杜倩倩，張鐵軍，謝冬梅, 3，張 偉, 3，汪天明, 3，孫葉芬，岳倩俠，楊 爽，馬 磊，俞年軍, 3，曹 勇

基于指紋圖譜結(jié)合化學模式識別法對不同種質(zhì)白芍質(zhì)量評價

杜倩倩1，張鐵軍2，謝冬梅1, 3，張 偉1, 3，汪天明1, 3，孫葉芬1，岳倩俠1，楊 爽1，馬 磊4，俞年軍1, 3*，曹 勇5, 6*

1. 安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012 2. 天津藥物研究院，天津 300301 3. 省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012 4. 安徽普康中藥資源有限公司，安徽 亳州 236800 5. 中藥提取安徽省技術(shù)創(chuàng)新中心，安徽 亳州 236800 6. 安徽濟人藥業(yè)股份有限公司，安徽 亳州 236800

采用指紋圖譜與化學模式識別方法，以質(zhì)量標志物（quality marker，Q-Marker）為指標，評價不同種質(zhì)白芍的質(zhì)量。采用HPLC法，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，柱溫30 ℃，體積流量1 mL/min，檢測波長230 nm；繪制40批白芍樣品的指紋圖譜，結(jié)合相似度分析、聚類分析（cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法（orthogonal partial least square，OPLS-DA）等化學模式識別技術(shù)，對不同種質(zhì)的白芍樣品進行質(zhì)量評價。從質(zhì)量傳遞與溯源，植物親緣性及化學成分的特有性、有效性及可測性等方面對白芍Q-Marker的選擇進行了分析，推測白芍中芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、兒茶素、沒食子酰芍藥苷、1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖和沒食子酸可作為白芍的Q-Marker。以40批白芍HPLC指紋圖譜標定白芍的Q-Marker，相似度在0.892～1.000；聚類分析初步區(qū)分出了不同種質(zhì)的白芍，四川中江、浙江杭州和河北安國的白芍樣品質(zhì)量較為相近；PCA和OPLS-DA結(jié)果顯示，篩選出的Q-Marker可作為不同種質(zhì)白芍的特征化學成分；對Q-Marker進行含量測定，結(jié)果不同種質(zhì)樣品間差異較大；TOPSIS分析結(jié)果表明山西運城的白芍質(zhì)量排名最高，人工培育的雜花白芍質(zhì)量排名最低。通過指紋圖譜結(jié)合化學模式識別技術(shù)，以白芍Q-Marker為評價指標能較為全面地反映白芍的質(zhì)量，可以為白芍優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的選育和育種提供參考。

白芍；種質(zhì)資源；質(zhì)量標志物；HPLC；指紋圖譜；沒食子酸；氧化芍藥苷；兒茶素；芍藥內(nèi)酯苷；芍藥苷；沒食子酰芍藥苷；PGG；苯甲酰芍藥苷；化學模式識別

白芍為毛茛科植物芍藥Pall.的干燥根，有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功能[1]，是中醫(yī)臨床常用的大宗藥材之一。現(xiàn)代藥理研究表明，白芍有免疫調(diào)節(jié)[2]、抗炎[3]、肝臟保護[4]、心血管保護[5]、腦保護[6]和神經(jīng)保護[7-8]等作用，臨床用于治療多種自身免疫性疾病[9-10]、肝損傷[11-13]、帕金森病[14-15]和抑郁癥[16-17]等。近年，山東省菏澤市、安徽省亳州市、浙江省磐安縣及四川省中江縣等已成為我國藥用白芍的主要產(chǎn)區(qū)[18-19]。白芍的質(zhì)量問題一直深受重視，產(chǎn)地[20]、加工[21]、種質(zhì)[22]及硫熏[23]等是造成市場上白芍藥材質(zhì)量良莠不齊的主要因素。目前，人工栽培是滿足白芍市場需求的主要途徑，經(jīng)長期栽培后，白芍的遺傳特性發(fā)生明顯變異，形成了各個產(chǎn)地的不同種質(zhì)[24-25]。種質(zhì)是影響中藥材質(zhì)量和產(chǎn)量的重要因素[26]，選育優(yōu)良品種是提高白芍質(zhì)量和產(chǎn)量的有效途徑?，F(xiàn)行白芍的質(zhì)量評價及質(zhì)量控制方法多是以芍藥苷作為指標，但中藥材具有化學成分復雜、多成分協(xié)同作用的特點，單一的指標可能難以反映白芍的內(nèi)在品質(zhì)。

