B. PLC分離ST-Ⅱ得到的9組組分(ST-Ⅱ-Ⅰ～ST-Ⅱ-Ⅸ)對HepG2細胞的增殖影響,實驗組濃度均為50 μg/mL,對照組加入含有與實驗組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,0.001

2.3 ST-Ⅱ-Ⅱ的分離與活性驗證

確定ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)Π┘毎哂卸拘院?使用UPLC-MS/MS檢測發(fā)現(xiàn)ST-Ⅱ-Ⅱ含有多種具有生物活性的天然產(chǎn)物。為了進一步確定ST-Ⅱ-Ⅱ中的有效活性化合物,使用制備液相對ST-Ⅱ-Ⅱ進行分離。結果表明,在甲醇∶水=7∶3的條件下,得到了9個組分(見圖3A)。隨后對這9組分進行了活性驗證,在30 μg/mL的濃度下,第Ⅸ組分對HepG2細胞的毒性最強(見圖3B),其他組分活性較弱或沒有生物活性。在10 μg/mL濃度下,ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ和紫杉醇對癌細胞增殖抑制率處于同一水平。同時ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ對正常細胞L929無明顯細胞毒性(見圖3C)。以上結果表明ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ是ST-Ⅱ-Ⅱ中導致細胞毒性的主要組分。

(A. HPLC分離ST-Ⅱ-Ⅱ得到的9個組分;B. HPLC分離ST-Ⅱ-Ⅱ得到的9個組分的活性驗證,實驗組濃度均為30 μg/mL,對照組加入含有與實驗組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,p<0.001,0.01

2.4 ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的結構鑒定

2.5 ST-Ⅱ-Ⅱ誘導HepG2細胞凋亡

以上結果表明海鞘根索被囊乙醇提取物的主要活性為組分為ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ,但實驗中ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ制備得率極低?；赟T-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ是ST-Ⅱ-Ⅱ中的主要活性組分(見圖3B),本研究后續(xù)利用ST-Ⅱ-Ⅱ進行作用機制實驗。

為了研究ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)epG2增殖抑制作用機制,本研究中使用Annexin V-FITC/PI染色,DAPI細胞核染色以及細胞凋亡抑制劑Nicotiflorin確認添加ST-Ⅱ-Ⅱ是否導致HepG2細胞凋亡。Annexin V-FITC/PI染色結果說明,在濃度為70 μg/mL時,作用24 h后,凋亡細胞的比例較對照組有明顯提高(見圖5A)。DAPI細胞核染色實驗組細胞核有了較明顯的形態(tài)變化。與對照組相比,實驗組細胞核呈現(xiàn)不規(guī)則形狀,有核裂解情況發(fā)生(見圖5B)。細胞凋亡抑制劑Nicotiflorin與ST-Ⅱ-Ⅱ共同作用后,凋亡細胞比例顯著減少(見圖5C)。以上結果說明添加ST-Ⅱ-Ⅱ后引起HepG2細胞顯著凋亡。

(A.ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的核磁氫譜(1H NMR);B. ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的1H-1H COSY譜。 A. 1H NMR of ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ; B.1H-1H COSY spectrum of ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ.) 圖4 ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的結構鑒定

2.6 ST-Ⅱ-Ⅱ通過線粒體凋亡途徑引起HepG2細胞凋亡

為了進一步研究ST-Ⅱ-Ⅱ引起HepG2細胞凋亡的作用機制,本文作者進行了線粒體膜電位、細胞ROS以及線粒體凋亡途徑相關蛋白表達情況的檢測。在ST-Ⅱ-Ⅱ作用濃度為70 μg/mL,作用時間24 h后,HepG2細胞的ROS水平顯著升高(見圖6A),線粒體膜電位顯著降低(見圖6B)。ST-Ⅱ-Ⅱ處理后,HepG2細胞中促細胞凋亡蛋白p53和Bax表達水平顯著升高,而抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2表達量顯著降低(見圖6C)。以上結果表明,海鞘根索被囊乙醇提取物通過線粒體凋亡通路引起HepG2細胞凋亡。

(①ST-Ⅱ-Ⅱ+Nicotiflorin. A. AV/PI染色檢測ST-Ⅱ-Ⅱ作用后早期凋亡細胞的比例,實驗組濃度為70 μg/mL,對照組加入含有與實驗組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,0.001

