彭 警，樊簫雨，王迪磊，徐 冰，張澤康，肖五慶，楊天姿，李鵬躍，杜守穎

基于成分定量和指紋圖譜的化學(xué)模式識(shí)別法評(píng)價(jià)膽木不同部位的差異性

彭 警，樊簫雨，王迪磊，徐 冰，張澤康，肖五慶，楊天姿，李鵬躍*，杜守穎*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

建立膽木不同部位的UPLC指紋圖譜，結(jié)合成分定量與化學(xué)模式識(shí)別，評(píng)價(jià)膽木不同部位的差異性。采用Waters Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃，對(duì)膽木不同部位異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺的含量進(jìn)行測(cè)定，利用化學(xué)模式識(shí)別法通過(guò)SPSS 20.0對(duì)色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和通過(guò)SIMCA 14.1軟件對(duì)膽木9部位進(jìn)行主成分分析，并將所有色譜峰化為分類數(shù)據(jù)對(duì)藥材不同部位的差異性進(jìn)行分析。對(duì)于異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺而言，植株地下部位（根皮、去皮根莖）的累積量要高于地上部位的累積量，在地下部位，根皮部位的含量高于去皮根莖部位的含量，地上部位中葉含量最高，其次為莖干部位，最后為枝部位，莖干部位趨勢(shì)從高到低大致為去皮莖干、帶皮莖干、莖皮，枝部位趨勢(shì)從高到低大致為枝皮、去皮枝莖、帶皮小枝。3批次9部位（27份）藥材UPLC圖譜有9個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中獐牙菜苷、綠原酸、馬錢苷酸3個(gè)色譜峰。當(dāng)平方歐氏距離為10時(shí)，9部位被聚為3類：3批葉聚為一類，3批根皮、3批莖皮、3批枝皮共聚為一類，3批去皮根莖、3批帶皮莖干、3批去皮莖干、3批帶皮小枝、3批去皮枝莖聚為一類。所有色譜峰化為分類數(shù)據(jù)后，在皮部位中，根皮能區(qū)分于莖皮和枝皮，色譜圖中根皮也存在區(qū)別于莖皮和枝皮的特征峰；在去皮部位中，去皮根莖可區(qū)分于去皮枝莖和去皮莖干，色譜圖中去皮根莖也存在區(qū)別于去皮枝莖和去皮莖干的特征峰，同時(shí)去皮枝莖和去皮莖干可通過(guò)色譜圖中的特征峰區(qū)分開(kāi)來(lái)；在帶皮部位中，帶皮小枝與帶皮莖干可以區(qū)分開(kāi)來(lái)。膽木皮部位（根皮、枝皮、莖皮）、帶皮部位（帶皮小枝、帶皮莖干）、去皮部位（去皮莖干、去皮枝莖、去皮根莖）、葉部位存在差異，可為膽木的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

膽木；指紋圖譜；異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺；主成分分析；獐牙菜苷；綠原酸；馬錢苷酸；正交偏最小二乘判別分析

膽木為海南地區(qū)傳統(tǒng)植物藥，又名藥烏檀、山熊膽、熊膽樹(shù)、黃羊木、黃膽木、黃心木、樹(shù)黃柏、細(xì)葉黃顆木，來(lái)源于茜草科烏檀屬植物烏檀Pierre ex Pitard.。該植物零星分布于我國(guó)廣東、廣西、海南、湖南等地，生于高山近頂或半腰蔭蔽潮濕地帶。膽木最早收錄于1969年廣州部隊(duì)的《常用中草藥手冊(cè)》，味苦，性寒，功效為清熱解毒，消腫止痛，用于治療急性扁桃體炎、咽喉炎、乳腺炎、腸炎、菌痢、尿路感染、膽囊炎、下肢潰瘍、腳癬感染、癤腫膿瘍、皮炎濕疹；后記載于1975年《全國(guó)中草藥匯編》[1]，味苦，性寒，功效為清熱解毒、消腫止痛，內(nèi)服用于治療感冒發(fā)熱、急性扁桃體炎、咽喉炎、支氣管炎、肺炎、泌尿系感染、腸炎、痢疾、膽囊炎，外用用于治療治乳腺炎，癰癤膿腫；1977年收錄于《中國(guó)藥典》[2]，味苦、性寒，功效為清熱解毒，用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、外耳道癤腫、急性結(jié)膜炎、皮膚癤腫；《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[3]2004年版中亦有收載，味苦，性寒，功效為清熱解毒、消腫止痛，用于治乳蛾、痢疾、下肢潰瘍、癤重膿瘍、濕疹。但四者關(guān)于膽木用藥部位的記載并不一致，《常用中草藥手冊(cè)》中記載以枝和樹(shù)皮入藥，《全國(guó)中草藥匯編》記載以枝、干、皮入藥，《中國(guó)藥典》1977年版記載以莖干及根入藥，《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》記載以木材入藥。

