馬 喆，宋志敏#，韓雅馨，龔慕辛，仇 峰，李 靜，賀 蕊

白芍總苷對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠長期給藥的組織分布研究

馬 喆1, 2，宋志敏1, 2#，韓雅馨1, 2，龔慕辛1, 2*，仇 峰1, 2，李 靜1, 2，賀 蕊1, 2

1. 首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069 2. 中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069

研究白芍總苷的主要成分芍藥苷、芍藥內酯苷對膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠長期給藥后的組織分布。建立超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）法，測定白芍總苷長期給藥后大鼠心、肝、脾、肺、腎、小腸、胸腺、滑膜等組織中芍藥苷和芍藥內酯苷的分布情況。長期給藥后，芍藥苷和芍藥內酯苷主要分布于小腸和腎，其次為脾、胸腺、滑膜、肝、肺、心。2種成分在CIA大鼠中的組織分布大多低于正常大鼠。揭示了白芍總苷長期給藥后的組織分布特征，為探討白芍總苷治療類風濕性關節(jié)炎的靶器官以及療效的改進提供了參考。

白芍總苷；膠原誘導性關節(jié)炎；組織分布；芍藥苷；芍藥內酯苷

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以多關節(jié)慢性炎性持續(xù)反復發(fā)作為特點的慢性、炎性、多系統(tǒng)性自身免疫性疾病，目前具體機制依然不清，尚無理想治療手段[1]。白芍總苷是從白芍Pall.根部提取的有效成分，其主要成分為芍藥苷、芍藥內酯苷等單萜苷類成分[2-3]，作為抗炎免疫調節(jié)藥在臨床上應用廣泛，治療RA具有療效確切、耐受性好、不良反應少、適合長期應用的優(yōu)點，但也存在起效慢、療效個體差異大的問題[4-6]。為了明確白芍總苷的作用機制與直接起效物質，目前國內外學者對白芍總苷相關成分及其制劑的作用機制以及白芍總苷給藥后的體內過程和代謝產(chǎn)物進行了大量研究[7-13]，取得了許多有價值的研究成果。然而，與臨床上白芍總苷治療RA長期用藥的情況不同，目前對其體內過程研究多為單次給藥或短期給藥，缺乏白芍總苷長期給藥后的組織分布研究。此外，已有針對白芍總苷藥動學研究多采用正常動物，在模型動物中的研究很少。而據(jù)報道，白芍總苷在佐劑性關節(jié)炎模型大鼠和正常大鼠中的藥動學行為存在顯著差異[12]。為了探討白芍總苷長期給藥的藥動學特征，以及與起效靶點、作用機制之間的關系，本研究在前期工作基礎上，建立了超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）法，進一步模擬臨床給藥方案，測定白芍總苷長期給藥后在膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠和正常大鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器以及小腸、胸腺、滑膜等免疫器官和主要病變組織中芍藥苷和芍藥內酯苷的組織分布，為探討其起效部位和作用機制提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量（220±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2015-0001。動物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物中心屏障環(huán)境內，室溫22～24 ℃，相對濕度55%～60%，每日光照12 h，自由飲水，實驗前適應性飼養(yǎng)7 d。倫理審查經(jīng)首都醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準（批準號AEEI-2014-128）。

1.2 藥品與試劑

白芍總苷膠囊（帕夫林，國藥準字H20055058，批號210502）購自寧波立華制藥有限公司，內容物0.3 g/粒，含有37.98%芍藥苷、11.70%芍藥內酯苷；對照品芍藥苷（批號PS161215-02，質量分數(shù)≥95%）、芍藥內酯苷（批號PS010200，質量分數(shù)＞97.5%）購自成都普思生物科技股份有限公司；內標物鹽酸丁螺環(huán)酮（批號6-EOD-111-1，質量分數(shù)＞98.0%）購自TRC公司；色譜級甲醇、乙腈、甲酸均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；分析純乙酸銨（批號631618，質量分數(shù)＞98.0%）購自天津市致遠化學試劑有限公司；娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈有限公司；牛源性Ⅱ型膠原蛋白（批號160425）、完全弗氏佐劑（批號160410）、不完全弗氏佐劑（批號160417）均購自美國Chondrex公司；EDTA脫鈣液（批號E1171）購自北京索萊寶科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液（批號G1005）、檸檬酸（pH 6.0）抗原修復液（批號G1202）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號G5001）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（批號GB11034）、組化試劑盒DAB顯色劑（批號G1211）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；中性樹膠（批號10004160）購自國藥集團化學試劑有限公司；二抗（批號K5007）購自DAKO公司。