中藥質(zhì)量是中藥有效性、安全性的關(guān)鍵因素，是中藥臨床療效的根本保證[27-29]。由劉昌孝院士[30]提出的中藥質(zhì)量標志物（quality marker，Q-Marker）以整體觀為指導，有利于使中藥變得更加安全有效、質(zhì)量可控且機制明確。王倩等[31]通過比較白芍、赤芍的功能主治、化學成分、藥理作用的異同，認為白芍、赤芍中所含有的單萜及其苷類及鞣質(zhì)類成分較為活躍，可作為預測白芍、赤芍Q-Marker的主要選擇對象。徐佳新等[32]總結(jié)了白芍的化學成分、藥理作用和質(zhì)量控制方法的研究進展，從質(zhì)量傳遞與溯源，植物親緣性及化學成分的特有性、有效性及可測性等方面對白芍Q-Marker的選擇進行了分析，推測白芍中芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-pentagalloylglucose，PGG）和沒食子酸等化合物可作為白芍的Q-Marker。

本課題組前期利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、計算機模擬分子對接技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學和體外炎癥模型等研究，初步篩選出芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、兒茶素、PGG和沒食子酸8種成分作為白芍的Q-Marker。指紋圖譜是實現(xiàn)鑒別中藥真實性、評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式，能較全面地反映藥材所含化學成分的相對關(guān)系[33-35]，指紋圖譜結(jié)合化學模式識別技術(shù)能夠科學、有效地反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量[36-37]。本研究初步篩選出來的白芍Q-Marker為指標，利用指紋圖譜結(jié)合化學模式識別技術(shù)評價不同種質(zhì)白芍的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

Agilent Infinity 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），PALL Cascada III超純水一體化系統(tǒng)（美國PALL公司），CP214型1/1萬電子天平（美國OHAUS公司），AE240型1/10萬電子天平（美國Mettler-Toledo公司）；高速多功能打粉機（上海賽耐機械有限公司）；AS30600BT型系列超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試劑

沒食子酸（批號C17D10C105977，質(zhì)量分數(shù)≥98%），兒茶素（批號P21J11F118380，質(zhì)量分數(shù)≥98%），芍藥內(nèi)酯苷（批號DST190120-071，質(zhì)量分數(shù)≥91.4%），PGG（批號G16M11L113433，質(zhì)量分數(shù)≥99%），苯甲酰芍藥苷（O11G1B163260，質(zhì)量分數(shù)≥99%），沒食子酰芍藥苷（P16A11S111470，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購于上海源葉生物科技有限公司；芍藥苷（批號110736-201842，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購于中國食品藥品檢定研究院，氧化芍藥苷（批號21092304，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈（瑞典OCEANPAK，色譜純）；磷酸（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，色譜純）；超純水、蒸餾水（自制）。

1.3 藥材

基因型決定藥用植物合成次生代謝產(chǎn)物，而環(huán)境條件影響其次生代謝產(chǎn)物合成的數(shù)量[38]。本研究將不同種質(zhì)白芍的種苗集中栽培，在排除栽培環(huán)境因素的條件下評價其質(zhì)量，為種質(zhì)篩選和種苗繁育奠定基礎(chǔ)。2016年，分別收集安徽亳州、四川中江、山東菏澤、山西運城、浙江杭州、河北安國和四川成都的藥用芍藥的芽頭，采用芽頭繁殖的方式，在安徽省亳州市譙城區(qū)十河鎮(zhèn)試驗田進行統(tǒng)一栽培管理。2021年9月對以上藥材進行采樣。此外，采集相同生長年限的安徽亳州試培育品種“雜花芍藥”，即農(nóng)戶人工培育的新品種。本實驗所用白芍藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學俞年軍教授鑒定為毛茛科植物芍藥Pall.的干燥根。40批藥材信息見表1。

2 方法

2.1 色譜條件

安捷倫ZORBAX Eclipse Plus-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～5 min，9% B；5～8 min，9%～15% B；8～23 min，15%～25% B；23～28 min，25%～35% B；28～35 min，35%～90% B。體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長230 nm，進樣量10 μL，進樣前在其初始條件下平衡5 min。

表1 白芍采樣情況

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 樣品采集回實驗室，洗凈后置于沸水中煮至透心，撈出，去皮，60 ℃烘干。將干燥品打粉過四號篩（65目）。

