劉素如

上世紀(jì)初期,高效液相色譜法開始出現(xiàn),之后經(jīng)過不斷發(fā)展得到了廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)階段,諸如生物醫(yī)藥、食品科學(xué)以及生命科學(xué)等諸多領(lǐng)域均已在應(yīng)用這一技術(shù),而其中應(yīng)用最多的莫過于藥品檢驗(yàn)。由現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》中規(guī)定的內(nèi)容可知,此法的應(yīng)用具有科學(xué)性和廣泛性,因而在藥品檢驗(yàn)中得到了非常迅速的發(fā)展。就現(xiàn)階段的實(shí)際情況來說,我國(guó)藥品檢驗(yàn)的一個(gè)主要檢測(cè)方法就是高效液相色譜法,相關(guān)研究結(jié)果也表明,此法和普通檢驗(yàn)方法相比,檢驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確,因此針對(duì)高效液相色譜法在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用展開深入探究,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 高效液相色譜法概述

高效液相色譜法,英文簡(jiǎn)稱為HPLC,屬于色譜法范疇,在高壓輸液系統(tǒng)的輔助下泵入色譜柱內(nèi)不同極性的溶劑、緩沖液等,并分離相關(guān)成分,借助特定儀器展開檢測(cè),最終有效分析樣本。見圖1。現(xiàn)階段已將其作為一項(xiàng)重要的分離和分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于包括醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)等在內(nèi)的多個(gè)領(lǐng)域［1］。此法相較于經(jīng)典色譜法來說存在明顯差別,通過對(duì)新型高壓輸液泵、固定相的使用,增加了檢驗(yàn)結(jié)果的精確度,也讓溶劑以最短的時(shí)間通過色譜柱,加快分離,分離速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過經(jīng)典色譜法。社會(huì)的快速發(fā)展,讓高效液相色譜法也衍生出了包括離子交換色譜法、分子排阻色譜法以及吸附色譜法等在內(nèi)的各種分支類型。

圖1 高效液相色譜技術(shù)裝置圖

2 高效液相色譜法原理、特點(diǎn)分析

高效液相色譜法以液體為流動(dòng)相,而在色譜中最關(guān)鍵的一個(gè)部分就是高壓輸液系統(tǒng)［2］。這一方法借助高壓輸液泵,將比例或是極性不同的溶劑充分混合,向固定相的實(shí)驗(yàn)色譜柱中泵入制成的流動(dòng)相,再借助進(jìn)樣閥向其中注入檢測(cè)樣品,以流動(dòng)相和柱內(nèi)相通,之后再完全分離柱內(nèi)液體,將其慢慢滲入到檢測(cè)器內(nèi)并進(jìn)行監(jiān)測(cè),從而完成試樣化學(xué)分析。高效液相色譜法的應(yīng)用主要借助三部分內(nèi)容,分別是高效微粒固定相、新型高壓輸液泵以及高靈敏度檢測(cè)器,三者合用將經(jīng)典液相色譜法優(yōu)勢(shì)充分發(fā)揮了出來。目前,高效液相色譜法在具體應(yīng)用時(shí)采用了高效色譜填料、小口徑柱,借助高壓輸液泵使溶劑能夠更快的流通,盡快通過色譜柱。由于高效液相色譜法所采用的高壓輸液泵工作效率非常高,因此在對(duì)藥物成分進(jìn)行檢測(cè)時(shí)花費(fèi)的時(shí)間較短,同時(shí)借助色譜柱進(jìn)行分離,極大的提高了分離效果與檢測(cè)速度。與經(jīng)典柱色譜法相比,其能夠更快的完成分離,部分甚至超過1000倍以上。因此,高靈敏、高壓、高效和高速是高效液相色譜法主要特點(diǎn),因此高效液相色譜法在臨床上具有越來越廣的應(yīng)用范圍。