目前對(duì)于膽木的研究文獻(xiàn)相對(duì)較少，已有研究顯示，膽木中含有喹諾酮類生物堿[4]，如短小蛇根草苷；酚酸類成分[5]，如對(duì)甲氧基桂皮酸、咖啡酸甲酯等；也含有黃酮類[6]、倍半萜類化合物[7]，但其含量最高的成分為喹啉酮類生物堿苷異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺。部分藥效實(shí)驗(yàn)顯示，膽木提取物具有抗菌、抗病毒活性[8]，能夠降低血壓、減慢心率及延長(zhǎng)QT間期[9]。相關(guān)研究也顯示不同生長(zhǎng)年限和月份的膽木化學(xué)成分有差異[10]，不同部位藥理活性也有差異[11]，然而前述標(biāo)準(zhǔn)中或以莖干為原料，或以莖枝為原料，或以枝葉為原料，受入藥部位不一致的影響，已報(bào)道的各研究中所采用的“膽木”基原存在混淆，在一定程度上導(dǎo)致對(duì)膽木植株不同部位化學(xué)成分差異性的分析曖昧不明，為膽木的研究、開(kāi)發(fā)或入藥基原的擴(kuò)大帶來(lái)了困擾。

本研究擬建立膽木不同部位的的UPLC指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件對(duì)3批次膽木的9個(gè)部位（根皮、去皮根莖、葉、去皮莖干、帶皮莖干、莖皮、枝皮、去皮枝莖、帶皮小枝）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，并運(yùn)用SPSS 20.0進(jìn)行聚類分析、運(yùn)用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析對(duì)膽木不同部位進(jìn)行分類，并采用偏最小二乘判別法分析不同部位的差異性化學(xué)成分，為后續(xù)膽木的研究、利用及藥源的擴(kuò)大提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

賽多利斯BSA 223S型分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；梅特勒-托利多MS105DU型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；ACQUITY型超高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）。

1.2 試藥

異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺（批號(hào)111778-202003，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、綠原酸（批號(hào)110753-202018，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.1%）、馬錢苷酸（批號(hào)111865-202005，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.5%），以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品獐牙菜苷（CAS：14215-86-2，批號(hào)P25O10F101344，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司）。甲醇、乙腈和磷酸均為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。3批次9部位（共27份）膽木由海南森祺制藥有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟教授鑒定為茜草科烏檀屬植物烏檀Pierre ex Pitard.的根皮、去皮根莖、葉、去皮莖干、帶皮莖干、莖皮、枝皮、去皮枝莖、帶皮小枝。藥材、飲片編號(hào)見(jiàn)表1，各批次根皮、去皮根莖、葉、去皮莖干、帶皮莖干、莖皮、枝皮、去皮枝莖、帶皮小枝均來(lái)自同一棵植株。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

分別精密稱定3批次9部位膽木藥材粉末0.5 g（過(guò)4號(hào)篩），分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率200 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定對(duì)照品異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺12.20 mg、綠原酸9.94 mg、馬錢苷酸8.34 mg、獐牙菜苷10.32 mg分別置于10 mL量瓶，加甲醇定容后配制成對(duì)照品母液冷藏備用；使用前吸取1 mL對(duì)照品母液置于10 mL量瓶加甲醇定容稀釋為含異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺0.115 9 mg/mL、綠原酸0.095 5 mg/mL、馬錢苷酸0.081 4 mg/mL、獐牙菜苷0.101 1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