(A. ST-Ⅱ-Ⅱ作用后HepG2細胞相關ROS水平,實驗組濃度為70 μg/mL,對照組加入含有與實驗組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,倒置熒光顯微鏡拍攝及相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計,0.001

3 討論

本研究通過硅膠柱層析、PLC和HPLC等方法從真海鞘根索及被囊中分離得到具有抑制腫瘤細胞增殖的天然活性組分。采用制備液相分離ST-Ⅱ-Ⅱ后得到高效抑制HepG2細胞增殖的ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ組分。由于樣品制備得率極低,無法制備足夠量的ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ,不能對其進行完整核磁圖譜檢測,只檢測了氫譜和1H-1H COSY譜,結合質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析,推測ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ為硬脂酸與二取代苯環(huán)酯化后形成的一類結構新穎的化合物。此構效關系與姜酚類活性產(chǎn)物類似。姜酚類活性產(chǎn)物具有抗腫瘤功效,并且其苯環(huán)所帶碳鏈越長,抗腫瘤作用越顯著[23]。另外也有多不飽和脂肪酸能夠引起人源癌細胞鐵死亡的報道[24]。通過本研究推測的結構同樣為二取代苯環(huán)加長碳鏈結構。所以在此結構或結構類似物的基礎上,可能存在著高效的抗腫瘤天然活性產(chǎn)物。

ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ無法制備得到更多樣品,但ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ組分占ST-Ⅱ-Ⅱ的40%左右(見圖3A),且ST-Ⅱ-Ⅱ的抗腫瘤活性集中在ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ組分,所以本研究中用ST-Ⅱ-Ⅱ進行作用機制的分析。結果發(fā)現(xiàn)ST-Ⅱ-Ⅱ抑制人肝癌細胞(HepG2)增殖的機制是誘導細胞凋亡。細胞凋亡也稱為細胞程序性死亡,是細胞通過死亡來減少細胞增殖或?qū)毎鸇NA損傷做出反應的一種機制[25]。細胞凋亡主要通過兩種途徑(線粒體信號通路和死亡受體信號通路)來實現(xiàn),而在線粒體信號通路控制的細胞凋亡中,Bcl-2蛋白家族起了非常關鍵的作用[26]。本文作者進一步研究發(fā)現(xiàn)ST-Ⅱ-Ⅱ能夠促使HepG2細胞活性氧水平升高,線粒體膜電位降低,線粒體凋亡通路中的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量降低,促凋亡蛋白Bax、p53蛋白的表達量升高,所以證實ST-Ⅱ-Ⅱ通過線粒體凋亡通路誘導HepG2細胞的凋亡。線粒體是細胞的能量中心,是有氧呼吸的主要場所[27]。多種疾病都與線粒體有關,如帕金森病[28],糖尿病等[29]。此外,線粒體參與凋亡調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導等,被認為是治療癌癥的一個重要靶點[30]。因此,ST-Ⅱ-Ⅱ通過線粒體通路誘導癌細胞凋亡,表明ST-Ⅱ-Ⅱ具有較強的抗腫瘤活性,本研究中的發(fā)現(xiàn)為該化合物在癌癥治療中的進一步研究提供理論依據(jù)。

到目前為止,越來越多來源于海鞘的天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn),其中的功能也各有異同。一些天然產(chǎn)物來源于海鞘本身,另一些來自海鞘的共生微生物。生物堿類物質(zhì)是在海鞘及其共生微生物中發(fā)現(xiàn)的最多的天然化合物種類[7]。來源于海鞘(Aplidiummeridianum)本身的生物堿類化合物Meridianins[31]是多種蛋白激酶的抑制劑。已經(jīng)應用于臨床的生物堿類化合物ET-743來源于海鞘的共生微生物Ca.E. frumentensis[32]。關于ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ是來源于真海鞘自身還是來源于其共生微生物這個問題目前還不清楚,后續(xù)工作將會提高ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ制備得率,來確定其結構及來源。真海鞘根索及被囊中天然活性產(chǎn)物的報道極少,本研究結果表明,真海鞘根索及被囊中含有高效的抗腫瘤天然活性產(chǎn)物,具有廣闊的開發(fā)應用前景。

致謝：感謝中國科學院上海藥物研究所譚昌恒老師對核磁圖譜以及化合物解析方面的指導。感謝中國海洋大學醫(yī)藥學院王長云老師,邵長倫老師給予的實驗上的指導以及實驗儀器上的幫助。感謝中國海洋大學食品學院徐杰老師給予的實驗儀器上的幫助。