趙立平，孫艷秋，張菲菲

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濱州 256600

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian carcinoma，EOC）占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的1/4，占卵巢癌全部病理類型的80%～90%，據(jù)統(tǒng)計，全球每年新增卵巢癌確診例數(shù)約22 萬例。由于卵巢癌患者確診時多已進展至晚期，患者對治療的反應(yīng)較差，易復發(fā)，病死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首。近年來，卵巢癌發(fā)病率顯著增高，并呈現(xiàn)年輕化趨勢，且5年生存率為35%～57%[1]。研究普遍認為，mRNA 翻譯異?？纱龠M腫瘤的發(fā)生發(fā)展，真核翻譯起始因子（eukaryotic translation initiation factor，eIF）4F 的組裝是帽依賴相關(guān)翻譯的限速步驟，且eIF4F 與多種惡性腫瘤患者的預后不良及耐藥相關(guān)。eIF4F 是由帽子結(jié)合蛋白eIF4E、大腳手架蛋白eIF4G 和DEAD-box 的RNA 解旋酶eIF4A 組成，其中eIF4A 是eIF4F 中含量最多的亞基，具有RNA依賴的腺苷三磷酸酶（adenosine triphosphatase，ATPase）和RNA 解螺旋酶活性，在mRNA 翻譯起始的帽依賴翻譯及惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。eIF4A 在胃癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、肝細胞癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中過表達，有研究發(fā)現(xiàn)，eIF4A 在宮頸癌中過表達，且下調(diào)eIF4A 的表達可顯著抑制宮頸癌細胞存活、增殖，并促進其凋亡[3]；沉默eIF4A基因能夠延遲腫瘤細胞DNA 雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）修復，從而提高宮頸癌對放療的敏感性。Liang 等[4]研究認為，eIF4A 可能是增加宮頸癌放療敏感性的一個有希望的靶點。近年來，eIF4A 作為腫瘤治療的靶點已成為研究的熱點，多種靶向eIF4A 的小分子抑制劑已經(jīng)在臨床前模型中得到證實，但有關(guān)eIF4A 與EOC 關(guān)系的報道較少。本研究通過檢測eIF4A 蛋白在EOC 組織中的表達，分析其與患者臨床特征的關(guān)系，探討其在EOC 的發(fā)生、發(fā)展及預后中的作用，為未來EOC 的靶向治療及預后評估提供有價值的參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6月至2016年6月在濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院進行手術(shù)治療的疑似EOC 患者。納入標準：①均經(jīng)組織病理學檢查確診；②均為首次手術(shù)；③病歷資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②非原發(fā)性、非上皮性卵巢癌；③嚴重的內(nèi)科功能性或器質(zhì)性病變。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入168 例疑似EOC 患者，經(jīng)確診，其中EOC 123 例，交界性卵巢癌30 例，卵巢良性病變15 例，另選取非卵巢疾病患者20 例（因婦科疾病需部分或全部切除卵巢，且術(shù)后病理證實無卵巢疾?。?23 例EOC 患者年齡34～65 歲，中位年齡49 歲，≤50 歲52 例，＞50 歲71 例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期34 例，Ⅲ～Ⅳ期89 例；世界衛(wèi)生組織（WHO）組織學分級：高中分化（G1～2級）50 例，低分化（G3級）73 例；病理類型：漿液性囊腺癌84 例，黏液性囊腺癌39 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59 例；有腹腔積液84 例，無腹腔積液39 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 治療和隨訪方法

早期EOC 患者（FIGO 分期為Ⅰ～ⅡA 期）給予卵巢癌根治術(shù)，晚期EOC 患者（FIGO 分期為ⅡB～Ⅳ期）給予腫瘤細胞減滅術(shù)，術(shù)后除1 例（FIGO 分期為ⅠB 期，組織學分級為G1級）患者未行化療外，其余均給予鉑類+紫杉醇聯(lián)合化療6 個療程以上。