Waters Acquity BEH C18色譜柱：（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫；0～2 min，6.0%～8.0% A；2～5 min，8.0%～10.0% A；5～7 min，10.0%～13.0% A；7～13 min，13.0%～21.0% A；13～15 min，21.0%～22.0% A；15～17 min，22.0%～29.0% A；17～20 min，29.0%～30.0% A；20～22.5 min，30.0%～36.0% A；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，柱溫30 ℃。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（含異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺0.115 9 mg/mL）適量，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣0.3、0.8、1.5、2.0、3.0、5.0 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（）、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝844.94－49.664，2＝0.999 7。結(jié)果表明在異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺進(jìn)樣含量為0.034 8～0.579 5 μg時(shí)，線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺0.115 9 mg/mL）適量，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺的RSD為0.28%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取帶皮小枝藥材粉末（S25）約0.5 g，按“2.1”項(xiàng)下方法制備后分別在室溫下放置2、4、8、10、12、24 h時(shí)按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺峰面積的RSD為0.53%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批帶皮小枝藥材粉末（S25）約0.5 g，平行6份，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果，樣品中長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD為1.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定成分含量的帶皮小枝藥材粉末（S25）約0.25 g，共6份，分別按1∶1的質(zhì)量比加入對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺的平均加樣回收率為99.56%，RSD為2.27%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.6 樣品測(cè)定 取3批次9部位膽木藥材粉末，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液各2份，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算樣品中異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺含量，結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在植株不同部位，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺皆為累積量最高的成分，對(duì)于異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺而言，植株地下部位（根皮、去皮根莖）的累積量高于地上部位的累積量；在地下部位，根皮部位的含量高于去皮根莖部位的含量，但個(gè)別批次去皮根莖含量略高于根皮含量；地上部位中葉含量最高，其次為莖干部位，莖干部位異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺含量從高到低趨勢(shì)大致為去皮莖干＞帶皮莖干＞莖皮，但個(gè)別批次帶皮莖干含量高于去皮莖干；異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺的含量在枝部位累積較少，從高到低大致順序?yàn)橹ζぃ救テぶηo＞帶皮小枝，帶皮小枝藥材較為細(xì)小，推測(cè)異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺的積累可能與生長(zhǎng)周期相關(guān)。

2.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取供試品帶皮小枝溶液（S25）適量，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。以異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.07%～0.51%，相對(duì)峰面積的RSD為0.25%～2.10%，表明該方法精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性考察 取供試品帶皮小枝溶液（S25）適量，分別制備后在室溫下放置2、4、8、10、12、24 h時(shí)按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺峰色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.02%～0.31%，相對(duì)峰面積的RSD為0.53%～2.66%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 3批次膽木中異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺含量

2.5.3 重復(fù)性考察 取供試品帶皮小枝藥材粉末（S25）約0.5 g，精密稱定，平行6份，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.02%～0.42%，相對(duì)峰面積的RSD為0.59%～2.51%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 膽木指紋圖譜的建立及共有峰的確認(rèn) 取3批膽木9部位藥材粉末各0.5 g，分別按照“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，獲取3批膽木9部位指紋圖譜，見(jiàn)圖1。將3批次9部位膽木藥材色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以1號(hào)根皮為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法多點(diǎn)校正后進(jìn)行匹配，生成對(duì)照特征圖譜，按照峰面積大于最高峰峰面積0.1%和分離度大于1.5的條件共選定了10個(gè)共有峰。由于10號(hào)色譜峰（即含量最高的異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺）峰面積過(guò)大，而其他峰峰面積均較小，為了避免10號(hào)峰貢獻(xiàn)率太高，掩蓋峰面積較小的峰的差異而導(dǎo)致分析結(jié)果的誤差，因此后續(xù)分析中剔除了10號(hào)色譜峰。以對(duì)照?qǐng)D譜為參照進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，9部位總體相似度為0.837～0.999，表明不同批次不同部位膽木之間相似度較高。

