蔣 明，王軍峰，吳 丹，朱 晏，湯紫依，何海葉，張慧娟*

銹毛鈍果寄生葉綠體基因組的序列特征和系統(tǒng)發(fā)育分析

蔣 明1，王軍峰2，吳 丹3，朱 晏1，湯紫依1，何海葉1，張慧娟1*

1. 臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 椒江 318000 2.華東藥用植物園科研管理中心，浙江 麗水 323000 3. 臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）路橋醫(yī)院，浙江 路橋 318050

以藥用植物銹毛鈍果寄生為材料，在高通量測(cè)序、組裝的基礎(chǔ)上，明確葉綠體因組的結(jié)構(gòu)、序列特征和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。利用SDS法提取基因組DNA，采用Illumina HiSeq X Ten進(jìn)行高通量測(cè)序，用NovoPlasty組裝葉綠體基因組，借助PhyML生成系統(tǒng)發(fā)育樹。銹毛鈍果寄生的葉綠體基因組全長(zhǎng)為122 208 bp，GC值為37.3%，大單拷貝區(qū)（large single copy region，LSC）、小單拷貝區(qū)（small single copy region，SSC）和反向重復(fù)區(qū)（inverted repeat region，IR）的長(zhǎng)度分別為70 522、6084和22 801 bp；銹毛鈍果寄生的葉綠體基因組共有基因108個(gè)，其中的編碼蛋白基因、tRNA與rRNA分別為66、29和8個(gè)，另有5個(gè)假基因；基因、所有的基因及6個(gè)tRNA發(fā)生丟失。序列比對(duì)結(jié)果表明，銹毛鈍果寄生與桑寄生(Lecomte) Danser葉綠體基因組之間的相似性最高，達(dá)96.7%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，7種植物在發(fā)育樹上分成5組，其中，銹毛鈍果寄生與桑寄生和廣寄生聚于一組。銹毛鈍果寄生葉綠體基因組的組裝、序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，為后續(xù)開展遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)，并為桑寄生科植物的進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育研究提供了依據(jù)。

銹毛鈍果寄生；桑寄生；廣寄生；葉綠體基因組；序列特征；系統(tǒng)發(fā)育分析

寄生植物（Parasitic plants）是植物界的特殊類群，全世界約有4500種，它們營(yíng)全寄生或半寄生生活，通過(guò)吸器從寄主中獲取生長(zhǎng)發(fā)育所需要的物質(zhì)[1]。全寄生植物（Holoparasitic plants）由于不能進(jìn)行光合作用，所有的養(yǎng)分都來(lái)自寄主；半寄生植物（Hemiparasitic plants）不完全依靠寄主獲得營(yíng)養(yǎng)，它們的葉片具有葉綠體，能通過(guò)光合作用制造養(yǎng)分[2-3]。大花草科（Rafflesiaceae）、檀香科（Santalaceae）、列當(dāng)科（Orobanchaceae）、鎖陽(yáng)科（Cynomoriaceae）、蛇菰科（Balanophoraceae）和桑寄生科（Loranthaceae）為寄生植物的幾個(gè)主要科，其中的大部分植物為半寄生[4-7]。桑寄生科植物為半寄生性灌木、亞灌木或草本，寄生于木本植物的根、莖或枝條上，全世界約65屬，1300余種，我國(guó)有64種，10變種[8]。

銹毛鈍果寄生(Merr.) H. S. Kiu為桑寄生科鈍果寄生屬灌木，分布于廣西、云南、湖南、安徽和浙江等省，主要寄生于油茶Abel.、樟(L.) Presl和殼斗科Fagaceae植物[8]。銹毛鈍果寄生的葉片、嫩枝、花蕾和花的表面密被星狀毛，這一特征可與同屬其他物種相區(qū)分（圖1）。銹毛鈍果寄生具有一定的藥用價(jià)值，全株入藥，有祛風(fēng)除濕功效[8]。銹毛鈍果寄生在江蘇省也有發(fā)現(xiàn)，該植物隨灰毛含笑var.Law et Y. F. Wu的引種帶入[9]。有關(guān)銹毛鈍果寄生的研究很少，僅見(jiàn)于化學(xué)成分和新記錄種等方面的研究[10-11]。葉綠體基因組是獨(dú)立于核基因組的小型環(huán)狀DNA分子，它具有結(jié)構(gòu)保守、基因數(shù)量和排列穩(wěn)定等特點(diǎn)，在保護(hù)生物學(xué)、遺傳多樣性、基因水平轉(zhuǎn)移和物種鑒定等方面取得了一些進(jìn)展[12-16]。目前，有關(guān)銹毛鈍果寄生葉綠體基因組方面的研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究在測(cè)序和組裝的基礎(chǔ)上，對(duì)銹毛鈍果寄生葉綠體基因組進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，為后續(xù)開展該物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)；同時(shí)，比較了銹毛鈍果寄生、桑寄生(Lecomte) Danser和廣寄生(DC.) Danser的葉綠體基因組序列，并為桑寄生科植物的進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育提供依據(jù)。