1.3 儀器

1290 Inifinity型超高效液相色譜儀，配有G4220A泵、G1316C柱溫箱、G4226A進樣器、G1330B恒溫器（美國安捷倫公司）；QTRAP 6500型三重四極桿串聯(lián)液質聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS），ESI源-電噴霧離子源，Analyst質譜工作站軟件（美國Applied Biosystems公司）；MG-2200型氮吹儀（日本Eyela公司）；3K15型離心機（美國Sigma公司）；SI-T246型漩渦振蕩儀（美國Spectral Instruments公司）；PRO200型精密勻漿器（美國PRO Scientific公司）；超低溫冰箱（美國Fisher Thermo Scientific公司）；DV215CD型1/10萬電子天平（上海奧豪斯公司）；Matrx VMR小動物氣體麻醉機（美國MIDMARK公司）。

2 方法

2.1 CIA大鼠模型的建立

依據(jù)課題組前期建立的方法造模[14]。將牛II型膠原與完全弗氏佐劑按1∶1比例混合乳化完全，并將0.1 mL該乳液皮內注射于大鼠尾部距離尾根部1.5 cm處。21 d后，將牛II型膠原與與不完全弗氏佐劑按1∶1比例混合乳化完全，將0.1 mL該乳液皮內注射于大鼠尾部距離尾根部1.5 cm處。根據(jù)足部紅斑和腫脹對關節(jié)炎的程度進行評分，4個足爪的累計積分為關節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）。在造模第28天，AI≥4的大鼠視為造模成功。

2.2 動物分組和給藥

將正常大鼠隨機分為正常組和白芍總苷低、高劑量（158、474 mg/kg）組，每組12只。并將CIA大鼠隨機分為CIA組和CIA＋白芍總苷低、高劑量（158、474 mg/kg）組，每組12只。各給藥組連續(xù)ig白芍總苷膠囊內容物28 d，末次給藥后15 min、30 min、4 h、24 h記錄大鼠體質量并收集心、肝、脾、肺、腎、小腸、胸腺、滑膜組織樣品，用生理鹽水沖洗血漬并用濾紙吸去多余水分，記錄新鮮、干凈的各組織質量，通過器官質量與體質量的比值計算器官指數(shù)。取動物的后爪，儲存在10%中性福爾馬林中。

2.3 HE染色觀察踝關節(jié)病理變化

大鼠后爪在10%中性福爾馬林中固定48 h后，用20% EDTA脫鈣至骨軟化，乙醇脫水，石蠟包埋，然后沿縱軸切片，進行HE染色，于光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 免疫組化檢測滑膜中VEGF表達

滑膜組織用10%中性福爾馬林固定后，乙醇脫水，石蠟包埋，用3% H2O2孵育，置于枸櫞酸緩沖液中微波抗原修復。BSA封閉后，分別用VEGF抗體和二抗孵育，DAB顯色。切片用蘇木精復染細胞核，中性樹膠密封并掃描。用Image Pro Plus 6.0軟件對圖像進行處理，隨機計量5個視野的陽性顆粒總量，取平均值進行統(tǒng)計。

2.5 色譜條件

Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸和0.1%乙酸銨的水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～1 min，80% A；1～2 min，80%～60% A；2～4 min，60% A；4～4.5 min，60% A～100% B；4.5～6.5 min，100% B；柱溫25 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣體積1 μL。