精密稱定本品粉末0.5 g，倒入25 mL的量瓶中，加稀乙醇15 mL，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，制成供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酰芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、PGG和沒食子酸對照品適量，加入甲醇（色譜純）溶液，超聲30 min（功率240 W、頻率45 kHz），使其溶解完全后振蕩搖勻，制成沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、PGG和苯甲酰芍藥苷質(zhì)量濃度分別為0.154、0.127、0.121、0.720、0.985、0.132、0.210、0.209 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍 精密吸取混合對照品溶液適量，用甲醇溶液稀釋制成不同濃度的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，平行進樣3次，測得峰面積。以各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），求得回歸方程，繪制標準曲線，見表2。結(jié)果表明，各待測成分在相應質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗 取S1樣品粉末，照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件連續(xù)進樣6次分析，結(jié)果沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、PGG和苯甲酰芍藥苷8個成分的相對保留時間的RSD分別為0.35%、0.22%、0.27%、0.12%、0.12%、0.11%、0.19%和0.01%，峰面積的RSD分別為0.84%、2.83%、0.79%、0.96%、2.08%、0.87%、2.72%、0.38%，RSD均＜3%，表明儀器精密度良好。

表2 回歸方程及線性范圍

2.3.3 重復性試驗 取S1樣品粉末，按照“2.2.1”項下方法平行制備6份制備供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣，結(jié)果沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、PGG和苯甲酰芍藥苷8個成分的相對保留時間的RSD分別為0.40%、0.25%、0.27%、0.17%、0.20%、0.22%、0.35%和0.01%，峰面積的RSD分別為0.09%、2.52%、0.48%、0.28%、1.94%、0.50%、0.92%和0.11%，表明方法重復性好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取S1樣品粉末，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、10、12、14、16、24 h進樣分析，結(jié)果沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、PGG和苯甲酰芍藥苷8個成分的相對保留時間的RSD分別為0.68%、0.29%、0.39%、0.22%、0.22%、0.20%、0.32%和0.01%，峰面積的RSD分別為1.64%、2.79%、2.32%、0.81%、0.69%、0.84%、2.90%和1.12%。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知各指標成分含量的白芍樣品（S1）8份，每份0.25 g，分別加入與樣品中各成分含量相等的對照品溶液，按“2.2.1”項下條件制備供試品溶液，按“2.1”項下條件進行測定，計算各成分含量[39]，得到8個成分的平均加樣回收率及RSD。結(jié)果沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、PGG和苯甲酰芍藥苷的平均加樣回收率分別為96.76%、91.46%、96.17%、102.39%、101.92%、96.36%、100.17%和98.04%，保留時間RSD依次為0.32%、0.27%、0.16%、0.08%、0.08%、0.10%、0.18%、0.01%，表明該方法準確可靠。

2.4 數(shù)據(jù)分析

利用“中藥色譜指紋圖譜相似系統(tǒng)（2012版）”軟件繪制40批白芍樣品的指紋圖譜，并進行相似度評價分析。利用SPSS 23.0軟件以白芍Q-Marker含量為指標，采用平均聯(lián)接法，選擇平方歐氏距離為測度對樣品數(shù)據(jù)進行聚類分析（cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和優(yōu)劣解距離法分析（TOPSIS）。利用SIMCA 14.1軟件進行不同種質(zhì)白芍的PCA分析和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least square，OPLS-DA）分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 指紋圖譜的建立

分別混合對照品溶液和40批白芍樣品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行分析，將HPLC圖譜以AIA格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似系統(tǒng)（2012.130723）”軟件。將S1白芍樣品的HPLC圖設(shè)為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1 min，經(jīng)多點校正后匹配，生成40批白芍樣品的指紋圖譜，見圖1。

在指紋圖譜中，保留時間2～35 min內(nèi)共出現(xiàn)了11個共有峰，與混合對照品的色譜峰進行比較，指認了8個色譜峰，2號峰為沒食子酸，4號峰為氧化芍藥苷，5號峰為兒茶素，6號峰為芍藥內(nèi)酯苷，7號峰為芍藥苷，8號峰為沒食子酰芍藥苷，9號峰為PGG，11號峰為苯甲酰芍藥苷，見圖2。對40批白芍藥材指紋圖譜進行相似度評價分析，結(jié)果除S36～S40樣品外，其余樣品的相似度均大于0.95，見表3。結(jié)果表明雜花芍藥與其他種質(zhì)的樣品具有明顯差異，而各個種質(zhì)的白芍指紋圖譜相似度較高，說明各個種質(zhì)的藥材質(zhì)量較為穩(wěn)定和均一。