采用定期電話隨訪的方法對123 例EOC 患者進行隨訪，隨訪時間自患者出院至2021年12月，記錄患者的生存情況。

1.3 免疫組化法檢測eIF4A 蛋白的表達情況

取123 例EOC 組織、30 例交界性卵巢癌組織、15 例卵巢良性病變組織和20 例正常卵巢上皮組織，采用免疫組化鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法檢測eIF4A 蛋白的表達情況。采用兔抗人eIF4A 多克隆抗體（稀釋濃度為1∶50）作為一抗，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：在顯微鏡下于每張切片的邊緣及中央各取5 個高倍視野，計算100 個細胞中陽性細胞所占比例取平均值，陽性細胞所占比例＜5%計0分，5%～24%計1 分，25%～49%計2 分，50%～74%計3 分，≥75%計4 分；eIF4A 蛋白主要定位于細胞質(zhì)，無著色計0 分，淺黃色染色計1 分，黃色染色計2分，棕黃色染色計3 分。將陽性細胞所占比例評分和染色強度評分相乘，≤3 分為（-），4～5 分為（+），6～8 分為（++），9～12 分為（+++），≤5 分判定為eIF4A 低表達，≥6 分為eIF4A 高表達。

1.4 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測eIF4A 基因擴增情況

選取免疫組化中eIF4A 蛋白高表達組織及10例正常卵巢組織的石蠟切片進行FISH，eIF4A 探針為eIF4A/17 號染色體探針，為雙色探針，用OLYMPUS BX51 熒光顯微鏡在4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）/FITC/TR 三色濾光鏡激發(fā)下，觀察間期細胞熒光雜交信號并用軟件進行分析，eIF4ADNA 探針作為檢測探針雜交到17 號染色體17p13，熒光信號為紅色四甲基羅丹明，17 號染色體的熒光信號為綠色，正常細胞為單個細胞核中紅綠信號各2 個，eIF4A基因擴增異常細胞為單個細胞核中紅信號＞2 個，規(guī)定紅/綠比值＞2.5 為eIF4A基因擴增[5]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗；EOC 患者預后的影響因素采用Cox 比例風險回歸模型分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢組織中eIF4A1 蛋白表達情況的比較

eIF4A 蛋白主要定位于細胞質(zhì)，細胞質(zhì)呈棕黃色染色為陽性表達，其在不同卵巢組織中的表達情況見圖1。正常卵巢上皮組織、卵巢良性病變組織、交界性卵巢癌組織及EOC 組織中，eIF4A 蛋白高表達率依次升高，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=57.316，P＜0.05）；進一步分析發(fā)現(xiàn)，EOC 組織中eIF4A 蛋白高表達率高于交界性卵巢癌組織、卵巢良性病變組織和正常卵巢上皮組織，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=14.200、29.260、38.080，P＜0.05）；交界性卵巢癌組織中eIF4A蛋白高表達率高于卵巢良性病變組織和正常卵巢上皮組織，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=5.410、7.640，P＜0.05）；卵巢良性病變組織與正常卵巢上皮組織中eIF4A 蛋白高表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.044，P=0.834）（表1）。

圖1 eIF4A蛋白在不同卵巢組織中的表達情況（SP染色，×400）

2.2 不同臨床特征EOC 患者EOC 組織中eIF4A蛋白表達情況的比較

123 例EOC 患者EOC 組織中，eIF4A 蛋白高表達93 例，低表達30 例。不同年齡、病理類型EOC患者EOC 組織中eIF4A 蛋白表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；FIGO 分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學分級為G3級、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有腹腔積液EOC 患者EOC 組織中eIF4A 蛋白高表達率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織學分級為G1～2級、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無腹腔積液的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖2、表2）

表2 不同臨床特征EOC 患者EOC 組織中eIF4A 蛋白表達情況的比較（n=123）

圖2 EOC組織中eIF4A蛋白的表達情況（SP染色，×400）

2.3 eIF4A 基因擴增情況

123 例EOC 患者EOC 組織中，eIF4A 蛋白高表達93 例，低表達30 例。免疫組化法檢測eIF4A 蛋白（++）和（+++）的患者比例分別為43.01%（40/93）和56.99%（53/93）；FISH 檢測eIF4A基因的擴增與免疫組化法檢測eIF4A 蛋白（++）和（+++）的符合率分別為40.00%（16/40）和39.62%（21/53）。（圖3）

圖3 正常卵巢上皮組織和EOC組織中eIF4A基因擴增FISH圖

2.4 89 例Ⅲ～Ⅳ期EOC 患者EOC 組織中eIF4A 蛋白表達情況與化療反應(yīng)的關(guān)系

將化療后完全緩解與部分緩解的患者視為化療有效，將疾病穩(wěn)定與疾病進展患者視為化療無效，比較89 例Ⅲ～Ⅳ期EOC 患者EOC 組織中eIF4A蛋白低表達（n=16）和eIF4A 蛋白高表達（n=73）患者的化療有效率，結(jié)果顯示，eIF4A 蛋白低表達患者的化療有效率為56.25%（9/16），高于eIF4A 蛋白高表達患者的24.66%（18/73），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.198，P=0.013）。