2.6 質譜條件

采用電噴霧離子源，正離子模式檢測，多反應離子檢測模式（MRM）掃描；氣簾氣壓力40 psi（1 psi＝6.895 kPa）；噴霧電壓3000 V；離子源溫度120 ℃；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力55 psi；射入電壓10 V；碰撞室射出電壓13 V；2種成分及內標物的質譜工作參數(shù)見表1。

表1 LC-MS/MS法測定白芍總苷中2種成分以及內標物的質譜工作參數(shù)

2.7 對照品溶液制備

精密稱取芍藥內酯苷、芍藥苷對照品適量，加入甲醇制成每種成分為10 μg/mL的混合對照品儲備溶液，?20 ℃保存，備用。取混合對照品儲備液適量，加色譜甲醇逐級稀釋成0.016、0.040、0.080、0.200、0.400、1.00、2.00、5.00、10.0 μg/mL或0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、8.00、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL的系列混合標準工作溶液。精密稱取適量鹽酸丁螺環(huán)酮，用甲醇-乙腈（1∶1）溶液制成丁螺環(huán)酮質量濃度為0.05 μg/mL的內標溶液。

2.8 組織樣品制備

精密稱定各種組織0.5 g，加入3倍量預冷的生理鹽水，冰水浴勻漿，4 ℃、5000 r/min離心15 min，取上清液為組織樣品勻漿液。精密吸取100 μL勻漿液，依次加入10 μL甲醇、200 μL質量濃度為0.05 μg/mL的丁螺環(huán)酮甲醇-乙腈（1∶1）溶液，渦旋混合1 min，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，吸出上清液并氮氣吹干，臨檢測時加入100 μL甲醇，超聲5 min并渦旋1 min復溶，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，吸出上清液進樣分析。

滑膜質地較堅韌且質量過小，單個大鼠滑膜不足0.02 g，因此精確稱取滑膜，加入30倍量預冷的生理鹽水，冰浴勻漿。所得勻漿按照上述方法進行處理。

2.9 統(tǒng)計學分析

勻漿＝樣品

組織＝勻漿×勻漿/組織

為體積

3 結果

3.1 白芍總苷對CIA模型大鼠的藥效學研究

3.1.1 白芍總苷對CIA大鼠AI的影響 正常組大鼠足部無明顯紅斑和腫脹（AI＝0）。與正常組比較，CIA組大鼠在造模后第14天時足部紅斑和腫脹程度增加（AI＝6.34±0.14），在第28天關節(jié)炎指數(shù)進一步增加（AI＝9.63±0.14，＜0.01）。CIA＋白芍總苷低、高劑量組大鼠足部雖也有紅斑和腫脹，但與CIA組比較，在第14天（CIA＋白芍總苷低劑量組AI＝4.37±0.18，CIA＋白芍總苷高劑量組AI＝3.87±0.24）和第28天（CIA＋白芍總苷低劑量組AI＝5.99±0.26，CIA＋白芍總苷高劑量組AI＝4.55±0.46）時AI顯著降低（＜0.01），說明白芍總苷能改善CIA大鼠關節(jié)炎程度。

3.1.2 白芍總苷對大鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響 如圖1所示，與正常組比較，白芍總苷低、高劑量組和CIA組脾臟指數(shù)顯著升高（＜0.05、0.01）；與CIA組比較，CIA＋白芍總苷低劑量組脾臟指數(shù)顯著降低（＜0.01），說明白芍總苷對CIA大鼠脾臟指數(shù)的影響可能與給藥劑量有關，不同劑量白芍總苷的影響可能不同。本研究未觀察到白芍總苷對正常和CIA大鼠胸腺指數(shù)的影響，但在課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)白芍總苷給藥12周后可降低大鼠胸腺指數(shù)[13]，可能與本研究給藥時間短有關。