圖1 40批白芍樣品的指紋圖譜

3.2 含量測定結(jié)果

按照“2.1”項下條件測定白芍樣品，每個樣品平行測定3次，結(jié)果顯示，不同種質(zhì)白芍樣品之間的Q-Marker含量有較大差異，見表4。

3.3 HCA

HCA可將樣本分為不同的類別[40]。40批白芍樣品HPLC指紋圖譜中的Q-Marker 的峰面積經(jīng)標準化處理后，運用SPSS 23.0進行HCA，選擇以組間連接作為聚類方法，繪制樹狀圖，見圖3。當分類距離為25時，白芍樣品分為2類，S36～S40聚為一類，S1～S35聚為一類。當分類距離為5時白芍樣品分為6類，S6～S10和S21～S30聚為一類，其他樣品按照來源各自聚為一類。結(jié)果表明，HCA可大致區(qū)分出各種質(zhì)白芍，其中四川中江、浙江杭州和河北安國的樣品質(zhì)量較為相近。

2-沒食子酸 4-氧化芍藥苷 5-兒茶素 6-芍藥內(nèi)酯苷 7-芍藥苷 8-沒食子酰芍藥苷 9-PGG 11-苯甲酰芍藥苷

表3 40批白芍樣品相似度評價結(jié)果

3.4 PCA

將40批白芍樣品的Q-Marker的峰面積導入SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行PCA，結(jié)果顯示KMO為0.615，大于0.6，滿足PCA的前提要求；Bartlett球形度檢驗＜0.05，說明研究數(shù)據(jù)適合進行PCA。以特征值大于1為提取標準，篩選得到3個主成分（碎石圖見圖4），累積貢獻率大于90%，即提取的3個主成分包含了白芍Q-Marker的95.877%的信息，結(jié)果見表5。將得到的成分矩陣進行正交旋轉(zhuǎn)得到8個共有峰成分在3個主成分中的旋轉(zhuǎn)矩陣，權(quán)重值越大表明該成分在決定樣品區(qū)分中的作用越大[41]，見表6。結(jié)果顯示第1個主成分信息主要來自苯甲酰芍藥苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷和PGG，第2個主成分信息主要來自氧化芍藥苷、兒茶素和芍藥內(nèi)酯苷，第3個主成分信息主要來自沒食子酸。根據(jù)各主要化學成分在不同因子上的載荷，可確定白芍Q-Marker的8種化學成分均可作為不同種質(zhì)白芍的特征化學成分。將白芍樣品Q-Marker的峰面積導入SIMCA 14.1軟件繪制40批不同種質(zhì)白芍樣品的PCA得分圖（圖5），結(jié)果顯示3個主成分能反映不同種質(zhì)白芍的主要特征。

表4 不同種質(zhì)白芍Q-Marker的含量

圖3 樣品HCA樹狀圖

圖4 40批白芍藥材的Q-MarkerPCA碎石圖

表5 特征值及方差貢獻率

表6 旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣

3.5 OPLS-DA

為更好地觀察不同種質(zhì)樣本間的組間差異，采用SIMCA 14.1軟件對40批樣品進行OPLS-DA分析，將樣品的Q-Marker的數(shù)據(jù)導入，建立OPLS-DA模型，模型得分見圖6。模型分析驗證參數(shù)可知，2（cum）＝1，2（cum）＝0.881，2（cum）＝0.819，2（cum）＝1，均大于0.5且接近于1，說明模型穩(wěn)定且具有良好、可靠的預測準確性。為避免模型過度擬合造成結(jié)果假陽性，設(shè)置分類Y矩陣變量隨機排列200次做置換檢驗[42]，檢驗圖見圖7。2回歸線在Y軸截距為0.079 9、2回歸線在Y軸截距為?0.483，說明模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，可用于判別分析40批樣品的組間差異。OPLS-DA模型中的VIP值顯示，在95%置信區(qū)間內(nèi)，篩選出VIP＞1.0的差異標志物為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和PGG，見圖8。計算差異標志物峰面積占共有峰峰面積占比，可知40批樣品的差異標志物中芍藥苷平均占比最高，為48.82%，芍藥內(nèi)酯苷占比其次，為28.12%，且這些成分RSD均大于23.64%，表明這些成分在各批次間含量差異較大。

圖5 40批白芍PCA得分圖

圖6 OPLS-DA得分圖

圖7 OPLS-DA置換檢驗圖

圖8 VIP得分圖

3.6 TOPSIS

將白芍Q-Marker的峰面積作為原始數(shù)據(jù)，Zscore標準化處理后進行TOPSIS分析，以分析和比較不同種質(zhì)白芍的質(zhì)量差異，結(jié)果見表7。由結(jié)果可知，S16～S20位列前5名，綜合比較后本研究認為以Q-Marker為評價指標，山西運城的白芍的綜合品質(zhì)較優(yōu)異且穩(wěn)定，其次是四川中江與河北安國的白芍評價較好，人工培育的雜花芍藥的質(zhì)量最次，指紋圖譜Q-Marker的數(shù)據(jù)可作為白芍質(zhì)量評價的依據(jù)，TOPSIS分析可用于白芍的質(zhì)量評價[43]。