圖1 膽木的UPLC特征指紋圖譜

2.6.2 主要色譜峰的指認(rèn) 采用對(duì)照品對(duì)各峰進(jìn)行指認(rèn)，共指認(rèn)出4個(gè)成分，1號(hào)峰馬錢苷酸，2號(hào)峰綠原酸，4號(hào)峰獐牙菜苷，10號(hào)峰異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺，見(jiàn)圖2。

1-馬錢苷酸 2-綠原酸 4-獐牙菜苷 10-異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺

2.7 化學(xué)模式識(shí)別

2.7.1 聚類分析 將9個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，以平方歐氏距離（Euclidean距離）為區(qū)間，采用Ward聯(lián)結(jié)法對(duì)3批次9部位膽木樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示，可以看出當(dāng)平方歐氏距離為10時(shí)，9部位可以被聚為3類：3批葉（S7～S9）聚為一類；3批根皮（S1～S3）、3批莖皮（S16～S18）、3批枝皮（S19～S21）聚為一類；3批帶皮莖干（S13～S15）、3批帶皮小枝（S25～S27）、3批去皮根莖（S4～S6）、3批去皮莖干（S10～S12）、3批去皮枝莖（S22～S24）聚為一類。

圖3 3批次9部位膽木聚類分析樹(shù)狀圖

2.7.2 主成分分析 將3批次9部位膽木樣品的9個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析。由主成分分析結(jié)果可知，前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為88.2%，前3個(gè)成分載荷值分別為4.830、2.110、0.997，說(shuō)明前3個(gè)主成分基本能反映3批次9部位膽木樣品的主要特征，見(jiàn)表3、圖4。以前3個(gè)主成分建立坐標(biāo)系，構(gòu)建樣品的主成分分析得分圖，見(jiàn)圖5，由得分圖可知3批次9部位膽木可聚為3類，3批葉（S7～S9）聚為一類；3批根皮（S1～S3）、3批莖皮（S16～S18）和3批枝皮（S19～S21）聚為一類；3批帶皮莖干（S13～S15）、3批帶皮小枝（S25～S27）、3批去皮根莖（S4～S6）、3批去皮莖干（S10～S12）、3批去皮枝莖（S22～S24）聚為一類，與聚類分析結(jié)果一致。

2.7.3 偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA） 為了進(jìn)一步比較3批次9部位膽木化學(xué)成分的差異和尋找各部位之前的差異性化合物，將3批次膽木9部位9個(gè)共有峰峰面積為變量進(jìn)行了OPLS-DA建模分析。OPLS-DA模型中，2為0.77，2為0.852，均大于0.5，說(shuō)明建立的模型穩(wěn)定可靠。由OPLS-DA得分圖見(jiàn)圖6，3批次9部位膽木明顯分為3類。通過(guò)變量重要性投影值（variable importance for the projection，VIP）篩選出三者間化學(xué)成分差異的主要標(biāo)志性成分，見(jiàn)圖7，橫坐標(biāo)為峰號(hào)。以VIP部值大于1作為標(biāo)準(zhǔn)篩選，貢獻(xiàn)依次由大到小的4個(gè)變量為峰4、3、9、2、5。通過(guò)對(duì)照品對(duì)照，指認(rèn)出2個(gè)成分，分別為峰4獐牙菜苷，峰2綠原酸。

表3 主成分特征值

圖4 主成分方差貢獻(xiàn)率

圖5 主成分得分分析圖

圖6 3批次9部位膽木OPLS-DA得分圖

圖7 3批次9部位膽木VIP圖

2.8 膽木藥材不同部位的差異性分析

在聚類分析中將所有樣本聚為3類，聚類I：3批次葉；聚類II：3批皮部位（根皮、莖皮、枝皮）；聚類III：帶皮部位（帶皮莖干、帶皮小枝）和去皮位（去皮根莖、去皮莖干、去皮枝莖）聚為一類。葉部位在聚類分析中與其他部位得到了區(qū)分，而在聚類II、聚類III中尚未能將根、莖、枝來(lái)源進(jìn)行區(qū)分，擬在此基礎(chǔ)上采用特征峰予以分析，將根、莖、枝來(lái)源進(jìn)行區(qū)分。