3.1.3 白芍總苷對大鼠踝關節(jié)病理和滑膜中VEGF表達的影響 如圖2-A所示，CIA組關節(jié)面軟骨被侵蝕，滑膜組織增生，表明模型組大鼠造模成功；白芍總苷可以保護關節(jié)軟骨，抑制滑膜組織增生。如圖2-B、C所示，正常組大鼠膝關節(jié)滑膜有少量的VEGF陽性細胞表達，CIA組VEGF表達顯著升高（＜0.01）；與CIA組比較，CIA＋白芍總苷低、高劑量組VEGF表達顯著降低（＜0.01）。說明CIA大鼠滑膜中VEGF表達明顯增加，白芍總苷可以明顯抑制其增加。藥效學實驗證明CIA大鼠造模成功且白芍總苷對CIA大鼠具有較好的療效，為后續(xù)進行組織分布研究奠定了基礎。

3.2 方法學考察

3.2.1 專屬性 比較從6只不同大鼠獲得的空白組織、加混合對照品及內標的空白組織、白芍總苷末次給藥后24 h采集的體內組織樣本的峰，空白大鼠組織勻漿中的內源物不干擾芍藥內酯苷、芍藥苷的測定，方法專屬性良好，各組織色譜圖見圖3。

TGP-L-低劑量白芍總苷 TGP-H-高劑量白芍總苷 與正常組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與CIA組比較：▲▲P＜0.01，圖2同

圖2 白芍總苷對大鼠踝關節(jié)病理(A) 和滑膜中VEGF表達(B) 的影響(, n = 6)

A-空白組織樣本 B-添加了內標、芍藥內酯苷、芍藥苷的組織樣本 C-末次給藥24 h后的組織樣本

3.2.2 標準曲線與線性范圍 分別取心、脾、肺、小腸、胸腺、滑膜空白組織勻漿液100 μL，再分別加入10 μL不同濃度的系列混合標準溶液和200 μL質量濃度為50 ng/mL的丁螺環(huán)酮甲醇-乙腈（1∶1）溶液，其余操作按照“2.8”項下處理，配制成待測成分為1.60、4.00、8.00、20.0、40.0、100、200、500、1000 ng/mL的系列組織樣品；再分別取肝、腎空白組織勻漿液100 μL，按照上述方法配制成待測成分為5.00、10.0、20.0、50.0、100、200、500、1000、2000、5000 ng/mL的系列組織樣品，以待測物濃度為橫坐標（），待測物與內標物丁螺環(huán)酮的峰面積比值為縱坐標（），以加權最小二乘法作線性回歸，芍藥內酯苷的權重為1/2，芍藥苷的權重為1/。各組織中各成分的回歸方程見表2。

表2 白芍總苷在不同組織中的線性回歸方程與線性范圍

3.2.3 精密度和準確度 按“3.2.2”項下方法操作，分別制備心、脾、肺、小腸、胸腺、滑膜含芍藥苷、芍藥內酯苷的低、中、高質量濃度的質控樣品（4.00、40.0、800 ng/mL）和肝、腎含芍藥苷、芍藥內酯苷的低、中、高質量濃度的質控樣品（5.00、200、5000 ng/mL），每個濃度制備的6個樣品來自不同供體。連續(xù)進樣3 d，記錄2種成分的色譜峰面積和內標峰面積的比值，代入隨行標準曲線算出相應的濃度，計算批內精密度、批間精密度及準確度。各成分在組織中精密度和準確度測定結果見表3?？梢姷?、中、高3個質量濃度下2種成分在相應組織的精密度和準確度均小于15%，符合生物樣品檢測的要求。

表3 采用LC-MS/MS法測定不同組織中成分的精密度和準確度(, n = 6)