3 高效液相色譜法在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用

3.1 藥品有效成分檢驗(yàn) 就高效液相色譜法而言,其最關(guān)鍵的一項(xiàng)內(nèi)容就是藥品有效成分檢驗(yàn),對(duì)藥品質(zhì)量與安全具有直接影響。每一種新藥在進(jìn)入市場(chǎng)之前均要接受嚴(yán)格的質(zhì)量檢驗(yàn),對(duì)藥物中的有效成分予以掌握,在與標(biāo)準(zhǔn)要求相符之后才能上市。通過對(duì)高效液相色譜法的應(yīng)用,能夠得到靈敏而精確的檢驗(yàn)結(jié)果,并針對(duì)藥品有效藥物成分實(shí)施目標(biāo)檢驗(yàn),從而將藥物中附形劑帶給結(jié)果數(shù)據(jù)的不良影響降至最低。比如,在利用高效液相色譜法檢驗(yàn)黃芩片有效成分——黃酮含量時(shí),整個(gè)操作過程較為簡(jiǎn)單,也取得了精準(zhǔn)可靠的檢驗(yàn)結(jié)果。通過這一類技術(shù)對(duì)藥物有效成分的測(cè)定,可保障藥物質(zhì)量,推動(dòng)藥品出口［3］。借助高效液相色譜法檢驗(yàn)藥品質(zhì)量,檢測(cè)各區(qū)域有效成分的含量,對(duì)每個(gè)部分的含量進(jìn)行比較,從而可篩選出最優(yōu)質(zhì)量區(qū)段。可以看出,在藥品檢驗(yàn)時(shí)依據(jù)藥物特點(diǎn)選擇高效液相色譜法,不僅操作簡(jiǎn)單方便,還能保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

3.2 藥物鑒別 每一種藥物的藥用價(jià)值均存在差異,因此一定要仔細(xì)鑒別藥物,使其作用能得到充分發(fā)揮［4］。通過高效液相色譜法對(duì)藥物進(jìn)行鑒別,可將時(shí)間、組分結(jié)構(gòu)、性質(zhì)保留下來,并把其當(dāng)做藥物定性的參數(shù)。比如,在鑒別南北五味子時(shí),借助高效液相色譜法測(cè)定兩種五味子中組分含量,采用C18 柱,流動(dòng)相是配比為65∶35 的甲醇與水,控制流速在1.0 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)≤250 nm,如此可在最短時(shí)間內(nèi)把南北五味子的組分含量鑒別出來?？梢?高效液相色譜法的合理運(yùn)用,能夠?yàn)樗幤疯b別工作提供新的思路和方法。

3.3 藥品含量檢測(cè) 針對(duì)藥物原料中諸多雜質(zhì)和成分,均可應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè),其花費(fèi)的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),準(zhǔn)確性與可靠性也很高［5］。比如,在對(duì)阿司匹林腸溶片進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí),由于此藥屬于水楊酸類化合物,很容易被水解和氧化成醌型物質(zhì),因而水溶液不具良好的化學(xué)穩(wěn)定性,對(duì)此便可采取高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。以1%冰醋酸的甲醇溶液為溶劑,一方面能夠提高藥物溶解性,另一方面也可增強(qiáng)溶液的穩(wěn)定性,使檢驗(yàn)結(jié)果更加理想。采用高效液相色譜法對(duì)四環(huán)素類藥物進(jìn)行檢測(cè),能夠?qū)⑺沫h(huán)素類立體異構(gòu)體與其自身有效分離。對(duì)復(fù)方金銀花顆粒溶液中的有機(jī)酸含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí),可利用高效液相色譜法區(qū)分有機(jī)酸的類型,便于分析藥物代謝機(jī)制?？傊?以高效液相色譜法對(duì)藥品進(jìn)行檢驗(yàn)、檢測(cè),可準(zhǔn)確檢查原藥品中的雜質(zhì)限量、成分含量以及中間體含量,防止假藥劣藥的出現(xiàn),在確保藥品質(zhì)量的同時(shí),提高用藥的安全性［6］。

3.4 抗生素檢驗(yàn) 臨床在使用抗生素類藥物時(shí),患者很容易出現(xiàn)不良反應(yīng),究其原因在于藥物中有中間體、聚合物和降解產(chǎn)物存在,而借助高效液相色譜法則能夠明確各類抗生素藥品中的雜質(zhì)限量,從而科學(xué)指導(dǎo)臨床用藥［7］。以氨芐西林膠囊為例,針對(duì)其雜質(zhì)限量,就可用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè),在最短時(shí)間內(nèi)將藥物的主成分和降解產(chǎn)物、有關(guān)物質(zhì)相分離,對(duì)制劑限度予以控制?，F(xiàn)階段,我國(guó)抗菌藥物均必須進(jìn)行抗生素含量的測(cè)定,同時(shí)還包括大量的動(dòng)物源性食品,以免人們?cè)陲嬍尺^程中攝入抗生素殘留,引起藥物體內(nèi)蓄積,產(chǎn)生不適,影響身體健康［8］。