2.8.1 皮部位分析 將3批次膽木藥材皮部位（根皮、枝皮、莖皮）色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，進(jìn)行共有峰匹配，確定22個(gè)共有峰，為了避免最高峰貢獻(xiàn)率太高，掩蓋峰面積較小的峰的差異而導(dǎo)致分析結(jié)果的誤差，分析中剔除了最高峰，見(jiàn)圖8。

圖8 3批次膽木皮部位UPLC特征圖譜

將3批次膽木皮部位樣品的22個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析。由主成分分析結(jié)果可知，皮部位前4個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為89.0%，前4個(gè)成分載荷值分別為4.020、1.840、1.140、1.020，說(shuō)明前4個(gè)主成分基本能反映3批次膽木皮部位樣品的主要特征，見(jiàn)表4；以皮部位前4個(gè)主成分建立坐標(biāo)系，構(gòu)建樣品的主成分分析得分圖，見(jiàn)圖9，由得分圖可知根皮（S1～S3）、莖皮（S16～S18）和枝皮（S19～S21）混在一起無(wú)法區(qū)分開(kāi)來(lái)。為了進(jìn)一步將膽木皮部位區(qū)分開(kāi)來(lái)，將3批次皮部位膽木藥材所有峰峰面積化為分類數(shù)據(jù)，即相同保留時(shí)間下若存在色譜峰則設(shè)為1，若不存在色譜峰則設(shè)為0，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析。由主成分分析結(jié)果可知，皮部位前4個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為79.7%，前4個(gè)成分載荷值分別為3.600、1.590、1.120、0.850，說(shuō)明前4個(gè)主成分基本能反映3批次膽木皮部位樣品的主要特征，見(jiàn)表5。以皮部位前4個(gè)主成分建立坐標(biāo)系，構(gòu)建樣品的主成分分析得分圖，見(jiàn)圖10，由得分圖可知根皮（S1～S3）聚為一類，莖皮（S16～S18）和枝皮（S19～S21）無(wú)法區(qū)分開(kāi)來(lái)。

表4 基于共有峰分類數(shù)據(jù)的皮部位主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

圖9 基于共有峰分類數(shù)據(jù)的皮部位主成分得分分析圖

表5 基于色譜峰分類數(shù)據(jù)的皮部位主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

圖10 基于色譜峰分類數(shù)據(jù)的皮部位主成分得分分析圖

結(jié)合色譜圖分析差異性，由根皮、枝皮、莖皮色譜圖（圖11）可知，峰a、d為枝皮和莖皮特有峰，峰b、c、e、f、g、h、i、j為根皮特有峰，根皮能夠顯著區(qū)別于枝皮和莖皮，而枝皮和莖皮之間沒(méi)有特異性峰，無(wú)法靠特異峰區(qū)分開(kāi)來(lái)，與PCA分析結(jié)果一致。

圖11 膽木皮部位特征圖譜

2.8.2 去皮部位分析 將3批次膽木藥材去皮部位（去皮根莖、去皮枝莖、去皮莖干）色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，進(jìn)行共有峰匹配，確定18個(gè)共有峰，為了避免最高峰貢獻(xiàn)率太高，掩蓋峰面積較小的峰的差異而導(dǎo)致分析結(jié)果的誤差，分析中剔除了最高峰，見(jiàn)圖12。