表7 TOPSIS評價結(jié)果

4 討論

本實驗分別考察了提取溶劑（甲醇、乙醇和稀乙醇）、提取溶劑濃度（30%、40%、45%、50%和70%）、檢測波長（230、245、270 nm等）等條件，確定了以50%稀乙醇超聲提取30 min為最佳提取條件。提取的樣品在230 nm下檢測所得圖譜的色譜峰較多且分離度較好，整體代表性較強。

本研究所建立的指紋圖譜主要針對不同種質(zhì)白芍的Q-Marker 8種成分，相似度評價結(jié)果顯示40批樣品的相似度在0.892～1.000，其中雜花芍藥的5批樣品相似度低于0.9，且芍藥苷的含量低于藥典規(guī)定的1.6%，這種人工培育的種質(zhì)是否能作藥用還有待進一步研究。不同種質(zhì)白芍的Q-Marker含量有較大差異，在本實驗條件設(shè)計下可以排除生長環(huán)境和栽培年限因素的影響[44]，差異的產(chǎn)生主要來源于種質(zhì)的不同，即原種質(zhì)遺傳物質(zhì)的差異。在HCA中，40批白芍樣品分為了6類，四川中江白芍、浙江杭州白芍和河北安國白芍聚為一類，其他種質(zhì)白芍各自聚為一類，與指紋圖譜相似度評價結(jié)果一致，表明8個種質(zhì)白芍樣品既存在相似性又存在差異性。PCA結(jié)果可知本研究使用的白芍Q-Marker的8種成分均可作為影響不同種質(zhì)白芍質(zhì)量的特征化學成分。OPLS-DA結(jié)果表明，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和PGG在各批次間含量差異較大，可以作為不同種質(zhì)白芍差異性分析的表征化合物。TOPSIS排序結(jié)果表明以Q-Marker為指標，山西運城的白芍較為優(yōu)質(zhì)且質(zhì)量穩(wěn)定，雜花芍藥的質(zhì)量較差，結(jié)果提示山西運城的種質(zhì)可為白芍種質(zhì)資源的篩選和優(yōu)化提供材料。

通過指紋圖譜結(jié)合化學模式識別以Q-Marker為指標評價不同種質(zhì)的白芍，實驗結(jié)果表明，選用這8種成分作為白芍的Q-Marker較為合理科學，通過HPLC指紋圖譜對白芍Q-Marker進行宏觀整體表征，能夠較為全面的反映白芍的化學信息。采用化學模式識別技術(shù)對Q-Marker的8種成分的峰面積數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明篩選出的Q-Marker具有較好的代表性，有利于白芍質(zhì)量評價標準的研究，促進資源的開發(fā)利用。

環(huán)境因素和基因型是影響道地藥材形成的主要外在因素和內(nèi)部因素，生長環(huán)境不同造就了道地藥材獨特的化學物質(zhì)基礎(chǔ)[45-46]，遺傳變異和自然選擇促進藥材在特定環(huán)境下形成優(yōu)良種質(zhì)資源[47]。優(yōu)良的種質(zhì)資源是藥材質(zhì)量穩(wěn)定的基礎(chǔ)[48]，其優(yōu)劣對中藥的產(chǎn)量和質(zhì)量有決定性的作用[49]，關(guān)系到藥用植物的確切療效和療效的重現(xiàn)性，進而直接影響到中藥制劑的質(zhì)量[50]。從各主產(chǎn)地引種的道地白芍種質(zhì)在換了栽培環(huán)境后，藥效物質(zhì)的含量仍優(yōu)于人工育成品種，表明道地白芍種質(zhì)穩(wěn)定而優(yōu)質(zhì)，人工培育的種質(zhì)是否能作為中藥材使用應謹慎。白芍新品種的選育，應基于現(xiàn)有種質(zhì)資源的特有基因中發(fā)現(xiàn)[51-52]。對白芍種質(zhì)資源進行綜合分析，可以為白芍種質(zhì)資源評價提供一定的參考，為白芍優(yōu)良種質(zhì)的選育和育種奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 余婧萍, 宋禎彥, 李富周, 等. 芍藥苷通過促進細胞自噬抑制H2O2誘導的SH-SY5Y細胞的氧化損傷 [J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報, 2020, 40(6): 653-659.

[2] 李嫻, 王國芬, 詹雅萍. 白芍總苷對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者肝損傷的保護效果分析 [J]. 現(xiàn)代實用醫(yī)學, 2020, 32(6): 637-639.