3.2.4 穩(wěn)定性 取空白勻漿液100 μL，按“3.2.2”項下方法操作，分別配制低、中、高濃度的質量控制樣品，每個濃度制備5個樣品。在室溫放置24 h后進樣，考察室溫下樣品穩(wěn)定性。樣品預處理后于?80 ℃冰箱中凍存，然后取出室溫下解凍，如此反復凍融3次后進樣分析，考察3次凍融后的穩(wěn)定性；樣品預處理后于?80 ℃冰箱凍存30 d后進樣分析，考察長期凍存穩(wěn)定性。如表4所示，在3種考察條件下，低、中、高3個質量濃度不同成分在相應組織的精密度和準確度均小于15%，在所考察條件下穩(wěn)定性良好。

3.2.5 提取回收率與基質效應 取空白勻漿液100 μL，按“3.2.2”項下方法操作，分別配制低、中、高質量濃度的質控樣品，每個質量濃度分別使用來自不同供體的6個空白組織，處理后進樣分析獲得相應峰面積值均值（1）。

表4 采用LC-MS/MS法測定各組織中成分的穩(wěn)定性考察(, n = 5)

另取空白勻漿液100 μL，加入10 μL甲醇、200 μL甲醇-乙腈（1∶1）溶液，制備得到不含內標的空白溶液，離心后獲得上清液，氮氣吹干，加入10 μL甲醇、200 μL內標溶液，制成低、中、高3個質量濃度的未經(jīng)提取的對照樣品，每個質量濃度分別使用來自不同供體的6個空白組織，處理后進樣分析獲得相應峰面積值均值（2）。

取不同質量濃度的標準溶液加入內標溶液，氮氣吹干后用甲醇稀釋成低、中、高3個質量濃度的標準對照樣品，每質量濃度制備6個樣品，獲得相應峰面積均值（3）。以1/2計算提取回收率，2/3計算基質效應。如表5所示，化合物的提取回收率為89.57%～117.24%，化合物的基質效應為88.45%～109.24%，說明該方法是穩(wěn)定和可行的。

表5 不同組織中2種成分的基質效應和提取回收率 (n = 6)

3.3 組織分布研究

如表6所示，白芍總苷給藥后在體內迅速分布，在30 min之內各組織芍藥內酯苷、芍藥苷含量達到峰值，說明這2種成分吸收較快，能夠迅速達到各個組織，而在給藥24 h后含量較少，說明其代謝速度較快，不易在體內蓄積。對比各組織之間成分含量可以發(fā)現(xiàn)，芍藥內酯苷、芍藥苷在小腸中的含量遠高于其他各組織，腎臟中芍藥內酯苷、芍藥苷含量僅次于小腸，腎臟中的含量高這一結果從側面說明了白芍總苷在大鼠體內消除快且滯留時間短。脾臟中芍藥內酯苷、芍藥苷含量也相對較高，結合藥效學研究結果可以發(fā)現(xiàn)，白芍總苷給藥后可以降低CIA大鼠脾臟系數(shù)，加之本實驗發(fā)現(xiàn)不同劑量給藥后芍藥內酯苷和芍藥苷在CIA大鼠脾臟內的消除速度均較正常動物慢，這說明CIA大鼠白芍總苷多劑量給藥后芍藥內酯苷和芍藥苷能更快地分布到脾臟，且在脾臟停留更長時間。而其他組織中芍藥內酯苷、芍藥苷含量相對較低，對比給藥白芍總苷后芍藥內酯苷、芍藥苷含量可見各組織在同一時間點正常組和模型組大鼠存在一定差異，說明病理狀態(tài)對大鼠的器官造成了一定的影響，從而影響了組織分布情況。

表6 大鼠給藥后組織分布(, n = 3)