將3批次膽木去皮部位樣品的18個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析。由主成分分析結(jié)果可知，去皮部位前4個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為84.3%，前4個(gè)成分載荷值分別為3.510、2.020、1.240、0.820，說(shuō)明前4個(gè)主成分基本能反映3批次膽木去皮部位樣品的主要特征，見(jiàn)表6；以去皮部位前4個(gè)主成分建立坐標(biāo)系，構(gòu)建樣品的主成分分析得分圖，見(jiàn)圖13，由得分圖可知3批去皮根莖（S4～S6）聚為一類，3批去皮枝莖（S22～S24）聚為一類，而去皮莖干（S10～S12）混于二者之間，表明去皮根莖和去皮枝莖化學(xué)成分及含量存在較大差異，而去皮莖干無(wú)法和其他兩者區(qū)分開(kāi)來(lái)。為了進(jìn)一步將膽木去皮部位區(qū)分開(kāi)來(lái)，將3批次去皮部位膽木藥材所有峰峰面積化為分類數(shù)據(jù)，即相同保留時(shí)間下若存在色譜峰則峰面積定為1，不存在色譜峰則峰面積定為0，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析。由主成分分析結(jié)果可知，去皮部位前4個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為84.1%，前4個(gè)成分載荷值分別為3.540、2.000、1.280、0.760，說(shuō)明前4個(gè)主成分基本能反映3批次膽木去皮部位樣品的主要特征，見(jiàn)表7。以去皮部位前4個(gè)主成分建立坐標(biāo)系，構(gòu)建樣品的主成分分析得分圖，見(jiàn)圖14，由得分圖可知3批去皮根莖（S4～S6）聚為一類，3批去皮莖干（S10～S12）和3批去皮枝莖（S22～S24）聚為一類，表明去皮根莖與去皮莖干和去皮枝莖化學(xué)成分及含量存在較大差異，而去皮莖干無(wú)法和去皮枝莖區(qū)分開(kāi)來(lái)。結(jié)合色譜圖分析差異性 將第一批次去皮枝莖、去皮根莖、去皮莖干疊加后放大，見(jiàn)圖15，峰b、d、f、g為去皮枝莖和去皮莖干的特有峰，峰e(cuò)為去皮根莖的特有峰，去皮根莖能顯著區(qū)別于去皮枝莖和去皮莖干，與主成分分析結(jié)果一致，

圖12 3批次膽木去皮部位UPLC特征圖譜

表6 基于共有峰分類數(shù)據(jù)的去皮部位主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

圖13 基于共有峰分類數(shù)據(jù)的去皮部位主成分得分分析圖

表7 基于色譜峰分類數(shù)據(jù)的去皮部位主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

圖14 基于色譜峰分類數(shù)據(jù)的去皮部位主成分得分分析圖

盡管色譜圖顯示，與去皮莖干部位相比，去皮枝莖有少量特有的色譜峰，但以共有峰數(shù)據(jù)和色譜峰分類化數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，去皮莖干部位與去皮枝莖部位均有較好的相似性。

2.8.3 帶皮部位分析 將3批次膽木藥材帶皮部位（帶皮小枝、帶皮莖干）色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，進(jìn)行共有峰匹配，確定了20個(gè)共有峰，為了避免最高峰貢獻(xiàn)率太高，掩蓋峰面積較小的峰的差異而導(dǎo)致分析結(jié)果的誤差，分析中剔除了最高峰，見(jiàn)圖16。

將3批次膽木帶皮部位樣品的20個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析。由主成分分析結(jié)果可知，帶皮部位前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為86.5%，前3個(gè)成分載荷值分別為3.080、1.360、0.750，說(shuō)明前3個(gè)主成分基本能反映3批次膽木帶皮部位樣品的主要特征，見(jiàn)表8。以帶皮部位前3個(gè)主成分建立坐標(biāo)系，構(gòu)建樣品的主成分分析得分圖，見(jiàn)圖17，由得分圖可知3批帶皮莖干（S13～S15）聚為一類，3批帶皮小枝（S25～S27）聚為一類，表明帶皮莖干和帶皮小枝化學(xué)成分及含量存在較大差異。