2.5 預后情況的比較

截至2021年12月，123 例EOC 患者失訪8 例，隨訪率為93.50%（115/123）。30 例eIF4A 蛋白低表達EOC 患者的中位總生存期為58 個月（95%CI：52.01～63.99），93 例eIF4A 蛋白高表達患者的中位總生存期為49 個月（95%CI：45.44～52.56）；eIF4A蛋白低表達患者的5年總生存率為45.8%，明顯高于高表達患者的28.8%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.815，P=0.003）（圖4）。89 例Ⅲ～Ⅳ期EOC 患者復發(fā)45 例，未控（指腫瘤持續(xù)或進展）15 例，緩解29例，其中復發(fā)和未控EOC 患者EOC 組織中eIF4A蛋白高表達55例，緩解EOC患者EOC組織中eIF4A蛋白高表達18 例；復發(fā)和未控EOC 患者EOC 組織中eIF4A 蛋白高表達率為91.67%（55/60），明顯高于緩解患者的62.07%（18/29），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.615，P=0.001）。

圖4 eIF4A蛋白高表達（n=93）與eIF4A蛋白低表達（n=30）EOC患者的生存曲線

2.6 EOC 患者預后的影響因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，年齡、病理類型均可能與EOC 患者的預后無關(guān)（P＞0.05）；組織學分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腹腔積液情況、術(shù)后病變殘余情況、eIF4A 蛋白表達情況均可能與EOC患者的預后有關(guān)（P＜0.05）。Cox 比例風險回歸模型分析結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學分級為G3級、術(shù)后病變殘余均是EOC 患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。（表3）

3 討論

eIF4A 蛋白是相對分子質(zhì)量最小的、最先被發(fā)現(xiàn)為翻譯起始因子的DEAD-box RNA 解旋酶家族原型成員，既具有RNA 解螺旋酶活性，又具有RNA 依賴的ATP 酶活性。eIF4A 在人類體內(nèi)以eIF4A1、eIF4A2、eIF4A3 三種形式存在，eIF4A1 蛋白（其基因位于17p13[6]）和eIF4A2 蛋白（其基因位于18p11.2[7]）主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)并且有高達90%的同源性，主要作用是參與蛋白質(zhì)翻譯起始階段對核糖體的募集；而eIF4A3 蛋白則主要存在于細胞核，參與RNA 代謝過程。本研究在蛋白水平上的研究限于細胞質(zhì)中的蛋白，因技術(shù)所限無法進一步區(qū)分eIF4A1 蛋白、eIF4A2 蛋白而統(tǒng)稱為eIF4A 蛋白。eIF4A 在生長活躍的細胞中高表達，抑制eIF4A 的表達可抑制腫瘤細胞的遷移[8]。Nishida 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，eIF4A 在急性髓細胞性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）中過表達，且通過羅欣替尼靶向抑制eIF4A 能誘導抗AML 作用，并證實了相關(guān)信號通路的存在。目前，eIF4A與EOC 的關(guān)系仍處于初期研究階段，對eIF4A 進行深入、廣泛的研究，有助于探索EOC 的轉(zhuǎn)移機制，為EOC 的治療提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，EOC 組織中eIF4A 蛋白高表達率更高，提示其過表達與卵巢上皮細胞失控性增殖和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。eIF4A 蛋白高表達率在卵巢良性病變組織、交界性卵巢癌組織及EOC組織中逐漸升高，表明EOC 發(fā)生發(fā)展的過程是連續(xù)的，交界性卵巢癌是卵巢上皮細胞惡變不可或缺的階段；雖然eIF4A 蛋白高表達率在卵巢良性病變組織與正常卵巢上皮組織之間無明顯差異，但eIF4A 蛋白在卵巢良性病變組織中有一定程度的高表達，提示eIF4A 過表達在卵巢病變早期即存在，這與臨床醫(yī)師對卵巢良性上皮性腫瘤盡早行手術(shù)治療的觀點相一致。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學分級為G3級EOC 患者EOC 組織中eIF4A 蛋白高表達率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織學分級為G1～2級的患者，與Thompson 等[10]的研究結(jié)果相符，該研究證實，eIF4A 能上調(diào)蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）蛋白的表達及活性，并激活雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）/Notch 信號通路，促進腫瘤細胞的黏附和侵襲，因此推測eIF4A 高表達的患者更易發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ISH 檢測eIF4A基因的擴增與免疫組化法檢測eIF4A 蛋白（++）和（+++）的符合率分別為40.00%（16/40）和39.62%（21/53），符合率較低，但值得肯定的是，eIF4A 蛋白高表達的EOC 組織中存在eIF4A基因擴增，這與Shuda 等[11]的肝細胞癌中eIF4AmRNA 的相對表達量上升了1.2～1.7 倍相一致；此外，Gao 等[12]通過高通量基因表達數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中eIF4AmRNA 的相對表達量明顯高于正常胃壁組織。人17 號染色體上含有多個已知及未知的癌基因和抑癌基因，鄭淑芳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞株SKVO3 及OV2 中存在17 號染色體上基因的擴增，造成這種基因擴增的原因可能有兩種：①17 號染色體拷貝數(shù)增加；②某一基因本身擴增。本研究應(yīng)用存在于17 號染色體上的eIF4A基因與17 號染色著絲粒共雜交，排除了染色體本身擴增導致的目的基因的擴增。而免疫組化與FISH 結(jié)果一致率較低的原因也可能有兩種：①本研究樣本量過少；②eIF4A1 和eIF4A2 主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，并且有高達90%的同源性，免疫組化染色結(jié)果可能是eIF4A1 和eIF4A2 共同作用的結(jié)果。本研究未證實eIF4A2基因的擴增，也無法證實二者在EOC 中各自作用的大小，下一步研究將擴大樣本量，尋找eIF4A2基因探針，進一步分析eIF4A1及eIF4A2基因在EOC 中的表達、作用及與患者預后的關(guān)系。