續(xù)表6

組織成分分組質量分數(shù)/(ng·g?1) 15 min30 min4 h24 h 腎臟芍藥內酯苷TGP-L3 638.70±692.091 131.21±606.08357.32±39.60ND CIA＋TGP-L1 765.04±756.90*2 101.02±938.09910.43±218.09*80.01±13.83** TGP-H1 412.08±435.55**4 013.00±1 838.492 743.34±390.07**52.40±6.72** CIA＋TGP-H2 539.09±1 031.435 002.06±757.33Δ1 678.27±302.48Δ#ND 芍藥苷TGP-L13 726.99±1 877.344 328.29±1 912.092 089.05±539.0943.30±13.84 CIA＋TGP-L8 303.57±2 724.78*7 915.06±775.41*757.00±75.40*92.21±15.14* TGP-H4 169.34±566.43**10 582.00±1 423.33**3 471.21±697.0760.72±24.31 CIA＋TGP-H2 256.42±884.00Δ#14 772.48±2 210.00ΔΔ4 470.42±831.07ΔND 小腸芍藥內酯苷TGP-L3 602.34±434.633 298.04±589.67305.08±124.0063.14±33.60 CIA＋TGP-L1 975.70±491.971 887.16±541.39171.35±9.1076.77±37.84 TGP-H16 078.11±6 978.84**3 668.88±1 496.90381.01±67.9047.94±5.92 CIA＋TGP-H17 973.78±1 917.88ΔΔ6 790.90±2 569.20ΔΔ#650.71±202.10ΔΔ#32.53±12.14 芍藥苷TGP-L13 882.43±3 389.9112 501.80±2 921.301 248.40±580.54204.64±122.60 CIA＋TGP-L9 622.60±3 121.616 485.30±1 560.60289.00±48.51*205.79±78.23 TGP-H40 858.77±5 786.00**14 467.49±3 163.005 147.30±372.62**193.26±49.51 CIA＋TGP-H47 087.90±3 287.20ΔΔ23 000.30±7 294.01ΔΔ#2 221.15±137.10ΔΔ##128.63±43.30 胸腺芍藥內酯苷TGP-L785.34±192.40309.51±168.2135.29±15.5220.31±4.60 CIA＋TGP-L600.28±172.87196.08±18.0233.12±9.7017.47±8.32 TGP-H1 443.20±293.52**222.77±27.83313.09±32.80**48.48±25.40 CIA＋TGP-H1 087.40±81.37Δ226.99±67.01120.40±32.30ΔΔ##4.68±1.80 芍藥苷TGP-L5 225.80±742.932 305.80±443.90269.38±60.1045.80±12.91 CIA＋TGP-L2 678.60±712.70**1 308.40±71.70**229.79±7.30162.36±42.31** TGP-H6 702.81±1 175.761 541.20±322.20*1 537.72±327.54**254.67±32.21** CIA＋TGP-H4 833.15±613.22Δ#1 855.50±44.30Δ638.24±152.42Δ##90.48±6.70Δ## 滑膜芍藥內酯苷TGP-L63.60±28.81352.58±14.90308.43±163.33ND CIA＋TGP-L279.30±31.51**417.40±65.20255.53±100.74ND TGP-H583.10±63.60**1 514.01±533.01**405.20±157.60ND CIA＋TGP-H592.30±15.50ΔΔ466.20±76.13##635.40±183.42ΔND 芍藥苷TGP-L537.10±114.702 752.96±435.201 523.80±349.84199.43±47.30 CIA＋TGP-L1 035.89±109.00*1 458.38±110.502 020.21±458.31445.90±94.91** TGP-H2 533.00±347.50**5 198.80±1 812.40*1 760.52±128.52355.00±19.00** CIA＋TGP-H2 399.91±111.30ΔΔ1 782.43±268.50##1 452.64±493.60180.20±20.22ΔΔ##

ND-未檢測到；TGP-L-低劑量白芍總苷，TGP-H-高劑量白芍總苷 與TGP-L組比較：*＜0.05**＜0.01；與TGP-H組比較：#＜0.05##＜0.01；與CIA＋TGP-L組比較：Δ＜0.05ΔΔ＜0.01

ND-no detected; TGP-L-low-dose total glucosides of paeony, TGP-H-high-dose total glucosides of paeony*< 0.05**< 0.01TGP-L group;#< 0.05##< 0.01TGP-H group;Δ< 0.05ΔΔ< 0.01CIA + TGP-L group