圖15 膽木去皮部位特征圖譜

圖16 3批次膽木帶皮部位UPLC特征圖譜

3 討論

3.1 提取方法及時(shí)間考察

以異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺的提取率為指標(biāo)對(duì)提取方式、提取溶劑、提取時(shí)間進(jìn)行了考察。先考察了甲醇回流提取和超聲提取的區(qū)別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于主成分異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺而言，甲醇超聲組與甲醇回流組峰面積差異不大，故選擇采用超聲的方式進(jìn)行提取。然后比較了水超聲和甲醇超聲提取的區(qū)別，對(duì)于主成分異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺而言，甲醇超聲提取率明顯高于水提，峰面積約是水提的1.5倍，因?yàn)橐獪y(cè)定異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺含量，決定提取溶劑為甲醇。接著考察了不同超聲時(shí)間的區(qū)別，對(duì)比了超聲30 min和超聲45 min的區(qū)別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)，主成分異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺和其他各高峰峰面積變化不大，平行性良好，決定超聲時(shí)間為30 min。

表8 帶皮部位主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

圖17 帶皮部位主成分得分分析圖

3.2 色譜條件的考察

本實(shí)驗(yàn)也考察了不同流動(dòng)相洗脫時(shí)的分離結(jié)果，對(duì)比了0.1%甲酸和0.1%磷酸洗脫時(shí)色譜峰的差異，綜合考慮色譜峰峰形較好且基線較為平穩(wěn)，最終確定流動(dòng)相為0.1%磷酸。然后以0.1%磷酸為流動(dòng)相分別比較226、240、258、285 nm下樣品以及甲醇的色譜圖，考察不同波長(zhǎng)下溶劑甲醇對(duì)樣品色譜圖出峰結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，258 nm與285 nm下各峰面積均較低，226 nm下溶劑峰干擾較為顯著，影響后續(xù)指紋圖譜工作的進(jìn)行，為了盡可能獲得較全、小峰較高的指紋圖譜且降低溶劑峰的干擾，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。

本研究以膽木不同部位藥材為對(duì)象，建立了不同部位膽木藥材的UPLC指紋圖譜及UPLC測(cè)定異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺含量的方法，該方法耗時(shí)短、效率高、方法學(xué)驗(yàn)證合格。通過(guò)分析，9部位總體可分為3大類，分別為皮部位、葉部位、帶皮和去皮部位，3大類之間化學(xué)成分和含量存在較大差異。皮部位細(xì)分后可分為2大類，根皮一類，莖皮和枝皮一類，2大類之間化學(xué)成分和含量存在較大差異，色譜圖分析結(jié)果顯示根皮顯著區(qū)別于莖皮和枝皮，而莖皮和枝皮無(wú)法通過(guò)色譜圖分開(kāi)分開(kāi)。去皮部位細(xì)分后可分為2大類，去皮根莖一類，去皮枝莖和去皮莖干一類，2大類之間化學(xué)成分和含量存在較大差異，色譜圖分析結(jié)果顯示去皮根莖顯著區(qū)別于去皮枝莖和去皮莖干，同時(shí)去皮枝莖和去皮莖干可以靠特征峰分開(kāi)。帶皮部位細(xì)分后可分為2大類，分別為帶皮小枝和帶皮莖干，2大類之間化學(xué)成分和含量存在較大差異，聚類分析及主成分分析結(jié)果可為膽木的用藥部位的差異性比較提供參考。