[3] 章麗. 基于“品種-ITS2序列—成分—藥效”關(guān)聯(lián)性探究丹皮、赤芍、白芍功效差異的科學內(nèi)涵 [D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇大學, 2016.

[4] 史麗璞. 白芍總苷加來氟米特治療類風濕關(guān)節(jié)炎時肝保護及對炎性因子的影響: 中國, CN 107225636 [P]. 2010-08-08.

[5] 呂仕超, 王云姣, 張婉勤, 等. 白芍總苷的心血管保護效應及其作用機制的研究進展 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2022, 37(1): 207-210.

[6] 王麗. 白芍總苷對缺血性腦損傷大鼠腦保護作用的研究 [J]. 醫(yī)學研究雜志, 2020, 49(11): 91-95.

[7] 陳恒石, 蔣磊. 白芍總苷膠囊對4-VO誘導的MCAO大鼠的神經(jīng)保護作用及其機制探究 [J]. 醫(yī)學綜述, 2020, 26(13): 2675-2680.

[8] 楊山景, 封安杰, 孫越, 等. 白芍總苷的藥理作用及機制研究進展 [J]. 中國現(xiàn)代應用藥學, 2021, 38(13): 1627-1633.

[9] 汪娟, 王芳. 白芍總苷治療自身免疫性疾病的研究進展 [J]. 醫(yī)學綜述, 2021, 27(22): 4481-4485.

[10] 鄭寅濤, 曹崗, 吳鑫. 山茱萸-白芍酒炙配伍前后通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK信號通路抗類風濕性關(guān)節(jié)炎藥效機制研究[J]. 中草藥, 2022, 53(10): 3084-3092.

[11] 王繼萱, 艾宗雄, 謝晶日. 土鱉蟲、姜黃、鱉甲、白芍治療肝纖維化經(jīng)驗 [J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2021, 14(2): 306-308.

[12] Shin M R, Lee S H, Roh S S. The potential hepatoprotective effect ofin thioacetamide-induced acute liver injury in rats [J]., 2022, 2022: 7904845.

[13] 賈嵐, 王蕾蕾, 孟靚, 等. 白芍總苷對大鼠化學性肝損傷與肝陰虛證結(jié)合模型的影響和機制研究[J]. 中草藥, 2020, 51(7): 1885-1892.

[14] 王文鑫. 中藥白芍在帕金森領(lǐng)域的應用及臨床研究進展 [J]. 醫(yī)學食療與健康, 2021, 19(15): 226-227.

[15] 吳林, 陳靜, 唐秀松, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討白芍治療帕金森病的作用機制 [J]. 中華中醫(yī)藥學刊, 2021, 39(4): 1-5.

[16] 張景霞, 趙重博, 李凡, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)的白芍治療抑郁癥作用機制探討 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2021, 23(9): 1582-1589.

[17] 李添, 李肖, 田俊生, 等. 基于1H-NMR肝臟代謝組學的白芍抗抑郁作用研究 [J]. 中醫(yī)藥學報, 2021, 49(8): 17-26.

[18] 查良平, 楊俊, 彭華勝, 等. 四大產(chǎn)地白芍的種質(zhì)調(diào)查 [J]. 中藥材, 2011, 34(7): 1037-1040.

[19] 李洋, 陳健, 張越, 等. 基于指紋圖譜結(jié)合化學模式識別及多成分含量測定的白芍藥材質(zhì)量評價研究[J]. 中草藥, 2022, 53(1): 231-237.

[20] 嚴倩茹, 鄔偉魁. 白芍飲片的質(zhì)量現(xiàn)狀與質(zhì)量控制方法研究進展 [J]. 藥物評價研究, 2015, 38(2): 229-232.

[21] 王金丹. 不同的炮制方法對白芍質(zhì)量的影響 [J]. 當代農(nóng)機, 2021(10): 63-64.

[22] 孟肖, 李靖季, 姚潔, 等. 不同因素對白芍藥材產(chǎn)量及品質(zhì)的影響研究進展 [J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2020(20): 59-62.

[23] 游廣嬌, 劉亞男, 任曉亮, 等. 基于主成分分析-分組分析模型的白芍/硫熏白芍模式識別研究 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2020, 35(5): 2315-2320.

[24] 查良平, 王德群, 彭華勝, 等. 中國藥用芍藥栽培品種 [J]. 安徽中醫(yī)學院學報, 2011, 30(5): 70-73.

[25] 姚杰, 王文姌, 郭盛磊, 等. 白芍與赤芍種質(zhì)問題探討 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2020, 22(11): 1933-1937.

[26] 黃文靜, 熊樂文, 張龍霏, 等. 不同種質(zhì)金銀花發(fā)育過程中黃酮類成分含量變化規(guī)律研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(10): 3156-3164.