A-枝條和葉片 B-花

1 材料與儀器

1.1 材料

銹毛鈍果寄生的葉片采自浙江麗水碧湖，寄主植物為楓楊C. DC.，采集健康、幼嫩的葉片，置于取樣袋。葉片帶回實(shí)驗(yàn)室后，用無(wú)菌水沖洗3～5次，晾干后置于?80 ℃冰箱備用。

1.2 儀器

ThinkPad P52移動(dòng)工作站（聯(lián)想有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Covaris超聲波DNA破碎儀（Chromatin Shearing公司，美國(guó)）；伯樂(lè)C1000型PCR儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）；Illumina HiSeq X Ten測(cè)序儀；DYY-12型電泳儀及電泳槽（北京市六一儀器廠）；伯樂(lè)Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)）。

2 方法

2.1 DNA的提取和測(cè)序

葉片用液氮快速冷凍后研磨成粉末，采用SDS法提取基因組DNA。利用Covaris超聲波破碎儀制備長(zhǎng)度為350 bp的DNA片段，經(jīng)末端修復(fù)、加尾、加接頭、純化和PCR擴(kuò)增等步驟完成測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。測(cè)序在Illumina HiSeq X Ten上進(jìn)行，策略為雙末端（Paired-End，PE）PE150測(cè)序。

2.2 葉綠體基因組的組裝和邊界驗(yàn)證

高通量測(cè)序得到6.75 G原始數(shù)據(jù)，去除接頭和低質(zhì)量的數(shù)據(jù)區(qū)，獲得clean reads 27 130 560條。利用NOVOPlasty拼接葉綠體基因組，采用默認(rèn)參數(shù)[17]。用于邊界驗(yàn)證的PCR引物分別為：P1：5’-CCGTATGCTTTGGAAGAAGCT-3’、P2：5’-GGCCTGTAGTAGGTATCTGGTTCAC-3’、P3：5’-CTCCCAATTTGTGACCTACCATACG-3’、P4：5’-GACGGAACGGGAAGACCTAGG-3’、P5：5’-GGCAGAATACCATCGCCCATTC-3’、P6：5’-CCTGTTAGACAGCAAAATCCCGC-3’、P7：5’-GCCACCTCTTCGGTATTTGTCTG-3’、P8：5’-AGGCAGAATACCATCGCCCA-3’。PCR反應(yīng)采用20 μL體系，分別加入ddH2O 15.5 μL、10×緩沖液2.0 μL、10 mmol/L的dNTPs 0.6 μL、20 μmol/L的上游引物/下游引物各0.4 μL、50 ng/μL的模板0.6 μL和2 U/μL酶0.5 μL。片段克隆在伯樂(lè)C1000型PCR儀上進(jìn)行，程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54～56 ℃退火45 s，72 ℃退火1 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)、割膠回收、連接和轉(zhuǎn)化，取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

2.3 基因組的注釋和比較

銹毛鈍果寄生葉綠體基因組的注釋采用DOGMA（Dual Organellar GenoMe Annotator）程序（http://dogma.ccbb.utexas.edu/），并經(jīng)手工調(diào)整[18]；tRNA的注釋采用tRNAscan-SE （http://lowelab. ucsc.edu/tRNAscan-SE/）和ARAGORN工具[19-20]；利用Organellar Genome DRAW生成圈圖[21]。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI下載6種植物的葉綠體基因組序列，它們分別來(lái)自桑寄生科鈍果寄生屬的桑寄生（登錄號(hào)：KY996493）、廣寄生（KY996492）、梨果寄生屬L.的紅花寄生L.（NC_040862）、鞘花屬L.的鞘花(Lour.) Van Tiegh.（NC_039376）、離瓣寄生屬Lour.的離瓣寄生Lour.（NC_039375）和菊科（Compositae）的水飛薊(L.) Gaertn.（KT267161）等的葉綠體基因組序列，其中的水飛薊序列用作外類群。Mauve插件用于鈍果寄生屬植物葉綠體基因組的比對(duì)，參數(shù)采用默認(rèn)值。jModelTest工具用于篩選核苷酸替代模型，利用PhyML軟件生成最大似然樹[22]。