皮部位和去皮部位主成分分析時(shí)采用了將所有色譜峰峰面積化為分類數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的方法，現(xiàn)存文獻(xiàn)多以共有峰進(jìn)行主成分分析，如鐘海蓉等[12]建立了不同產(chǎn)地不同部位川赤芍根、莖、葉的UPLC指紋圖譜，共標(biāo)定了17個(gè)共有峰，結(jié)果顯示川赤芍各部位的化學(xué)成分極為相似，且莖和葉化學(xué)成分含量較接近，說(shuō)明不同產(chǎn)地川赤芍根藥材質(zhì)量存在顯著差異。洪婉敏等[13]對(duì)不同部位仙鶴草地上部分、莖、葉建立了指紋圖譜，各標(biāo)定了20、16、14個(gè)共有峰，結(jié)果顯示仙鶴草葉可大致聚為一類，地上部分與莖多聚為一類，表明仙鶴草地上部分與莖化學(xué)成分較接近，而與葉的化學(xué)成分差異相對(duì)較大。吳佳等[14]建立了不同部位藤茶普葉和龍須的指紋圖譜，確定了10個(gè)普葉中共有峰和12個(gè)龍須中共有峰，結(jié)果顯示，藤茶不同部位即龍須和普葉組間差異遠(yuǎn)大于組內(nèi)差異，龍須和普葉分類明顯。與現(xiàn)存文獻(xiàn)中普遍使用的共有峰PCA法相比，將所有色譜峰轉(zhuǎn)化為分類數(shù)據(jù)進(jìn)行分析能更好的體現(xiàn)差異性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Differences ofin different parts based on quantitative analysis of components and fingerprint by chemical pattern recognition

PENG Jing, FAN Xiao-yu, WANG Di-lei, XU Bing, ZHANG Ze-kang, XIAO Wu-qing, YANG Tian-zi, LI Peng-yue, DU Shou-ying

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To establish UPLC fingerprint of different parts of, and evaluate the quality of different parts ofby combining composition quantification and chemical pattern recognition.Waters Acquity BEH C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) was used. Gradient elution was carried out with acetonitrile (A)-0.1% phosphoric acid aqueous solution (B) as mobile phase. Detection wavelength: 240 nm; Flow rate: 0.3 mL/min; The contents of strictosamide in different parts ofwere determined at 30oC. Cluster analysis of chromatographic data was performed with SPSS 20.0 by chemical pattern recognition method and principal component analysis was performed with SIMCA 14.1 software for nine parts of.The accumulation of strictosamide in the underground part of the plant (root bark, peeled root) was higher than that in the aboveground part, in the underground part, the content of the root bark part was higher than that of the peeled root, but the content of the peeled root was slightly higher in individual batches, in the aboveground part, the leaf part was the highest, followed by the stem part and the last was branch part, the trend of stem part from high to low was about peeled stem, stem and stem bark, but the content of individual batches of stems was higher than that of peeled stems, and the trend of branch part from high to low was branch bark, peeled branch and branchlet. Nine common peaks were identified, three of which were identified as sweroside, chlorogenic acid and loganic acid. When the squared Euclidean distance was 10, nine parts can be well separated, three batches of leaves clustered into one class, three batches of root bark, three batches of stem bark and three batches of branchlets bark clustered into one class, three batches of stem, three batches of branchletslets, three batches of peeled root, three batches of peeled stem and three batches of peeled branchlets clustered into one class. After all chromatographic peaks were classified, the root bark could be distinguished from the stem bark and the branchlets bark, and the characteristic peaks were also distinguished from the stem bark and the branchlets bark. Among the peeled parts, peeled root could be distinguished from peeled branchlets and peeled stem. The characteristic peaks of peeled root could also be distinguished from peeled branchlets and peeled stem, at the same time, peeled branchlets could also be distinguished from peeled stem by the characteristic peaks of chromatogram. In the parts with skin, branchletslets with skin can be distinguished from stems with skin.There are differences in the parts of bark (root bark, branchlets bark, stem bark), parts with with skin (branchletslets with skin, stem with skin), peeled parts (peeled stem, peeled branchlets, peeled root) and leaves, which can provide basis for further development and utilization of gallbladder.

Pierre ex Pitard.; fingerprint; strictosamide; principal component analysis; sweroside; chlorogenic acid; loganic acid; orthogonal partial least squares discriminant analysis

R286.2

A

0253 - 2670(2023)10 - 3281 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.025

2022-10-09

彭 警（1998—），男，碩士在讀，從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel: 13535655204 E-mail: tcmpengjing@163.com

李鵬躍，博士，副教授，從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel: (010)53912123 E-mail: pengyuelee@126.com

杜守穎，博士，教授，從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel: (010)84738615 E-mail: Dushouying@263.net

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