4 討論

4.1 檢測方法的優(yōu)化

在正離子模式下分別對白芍總苷中2個組分進行檢測，發(fā)現(xiàn)在流動相中加入可促進各組分電離的乙酸銨后響應更好，但含量較高時易析出沉淀，堵塞色譜柱及儀器管道，故選用0.1%乙酸銨。芍藥苷濃度較高時，易殘留在色譜柱中，可選用洗脫能力較強的乙腈，并增長洗針時間。同時在流動相中加入0.1%甲酸，可改善芍藥苷拖尾的情況。

4.2 檢測組織的選擇

課題組前期研究表明，白芍總苷長期給藥能降低CIA大鼠的胸腺（給藥12周）、脾臟指數(shù)（給藥8周），降低CIA大鼠VEGF的表達，減輕滑膜病變，同時發(fā)現(xiàn)白芍總苷可以顯著降低CIA大鼠小腸組織的γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）含量，下調小腸分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）分泌，從而下調腸黏膜免疫應答，并可以糾正CIA大鼠與正常大鼠相比的腸道菌群紊亂，證明了白芍總苷對CIA大鼠的治療作用可能與腸道有關。此外，還發(fā)現(xiàn)白芍總苷可以改變血中的免疫相關指標[14]，胸腺和脾臟是重要的免疫器官[15]，滑膜是類風濕關節(jié)炎的重要病變部位[16-17]，腸道黏膜免疫在類風濕性關節(jié)炎的治療中具有重要作用[18]。因此，本實驗測定了心、肝、脾、肺、腎等主要臟器以及小腸、胸腺、滑膜等免疫器官和主要病變組織中的含量，以探究白芍總苷相關成分在正常和模型大鼠中的分布特征。

4.3 組織分布結果

本研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷中芍藥內酯苷在CIA模型大鼠不同組織中的分布順序為：腸＞腎＞脾＞胸腺＞肝＞滑膜＞肺＞心，在正常大鼠不同組織中的分布順序為：腸>腎＞脾＞滑膜＞胸腺＞肝＞肺＞心；白芍總苷中芍藥苷在CIA模型大鼠不同組織中的分布順序為：腸＞腎＞脾＞胸腺＞滑膜＞肝＞肺＞心，在正常大鼠不同組織中的分布順序為：腸＞腎＞脾＞胸腺＞滑膜＞肺＞肝＞心?？梢娦∧c組織芍藥內酯苷和芍藥苷含量均高于其他組織，結合課題組前期研究結果，進一步說明其可能是白芍總苷的主要作用部位。芍藥內酯苷和芍藥苷在腎臟中分布較多，這一結果側面支持了白芍總苷在大鼠體內消除快且滯留時間短的結論[19]。而芍藥內酯苷和芍藥苷在心臟、肝臟、脾臟、肺、胸腺和滑膜中分布較少。

芍藥內酯苷、芍藥苷在正常大鼠胸腺中分布較CIA組多。低劑量給藥時，芍藥內酯苷、芍藥苷在正常組小腸內的分布多于CIA組；高劑量給藥時，芍藥內酯苷、芍藥苷在正常組滑膜內的分布多于CIA組，這些結果可能與P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的外排有關，P-gp是一種能量依賴性藥物外排泵，可以將細胞內的藥物泵出細胞，從而降低細胞內的藥物濃度[20]。P-gp主要分布于空腸絨毛的吸收細胞中，也存在于滑膜、脾臟、肺等組織中[21]，CIA大鼠的滑膜、脾臟和腸道中P-gp的表達明顯高于正常小鼠[22]。大多數(shù)文獻證明芍藥苷是P-gp的底物[23-25]，有文獻支持芍藥內酯苷可能是P-gp的底物[26]，也有學者認為芍藥內酯苷可能不是P-gp的底物[27-28]。不同組織中P-gp含量和表達的差異可能是芍藥內酯苷和芍藥苷分布差異的原因之一。胸腺細胞中P-gp的活性和水平隨著胸腺細胞的成熟和CD3表達的增加而增加[29]，而類風濕性關節(jié)炎可導致CD3水平升高[30]，因此P-gp的活性水平在模型組胸腺中可能高于正常組。值得注意的是，在高劑量給藥時，CIA組腸道組織中的芍藥內酯苷和芍藥苷比正常組分布更多，這表明除了P-gp之外，可能還有其他因素影響TGP主要成分的吸收。這些因素使劑量增加對分布的影響超過了P-gp的影響。