3 結(jié)果與分析

3.1 銹毛鈍果寄生葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)

利用NOVOPlasty完成了clean reads的拼接，并對(duì)邊界序列進(jìn)行PCR克隆和測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明，銹毛鈍果寄生葉綠體基因組的全長(zhǎng)為122 208 bp，GC值為37.3%，該基因組具有1個(gè)典型的四分體結(jié)構(gòu)，即整個(gè)環(huán)狀基因組可分成大單拷貝區(qū)（large single copy region，LSC）、小單拷貝區(qū)（small single copy region，SSC）及2個(gè)反向重復(fù)區(qū)（inverted repeat region，IR）（圖2）。LSC、SSC和IR的長(zhǎng)度分別為70 522 bp、6 084 bp和22 801 bp，它們的GC值分別為34.7%、26.4%和42.9%。

圖2 銹毛鈍果寄生葉綠體基因組

3.2 基因組成

銹毛鈍果寄生葉綠體基因組共有108個(gè)基因，包括29個(gè)tRNA、8個(gè)rRNA、66個(gè)編碼蛋白基因和5個(gè)假基因（表1）。tRNA中，、、、和各有2份拷貝，其中的具1個(gè)內(nèi)含子。rRNA共有4種，每種2份拷貝，它們分布于IR區(qū)域。編碼蛋白基因中，核糖體蛋白大亞基、核糖體蛋白小亞基和及未知功能蛋白各有2份拷貝；、、、和均有1個(gè)內(nèi)含子，而和各有2個(gè)內(nèi)含子。、和為假基因，其中的和各有2份拷貝。銹毛鈍果寄生葉綠體基因組中，所有基因，即全部缺失，tRNA基因、、、、和也發(fā)生缺失。此外，在銹毛鈍果寄生葉綠體基因組中未能檢測(cè)到翻譯起始因子基因。

表1 銹毛鈍果寄生葉綠體基因組的基因

×2-拷貝數(shù)為2 Ψ-假基因 *-1個(gè)內(nèi)含子 **-2個(gè)內(nèi)含子

× 2-two copies Ψ-pseudogene *-one intron **-two introns

3.3 與同屬植物的全基因組比較

廣寄生、桑寄生和銹毛鈍果寄生為同屬植物，它們均營(yíng)半寄生生活。廣寄生與桑寄生的葉綠體基因組全長(zhǎng)分別為121 363 bp和122 562 bp，而銹毛鈍果寄生則介于兩者之間，3種植物葉綠體基因組的GC值均為37.3%。3種植物葉綠體基因組的基因結(jié)構(gòu)和基因組成相似，它們的基因數(shù)均為108，其中66個(gè)為蛋白編碼基因，37個(gè)為RNA。銹毛鈍果寄生與桑寄生葉綠體基因組之間的相似性較高，達(dá)96.7%，與廣寄生的相似性略低，為92.7%（圖3）。序列之間的差異主要表現(xiàn)在基因間隔區(qū)，如-、和間隔區(qū)存在大量的插入/缺失現(xiàn)象。編碼蛋白基因之間也存在一定的差異，如常用的葉綠體DNA標(biāo)記中，3種植物的基因之間存在68個(gè)變異位點(diǎn)，導(dǎo)致40個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生差異（圖4）；和的DNA序列各有40個(gè)變異位點(diǎn)；而基因相對(duì)保守，僅4個(gè)變異位點(diǎn)。

圖3 3種鈍果寄生屬植物葉綠體基因組的比較

圖4 3種鈍果寄生屬植物matK蛋白序列的比較

3.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用jModelTest工具獲得分子進(jìn)化模型，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，GTR＋G＋I(xiàn)為最佳替代模型，赤池信息標(biāo)準(zhǔn)（Akaike information criterion，AIC）與貝葉斯信息標(biāo)準(zhǔn)（Bayesian information criterion，BIC）分別為512 130.246 98和512 316.620 09。7種植物的葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育樹上可分為5組，同為鈍果寄生屬的廣寄生、桑寄生和銹毛鈍果寄生聚為1組（II），梨果寄生屬的紅花寄生（I）、鞘花屬的鞘花（III）、離瓣寄生屬的離瓣寄生（IV）及外類群水飛薊（V）各占1個(gè)分支（圖5）。銹毛鈍果寄生和桑寄生的序列差異最小，遺傳距離最近，兩者處于同一分支，支持率達(dá)100%；它們?cè)倥c廣寄生聚為1組，支持率為100%。