[27] 張鐵軍, 王杰, 陳常青, 等. 基于中藥屬性和作用特點的中藥質(zhì)量標志物研究與質(zhì)量評價路徑[J]. 中草藥, 2017, 48(6): 1051-1060.

[28] 陽長明, 楊平, 劉樂環(huán), 等. 中藥質(zhì)量標志物(Q-Marker) 研究進展及對中藥質(zhì)量研究的思考 [J]. 中草藥, 2021, 52(9): 2519-2526.

[29] 葉霽, 李睿旻, 曾華武, 等. 基于整體觀中藥質(zhì)量標志物的發(fā)現(xiàn)及研究進展 [J]. 中草藥, 2019, 50(19): 4529-4537.

[30] 劉昌孝, 陳士林, 肖小河, 等. 中藥質(zhì)量標志物(Q-Marker): 中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念 [J]. 中草藥, 2016, 47(9): 1443-1457.

[31] 王倩, 李柳潼, 馬永犇, 等. 白芍與赤芍化學成分和藥理作用比較研究及質(zhì)量標志物的預測分析 [J]. 中國新藥雜志, 2021, 30(12): 1093-1098.

[32] 徐佳新, 許浚, 曹勇, 等. 中藥白芍現(xiàn)代研究進展及其質(zhì)量標志物的預測分析 [J]. 中國中藥雜志, 2021, 46(21): 5486-5495.

[33] 李洋, 陳健, 張越, 等. 基于指紋圖譜結(jié)合化學模式識別及多成分含量測定的白芍藥材質(zhì)量評價研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(1): 231-237.

[34] 李強, 杜思邈, 張忠亮, 等. 中藥指紋圖譜技術(shù)進展及未來發(fā)展方向展望 [J]. 中草藥, 2013, 44(22): 3095-3104.

[35] 嚴輝, 謝舒平, 濮宗進, 等. 基于UPLC-PDA指紋圖譜及多成分含量的化學模式識別法評價大黃質(zhì)量 [J]. 中草藥, 2020, 51(18): 4755-4762.

[36] 楊玉瑩, 張丹丹, 羅心遙, 等. 指紋圖譜及多成分定量結(jié)合化學模式識別法評價不同產(chǎn)地青錢柳質(zhì)量 [J]. 中草藥, 2020, 51(4): 1082-1088.

[37] 孫立麗, 王萌, 任曉亮. 化學模式識別方法在中藥質(zhì)量控制研究中的應用進展 [J]. 中草藥, 2017, 48(20): 4339-4345.

[38] 楊利民, 張永剛, 林紅梅, 等. 中藥材質(zhì)量形成理論與控制技術(shù)研究進展 [J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學學報, 2012, 34(2): 119-124.

[39] 史素影. 栽培芍藥加工成赤芍藥材的合理性研究 [D]. 合肥: 安徽中醫(yī)藥大學, 2021.

[40] 劉東方, 趙麗娜, 李銀峰, 等. 中藥指紋圖譜技術(shù)的研究進展及應用 [J]. 中草藥, 2016, 47(22): 4085-4094.

[41] 趙宏蘇, 趙茹, 喬金為, 等. 基于指紋圖譜結(jié)合化學模式識別綠萼梅質(zhì)量標志物的評價研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(5): 1345-1353.

[42] 謝蘇夢, 季巧遇, 呂尚, 等. 不同產(chǎn)地野菊花HPLC指紋圖譜建立及化學模式識別研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(24): 7616-7623.

[43] 李學學, 曹亞楠, 蘇宏娜, 等. 西南委陵菜質(zhì)量標志物初步研究及指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計綜合評價其質(zhì)量 [J]. 中草藥, 2021, 52(12): 3696-3704.

[44] 周學剛, 陳淑欣, 魏東華, 等. 不同種質(zhì)和不同部位白芍原植物中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量測定 [J]. 醫(yī)藥導報, 2011, 30(11): 1477-1480.

[45] 馬曉晶, 郭娟, 唐金富, 等. 論中藥資源可持續(xù)發(fā)展的現(xiàn)狀與未來 [J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(10): 1887-1892.

[46] 車欣, 于雪冬, 鄭翔宇, 等. 我國道地藥材適生區(qū)研究應用現(xiàn)狀 [J]. 中華中醫(yī)藥學刊, 2022, 40(7): 121-124.

[47] 袁媛, 黃璐琦. 道地藥材分子生藥學研究進展和發(fā)展趨勢 [J]. 科學通報, 2020, 65(12): 1093-1102.

[48] 楊成民, 魏建和, 隋春, 等. 我國中藥材新品種選育進展與建議 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2013, 15(9): 727-737.

