陳榮玲，陳惠琴，殷超，胡爾西丹·伊麻木，熱合巴提·努爾夏提

作者單位：1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830017；2中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊830011

蒔蘿子種子含有4%～6%［1-2］揮發(fā)油，是常用的民間藥，具有溫脾腎，開胃，散寒，行氣，消腫止痛，除腹脹，止腹痛等功效，主治濕寒性和黏液質(zhì)性疾病，如關(guān)節(jié)腫痛，腹脹腹痛，經(jīng)水不下，小便不利、防治病菌傳播等［3-5］。揮發(fā)油和油脂具有擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)，降低血脂，降低血壓，抗動(dòng)脈硬化，同時(shí)還有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)血液細(xì)胞新陳代謝，雙向調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)，增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力，雙向調(diào)節(jié)血糖、延緩衰老，防治老年斑、黃褐斑等作用［6-9］。本研究旨在蒔蘿子揮發(fā)油、油脂的提取，2021年6月至2022年3月采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）研究分析蒔蘿子藥材中揮發(fā)油和脂肪酸的化學(xué)成分，建立一種簡(jiǎn)易、靈敏、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)方法［10-15］。通過比較揮發(fā)油及脂肪酸的抗氧化活性，篩選其主要生物活性成分［16-19］，有望為蒔蘿子的質(zhì)量評(píng)價(jià)、藥理作用的深入研究及進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑蒔蘿子（新疆）、石油醚（60～90 ℃，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）、無水甲醇分析純、氫氧化鉀、無水硫酸鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）、抗壞血酸（天津市百世化工有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器Agilent 7890A－5975C 型氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；傅立葉變換紅外光譜儀（賽默飛公司）；Spectra Max M5-酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）；N-1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器廠）；DFY-500 搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺林大機(jī)械公司）；JD-2003 型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1蒔蘿子揮發(fā)油、油脂提取工藝 揮發(fā)油：蒔蘿子藥材烘干粉碎→過篩（60 目）→稱取50 g 粉末→加蒸餾水→浸泡24 h→調(diào)節(jié)溫度→調(diào)節(jié)揮發(fā)油提取器提取6～8 h→揮發(fā)油。油脂：蒔蘿子藥材烘干后粉碎→過篩（60 目）→稱取50 g 粉末→用濾紙筒包裹置于索氏提取器中→調(diào)節(jié)溫度→加入90%石油醚75 mL→脫脂4 h→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去溶劑→油脂。揮發(fā)油∕油脂提取率（%）=（實(shí)際提取的量∕藥材的量）×100%。

1.3.2GC-MS 分析 樣品甲酯化：1.0 mL 提取物于容量瓶（10 mL）→加入2 mL 石油醚-甲醇溶液→加入2 mL 氫氧化鉀-甲醇溶液→振搖→加蒸餾水定容至刻度→靜止分層→吸取上清液至試管中→加入無水硫酸鈉干燥→靜止分層→過濾→吸取上清液。分析條件：HP-INNOWAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；起始溫度為100 ℃，保持2 min，以10 ℃∕min升溫至200 ℃，再以5 ℃∕min升溫至260 ℃，保持10 min；載氣為氦氣；流速為1.0 mL∕min；進(jìn)樣口溫度為260 ℃；進(jìn)樣量0.2 μL；分流比50∶1；電離方式為EI；電離能量為70 eV；離子源發(fā)生器溫度為230 ℃；質(zhì)量掃描范圍為30～350 m∕z，全離子掃描。

1.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.4.1DPPH 清除能力測(cè)定 1 mL 0.2 mmol∕L DPPH-乙醇溶液1 mL 不同濃度的樣品溶液混合，在黑暗處反應(yīng)30 min，并在517 nm 處測(cè)定吸光度。以維生素C（VC）為陽性對(duì)照，按以下公式計(jì)算清除率：DPPH 自由基清除率（%）=［A0-（Ai-Aj）］∕A0×100%（Ai為樣品組吸光度；Aj為對(duì)照組吸光度；A0為空白組吸光度）。

1.4.2ABTS 自由基清除能力測(cè)定 將7 mmol∕L ABTS 乙醇溶液與2.45 mmol∕L 過硫酸鉀溶液等體積混合得到ABTS自由基試劑。并用乙醇稀釋，調(diào)整其在734 nm 處測(cè)定吸光度為0.7 左右。取1 mL ABTS自由基試劑與3 mL不同濃度的樣品溶液混合，黑暗處反應(yīng)10 min，并在517 nm處測(cè)定吸光度。以VC為陽性對(duì)照，按以下公式計(jì)算清除率：ABTS 自由基清除率（%）=［A0-（Ai-Aj）］∕A0×100%（Ai為樣品組吸光度；Aj為對(duì)照組吸光度；A0為空白組吸光度）。

2 結(jié)果

2.1 蒔蘿子揮發(fā)油、油脂提取率揮發(fā)油提取中選取最佳條件，料液比1∶4，溫度94.5 ℃，提取時(shí)間8 h，經(jīng)3次平行測(cè)定，得提取率為（5.850±0.141）%。稱取20 g藥材粉末，用索氏提取器加入90%石油醚75 mL脫脂4 h，經(jīng)3 次平行測(cè)定，得油脂提取率（13.168±0.117）%。數(shù)據(jù)滿足評(píng)價(jià)指標(biāo)要求，結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。