4 討論

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，也是氮、硫同化，氨基酸、葉綠素、類胡蘿卜素及脂肪酸合成的重要部位[23]。葉綠體基因組呈環(huán)狀，通?？煞殖?個(gè)部分，即LSC、SSC和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)IR。但也有例外，在松科（Pinaceae）和絲藻屬Friedl植物中，IR的1個(gè)拷貝發(fā)生缺失[24-25]。在陸生植物中，葉綠體基因組序列的長(zhǎng)度通常為120～160 kb，由70～88個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因及33～35個(gè)RNA基因組成[26]。綠色植物的葉綠體基因組較大、基因數(shù)量較多，枸杞Miller葉綠體基因組的全長(zhǎng)為155 756 bp，共有130個(gè)基因，其中編碼蛋白基因的數(shù)量為85個(gè)，tRNA與rRNA基因分別為30個(gè)和8個(gè)[27]；金蕎麥(D. Don) Hara的葉綠體基因組全長(zhǎng)為159 919 bp，共有131個(gè)基因，包括80個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、28個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因[28]；水飛薊(L.) Gaertn.葉綠體基因組的大小為153 202 bp，有137個(gè)基因，其中蛋白質(zhì)編碼基因89個(gè)，tRNA基因40個(gè)，rRNA基因8個(gè)[29]。而非綠色植物中的葉綠體基因組顯著變小，基因數(shù)量則明顯減少，本研究中，銹毛鈍果寄生葉綠體基因組全長(zhǎng)僅為122 208 bp，基因數(shù)量?jī)H108個(gè)，包括66個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，29個(gè)tRNA和8個(gè)rRNA。與同屬的桑寄生和廣寄生相比，它們的基因組成和基因結(jié)構(gòu)十分相似，但序列上存在較多的差異，這些差異在基因和基因間隔區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，它們可用于3種植物的分子鑒定。

圖5 基于葉綠體基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

與陸生非寄生植物相比，寄生植物基因丟失現(xiàn)象十分頻繁。山毛櫸寄生(L.) Bartram為全寄生植物，通常寄生于大葉山毛櫸Ehrh.的根部，該植物的葉綠體基因組全長(zhǎng)為70 028 bp，僅含42個(gè)基因，一半為蛋白質(zhì)編碼基因[30]。肉蓯蓉Y. C. Ma的葉綠體基因組大小為102 657 bp，含60個(gè)基因，其中編碼蛋白基因27個(gè)[31]。Molina等[32]以全寄生植物大王花Blanco的DNA為材料，檢測(cè)到17個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)rRNA和3個(gè)tRNA的基因片段，但無(wú)法拼接出完整的葉綠體基因組，推測(cè)該植物的葉綠體基因組已丟失。半寄生植物葉綠體中也有類似的基因組變小、基因丟失等現(xiàn)象。桑寄生與廣寄生的葉綠體基因組大小為121 363 bp和122 562 bp，它們各有106個(gè)基因，其中的蛋白編碼基因、tRNA及rRNA基因的數(shù)量分別為66、28和8，另有4個(gè)假基因[33]。與桑寄生和廣寄生相比，鈍果銹毛寄生的葉綠體基因多2個(gè)，但編碼蛋白基因數(shù)量一致，也為66個(gè)。大苞寄生(Merr.) Danser葉綠體基因組較鈍果寄生屬植物稍大，為123 581 ?bp，共有119基因，其中77個(gè)為編碼蛋白基因[34]。