[49] 侯嘉. 不同產(chǎn)地川芎種質(zhì)資源的品質(zhì)研究 [D]. 成都: 成都中醫(yī)藥大學, 2007.

[50] 孟祥才, 曹伍林, 宋琦, 等. 談種質(zhì)在中藥資源開發(fā)中的意義 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2013, 15(1): 29-32.

[51] 李隆云, 鐘國躍, 衛(wèi)瑩芳, 等. 中國中藥種質(zhì)資源的保存與評價研究 [J]. 中國中藥雜志, 2002, 27(9): 641-645.

[52] 王繼永, 鄭司浩, 曾燕, 等. 中藥材種質(zhì)資源收集保存與評價利用現(xiàn)狀 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2020, 22(3): 311-321.

Evaluation of quality markers ofin different germplasm based on fingerprint and chemical pattern recognition

DU Qian-qian1, ZHANG Tie-jun2, XIE Dong-mei1, 3, ZHANG Wei1, 3, WANG Tian-ming1, 3, SUN Ye-fen1, YUE Qian-Xia1, YANG Shuang1, MA Lei4, YU Nian-jun1, 3, CAO Yong5, 6

1. School of Pharmacy, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230012, China 2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300301, China 3. MOE-Anhui Joint Collaborative Innovation Center for Quality Improvement of Anhui Genuine Chinese Medicinal Materials, Hefei 230012, China 4. Anhui Pukang traditional Chinese Medicine Resources Co., Ltd., Bozhou 236800, China 5. Anhui Innovation Center of Extraction Technology of Chinese Medicinal Materials, Bozhou 236800, China 6. Anhui Jiren Pharmaceutical Co., Ltd., Bozhou 236800, China

To evaluate the quality of different germplasms of Baishao () taking quality marker (Q-Marker) as indicators by using fingerprint and chemical pattern recognition methods.Using the HPLC method, acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution was used as mobile phase for gradient elution, column temperature 30oC, volume flow rate 1 mL/min, detection wavelength 230 nm. The fingerprints of 40 batches ofwere drawn, combined with chemical pattern recognition techniques such as similarity analysis, cluster analysis (HCA), principal component analysis (PCA), and orthogonal partial least square (OPLS-DA). The quality of different germplasm samples ofwas evaluated.The selection of Q-Marker ofwas analyzed from the aspects of quality transfer and traceability, plant relationship, and chemical composition specificity, effectiveness and detecability. It was suggested that paeoniflorin, oxypaeoniflorin, benzoyl paeoniflorin, albiflorin, catechin, gallic paeoniflorin, 1,2,3,4, 6-penogalylglucose and gallic acid in paeony could be used as Q-Marker of. The HPLC fingerprints of 40 batches ofAlba were used to calibrate the Q-Marker ofAlba, and the similarity was between 0.892 and 1. Cluster analysis preliminarily distinguished theAlba of various germplasms. The quality of samples from Zhongjiang in Sichuan, Hangzhou in Zhejiang, and Anguo in Hebei was similar. The results of PCA and OPLS-DA showed that the selected Q-Marker could be used as the characteristic chemical constituents of different germplasm. The content of Q-Marker varied greatly among different germplasm samples. The results of TOPSIS analysis showed that the quality ofin Yuncheng, Shanxi was the highest, and the quality ofin Zahua was the lowest.Through fingerprint combined with chemical pattern recognition technology, taking the Q-Marker ofas an evaluation index can comprehensively reflect the quality of, which can provide a reference for the breeding and breeding high-quality germplasm resources ofAlba.

; germplasm resources; quality marker; HPLC fingerprint; gallic acid; oxidized paeoniflorin; catechin; albiflorin; paeoniflorin; galloyl paeoniflorin; PGG; benzoyl paeoniflorin; chemical pattern recognition

R286

A

0253 - 2670(2023)10 - 3292 -10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.026

2022-10-06

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC1701600）；國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC1701602）；2021年安徽省重點研發(fā)項目（202104h04020029）；亳州市科技重大專項（BZSKXJSJ2020-59）

杜倩倩（1997—），女，安徽省肥西縣，碩士研究生，研究方向為中藥資源與質(zhì)量評價。Tel: 13739292310 E-mail: 1009347120@qq.com

俞年軍，教授，研究方向為中藥生物技術(shù)及栽培藥材質(zhì)量等。Tel: (0551)68129173 E-mail: ynj2005288@sina.com

曹 勇，副研究員，研究方向為中藥質(zhì)量控制及新藥研發(fā)。E-mail: caoyong20021226@163.com

[責任編輯 時圣明]