本研究隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)，eIF4A 低表達患者的5年總生存率為45.8%，高于高表達患者的28.8%；89例Ⅲ～Ⅳ期EOC 患者中，復發(fā)和未控患者EOC 組織中eIF4A 蛋白高表達率為91.67%，明顯高于緩解患者的62.07%，與Gao 等[12]和Sridharan 等[14]的研究結(jié)果相符。Gao 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，eIF4A1 高表達與胃癌患者的高TNM 分期、低分化及不良預后顯著相關(guān)。Sridharan 等[14]研究顯示，在紫杉醇耐藥的三陰性乳腺癌細胞中，eIF4A 酶活性增加。Hashimoto等[15]研究證實，在胰腺導管癌中，eIF4A1 抑制劑——西藜蘆醇（Silvestrol）能夠與eIF4A1結(jié)合并抑制其基因活性，進而抑制下游的二磷酸腺苷核糖基化因子6（adenosine diphosphate ribosylation factor 6，ARF6）和MYC 的表達，增加其對程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）免疫治療的敏感性，這為EOC 的靶向治療提供了新的思路和方法，具體的方法和作用機制尚有待進一步研究。

本研究多因素分析結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學分級為G3級、術(shù)后病變殘余均是EOC患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），盡管未能證實eIF4A 表達是EOC 患者預后的獨立影響因素，但能證明eIF4A 蛋白過表達能促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，未來可進一步增加樣本量并采取多種隨訪方式進行更深入的研究探討，并且國外已有一些實驗證實了靶向抑制或沉默eIF4A基因能有效抑制腫瘤的發(fā)生。研究顯示，eIF4A 抑制劑——西藜蘆醇可增加乳腺浸潤性導管癌細胞T-47D 對放療的敏感性[16]；CR-31 介導的eIF4A 抑制劑可以抑制胰腺導管癌細胞的生長，提高患者的生存率并避免全身毒性[17]；沉默黑色素瘤WM858 細胞中的eIF4A1，可顯著抑制其增殖和侵襲[18]；羅卡格拉茨已被證明在體內(nèi)和體外均可使mRNA 結(jié)合到eIF4A1 和eIF4A2，并增強其抗腫瘤活性[19]；但遺憾的是，上述這些研究尚未成功應(yīng)用于臨床。

綜上所述，eIF4A 參與了卵巢上皮組織由正常-良性病變-交界性腫瘤-癌的漸進過程，且EOC 患者預后與FIGO 分期、組織學分級、術(shù)后病變殘余情況有關(guān)，eIF4A 高表達者的總生存率明顯降低，eIF4A 有望成為EOC 靶向治療及預后評估的分子標志物。