在葉綠體基因組進(jìn)化過(guò)程中，假基因化是一種較為常見(jiàn)的現(xiàn)象，序列變異、IR區(qū)域的擴(kuò)張（expansion）和收縮（contraction）等是造成葉綠體基因組假基因化的原因[35]。金匙木屬L.植物中，IR變界部位的和為假基因[35]；芝麻L(zhǎng).葉綠體基因組中也有類似的現(xiàn)象，即IR變界處的和分別假基因化[36]。肉蓯蓉葉綠體基因組的假基因數(shù)量較多，共有24個(gè)，如、、、、和等[31]。而半寄生植物中，假基因化現(xiàn)象相對(duì)較少，桑寄生和廣寄生中，、和為假基因，其中的有2份拷貝[33]。與桑寄生和廣寄生類似，銹毛鈍果寄生的、和也發(fā)生假基因化，但銹毛鈍果寄生中，有2份拷貝。寄生植物葉綠體基因組基因丟失現(xiàn)象也十分普遍，山毛櫸寄生葉綠體中所有的RNA聚合酶基因及大部分tRNA和rRNA丟失[30]。肉蓯蓉葉綠體基因組的基因全部缺失，但保留了所有的tRNA基因[31]。與肉蓯蓉略有不同，銹毛鈍果寄生葉綠體基因組所有基因也發(fā)生丟失，并且它的tRNA成員不完整，、、、、和完全丟失?；虻木幋a蛋白NDH參與光系統(tǒng)I的電子傳遞，在光合反應(yīng)過(guò)程中起著重要作用，而的丟失，將影響銹毛鈍果寄生的光合作用，基因丟失與寄生習(xí)性密切相關(guān)。另外，在銹毛鈍果寄生葉綠體基因組中未能檢測(cè)到翻譯起始因子基因，類似現(xiàn)象出現(xiàn)于大葉胡頹子Thunb.、絲瓣剪秋羅(Regel) Maxim.、頭序蠅子草Kom.、細(xì)果野菱Korsh.和福氏紫薇Koehne等植物[37-39]。水平轉(zhuǎn)移在很多被子植物中均有發(fā)現(xiàn)，銹毛鈍果寄生中是否存在這一現(xiàn)象，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證[40]。

本研究以半寄生植物銹毛鈍果寄生為材料，在高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上，對(duì)葉綠體基因組進(jìn)行了拼接和邊界驗(yàn)證，并開展了序列特征與系統(tǒng)發(fā)育分析，為后續(xù)開展該物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chloroplast genome sequence characterization and phylogenetic analysis of

JIANG Ming1, WANG Jun-feng2, WU Dan3, ZHU Yan1, TANG Zi-yi1, HE Hai-ye1, ZHANG Hui-juan1

1. College of Life Sciences, Taizhou University, Jiaojiang 318000, China 2. Scientific Research Management Center, East China Medicinal Botanical Garden, Lishui 323000, China 3. Luqiao Hospital, Taizhou Enze Medical Center (Group), Luqiao 318050, China

In the present study, based on high-throughput sequencing and genome assembly methods, chloroplast genome structure, sequence characters, and phylogenetic relationships ofwere confirmed.The SDS-based DNA extraction method was applied to prepare genomic DNA, and the Illumina HiSeq X Ten System was used for high-throughput sequencing. NovoPlasty was chosen to assemble chloroplast genome. A phylogenetic tree was generated using PhyML.The complete chloroplast genome ofwas 122 208 bp in length with a GC content of 37.3%, and the sizes of LSC, SSC, and IR were 70 522 bp, 6 084 bp, and 22 801 bp, respectively. The chloroplast genome harbored 108 genes, and the numbers of protein-coding genes, tRNAs, and rRNAs were 66, 29 and 8, respectively. Additionally, there existed five pseudogenes. Genes including, alls, and sixs were completely lost. Sequence comparison results indicated that the highest similarity was observed betweenand, which reached 96.7%. Phylogenetic analysis revealed that the seven plants could be divided into five groups, and among them,andwere found to be gathered in the same clade, showing their highest sequence similarity.The assembly, sequence analysis, and phylogenetic analysis ofchloroplast genome provide insight into further studies on genetic structure and genetic diversity, and the results also provide evidences for evolution and phylogenetic analysis of Loranthaceae plants.

(Merr.) H. S. Kiu;(Lecomte) Danser;(DC.) Danser; chloroplast genome; sequence characterization; phylogenetic analysis

R286.2

A

0253 - 2670(2023)10 - 3273 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.024

2022-10-26

臺(tái)州市211人才工程經(jīng)費(fèi)資助（2012年度）

蔣 明，博士，教授，浙江嵊州人，研究方向?yàn)橹参锘蚪M學(xué)、植物逆境生物學(xué)及其分子調(diào)控。E-mail: jiangming1973@139.com

張慧娟，博士，副教授，浙江天臺(tái)人，研究方向?yàn)橹参锬婢成飳W(xué)及其分子調(diào)控。E-mail: zhanghj82@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]