2.2 蒔蘿子揮發(fā)油、油脂組成成分分析

2.2.1蒔蘿子揮發(fā)油化學(xué)成分分析 取蒔蘿子揮發(fā)油1 μL，用GC-MS 聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（NIST11.L）檢索，選擇匹配度高于85 的峰，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對(duì)分析，得出了蒔蘿子揮發(fā)油的各化學(xué)成分，按峰面積歸一化計(jì)算各峰面積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表1。從蒔蘿子揮發(fā)油中鑒定出19 種化學(xué)成分。主要包括單萜類9 種（29.471%），黃酮類4 種（61.418%），醇類3 種（0.165%），芳香烴類及其他3種（0.39%）。

表1 蒔蘿子揮發(fā)油的組成（匹配度≥85）及相對(duì)百分含量

2.2.2蒔蘿子脂肪酸化學(xué)成分分析 取蒔蘿子脂肪酸1 μL，用GC-MS 聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（NIST11.L）檢索，選擇匹配度高于85 的峰，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對(duì)分析，得出了蒔蘿子揮發(fā)油的各化學(xué)成分，按峰面積歸一化計(jì)算各峰面積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。從蒔蘿子提取的甲酯化溶液中鑒定出16 種化學(xué)成分，其中脂肪酸9 主種，包括十六烷酸甲酯（1.78%）、棕櫚酸乙酯（0.66%）、亞油酸甲酯（5.58%）、順式亞油酸（5.58%）、十八碳六烯酸甲酯（56.73%）、硬脂酸甲酯（0.72%）、亞麻酸乙酯（2.06%）、縮水甘油棕櫚酸酯（1.56%）、（Z）-9-十八烯酸（0.56%）。

表2 蒔蘿子油脂的組成（匹配度≥85）及相對(duì)百分含量

2.3 抗氧化活性

2.3.1DPPH 自由基清除能力 DPPH 自由基清除能力是以VC 為陽性對(duì)照，進(jìn)樣量分別為20、40、60、80、100 mg∕L，經(jīng)3次平行測(cè)定，并代入DPPH 自由基清除率公式，結(jié)果見表3，在允許的誤差范圍之內(nèi)。

表3 蒔蘿子揮發(fā)油、油脂DPPH自由基清除能力測(cè)試結(jié)果及誤差分析∕%

通過函數(shù)繪圖軟件繪制DPPH 自由基清除率與濃度之間的關(guān)系圖，如圖1所示，蒔蘿子揮發(fā)油和油脂的清除DPPH 能力與濃度呈正相關(guān)。在低濃度時(shí)蒔蘿子油脂清除自由基能力比揮發(fā)油的高，當(dāng)濃度在70 mg∕L 以上時(shí)揮發(fā)油的清除自由基能力更高。蒔蘿子揮發(fā)油的IC50值（半抑制濃度）為42.963 mg∕L，蒔蘿子油脂的IC50值（半抑制濃度）為28.430 mg∕L，陽性對(duì)照VC 的IC50 值（13.946 mg∕L）。表明，蒔蘿子油脂有較高的DPPH自由基清除能力。

圖1 蒔蘿子揮發(fā)油、油脂1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力

2.3.2ABTS自由基清除能力 ABTS自由基清除能力是以VC為陽性對(duì)照，進(jìn)樣量分別為20、40、60、80、100 mg∕L，經(jīng)3次平行測(cè)定，并代入ABTS自由基清除率公式，結(jié)果見表4所示，在允許的誤差范圍之內(nèi)。

表4 蒔蘿子揮發(fā)油、油脂ABTS自由基清除能力測(cè)試結(jié)果及誤差分析∕%

通過函數(shù)繪圖軟件繪制ABTS 自由基清除率與濃度之間的關(guān)系圖，如圖2所示，蒔蘿子揮發(fā)油和油脂的清除ABTS 能力與濃度呈正相關(guān)。在低濃度時(shí)蒔蘿子油脂清除自由基能力比揮發(fā)油的高，當(dāng)濃度在50 mg∕L 以上時(shí)揮發(fā)油的清除自由基能力更高。蒔蘿子揮發(fā)油的IC50值（半抑制濃度）為21.129 mg∕L，蒔蘿子油脂的IC50 值（半抑制濃度）為9.722 mg∕L，陽性對(duì)照VC 的IC50值（6.029 mg∕L）。表明，蒔蘿子油脂有較高的ABTS自由基清除能力。

圖2 蒔蘿子揮發(fā)油、油脂2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）自由基清除能力

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蒔蘿子揮發(fā)油主要含有黃酮類化合物（61.418%）及萜類化合物（29.471%），是抗氧化、抗腫瘤以及動(dòng)脈硬化的主要活性成分。蒔蘿子油脂脂肪酸含量豐富，主要由油酸甲酯（5.58%）、順式亞油酸（5.58%）、十八碳六烯酸甲酯（56.73%）組成?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，提取物具有較高的清除自由基（DPPH、ABTS）能力，且與濃度呈正相關(guān)，具有較高的藥用活性。其在醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)中開發(fā)為天然抗氧化劑和抗動(dòng)脈硬化等保健品前景較廣。