心臟和肝臟中芍藥內酯苷和芍藥苷的含量較低，而已有的一些研究表明心臟和肝臟組織中芍藥內酯苷和芍藥苷的含量較高[7-8]，這可能是由于本研究中對心臟和肝臟組織進行灌洗，除去了大量血液導致。白芍總苷給藥后，芍藥內酯苷和芍藥苷在尿中排泄迅速，但主要排泄途徑為經(jīng)膽汁排泄[31]，這也可能是肝臟中白芍總苷含量較低的原因?；ず托叵偕涎┹^少，但芍藥內酯苷、芍藥苷含量高于肝、心、肺，說明比起普通組織，芍藥內酯苷和芍藥苷更容易到達滑膜和胸腺，而其機制需要進一步研究。

綜上，白芍總苷主要成分的生物利用度較低，多劑量給藥后，廣泛分布于大鼠的腸組織和腎臟，在心臟、肝臟、脾臟、肺、胸腺和滑膜中分布較少，并且發(fā)現(xiàn)芍藥內酯苷、芍藥苷在組織中消除較快，給藥后4～24 h未檢出成分或各組織中含量極低，說明白芍總苷主要成分原型不易在體內蓄積。白芍總苷主要成分在體內的快速清除提示應考慮每天多次給藥，以維持體內藥物水平。此前研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷對CIA大鼠腸黏膜免疫有顯著影響，結合芍藥內酯苷、芍藥苷在腸組織的大量分布，腸道組織可能是白芍總苷治療RA的有效部位和靶點，白芍總苷有可能直接作用于腸道，維持腸黏膜的免疫平衡，發(fā)揮治療作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Tissue distribution of total glucosides of paeony after long-term administration in collagen-induced arthritis rats

MA Zhe1, 2, SONG Zhi-min1, 2, HAN Ya-xin1, 2, GONG Mu-xin1, 2, QIU Feng1, 2, LI Jing1, 2, HE Rui1, 2

1. School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China 2. Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research, Beijing 100069, China

To study the tissue distribution of paeoniflorin and albiflorin, the main components of total glucosides of paeony, in collagen-induced arthritis (CIA) rats after long-term administration.UPLC-MS/MS method was established to determine the distribution of paeoniflorin and albiflorin in heart, liver, spleen, lung, kidney, small intestine, thymus and synovium of rats after long-term administration.After long-term administration, paeoniflorin and albiflorin were mainly distributed in small intestine and kidney, followed by spleen, thymus, synovium, liver, lung and heart. The tissue distribution of the two components in CIA rats were mostly lower than that in normal rats.The tissue distribution characteristics of total glucosides of paeony after long-term administration are revealed, which provides a reference for exploring the target organ of total glucosides of paeony in the treatment of rheumatoid arthritis and improving the curative effect.

total glucosides of paeony; collagen-induced arthritis; tissue distribution; paeoniflorin; albiflorin

R285.61

A

0253 - 2670(2023)10 - 3167 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.014

2022-12-16

國家自然科學基金面上項目（81773860）；北京市教育委員會科學研究計劃項目資助（KM201910025021）

馬 喆，碩士研究生，主要從事中藥復方物質基礎研究。E-mail: 1144938549@qq.com

龔慕辛，教授，主要從事中藥復方物質基礎研究。E-mail: gongmuxin@126.com

#共同第一作者：宋志敏，博士研究生，主要從事中藥復方物質基礎研究。E-mail: songzhimin00@163.com

[責任編輯 李亞楠]