3.5 中藥質(zhì)量檢測(cè) 中藥具有復(fù)雜的成分,對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)往往比較困難,采用常規(guī)的檢測(cè)方法尚難提高結(jié)果的準(zhǔn)確性［9］。針對(duì)中藥成分多、分離難的問題,高效液相色譜法已成為測(cè)定中藥有效成分含量非常有效的一種方法。具體體現(xiàn)在：針對(duì)中藥的待測(cè)組分和其他雜質(zhì),高效液相色譜法可在最短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)二者的分離,保證后續(xù)中藥鑒別、檢查和含量測(cè)定環(huán)節(jié)的順利開展。比如,針對(duì)復(fù)方丹參滴丸中的丹參素和兒茶醛的含量,借助高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定,效果非常好,不僅具有較高的分離度,且定量準(zhǔn)確,讓定性檢測(cè)存在的問題得到了較好的解決。所以,將高效液相色譜法應(yīng)用于中藥質(zhì)量檢測(cè)中,分離度佳、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可定量、定性分析測(cè)定中藥產(chǎn)品中的有效成分,有助于實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量檢測(cè)的現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。

3.6 手性藥物檢測(cè) 除了在以上幾方面發(fā)揮了積極的作用外,高效液相色譜法也可用于檢測(cè)一些難度較大的手性藥物。一般來說,手性化合物可通過以下幾種方法獲得,包括不對(duì)稱合成、外消旋體拆分、天然物的提取以及生物合成等。據(jù)了解,手性藥物及其相應(yīng)的對(duì)映異構(gòu)體,物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)基本相同,因此,在對(duì)其進(jìn)行分離與鑒別時(shí),操作難度就比較大［10］。而高效液相色譜法則可憑借其自身的高靈敏性,在不用進(jìn)行衍生化的前提下分析、檢測(cè)手性藥物。目前,在手性藥物分析中,最常見的一種方法就是色譜分離法,其共包含三部分內(nèi)容,分別是臨界流體色譜、高效毛細(xì)管電泳色譜與高效液相色譜,對(duì)手性藥物拆分意義重大。針對(duì)分離起來比較困難的手性藥物,可先做衍生化反應(yīng),使一個(gè)非對(duì)映異構(gòu)分子形成,接著再完成分離檢測(cè)?？傊?高效液相色譜法不論是在手性新藥研究,手性藥物代謝,還是質(zhì)量控制過程均有非常高的應(yīng)用價(jià)值,且同時(shí)還具有很廣泛的發(fā)展前景［11］。

3.7 非添加化學(xué)成分檢驗(yàn) 近年來,日趨激烈的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng),導(dǎo)致市場(chǎng)上出現(xiàn)了諸多聲稱有藥物治療作用的保健品或假藥,而其制假的方式無一例外的都是以非法方式添加化學(xué)成分［12］。因此,在對(duì)非法添加的化學(xué)成分進(jìn)行檢驗(yàn)的過程中,高效液相色譜法是必不可少的分析方法。薄層色譜法與之相比,相對(duì)比較復(fù)雜,誤差率較高,專屬性較差。而高效液相色譜法不論是分析能力,還是分離效果均比較強(qiáng),能夠快速進(jìn)行定量檢查,并對(duì)藥物成分開展分離定性,以保證藥品質(zhì)量,確保藥物作用達(dá)到最優(yōu)。

4 高效液相色譜新技術(shù)的發(fā)展

現(xiàn)階段,正處于發(fā)展中的高效液相色譜新技術(shù)主要有3 種,分別是高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)技術(shù)(HPLC-ELSD)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)和快速高效液相色譜技術(shù)［13］。HPLCELSD 技術(shù)通過結(jié)合蒸發(fā)光檢測(cè)技術(shù)和高效液相色譜技術(shù),讓過去被含發(fā)色團(tuán)的化合物檢測(cè)范圍所限制的問題得到了有效解決,進(jìn)而使高效液相色譜技術(shù)被應(yīng)用于更大的范圍內(nèi)。HPLC-MS 技術(shù)是在液相色譜技術(shù)上運(yùn)用質(zhì)譜儀把復(fù)雜的有機(jī)混合物給有效分離,該種技術(shù)主要就是對(duì)質(zhì)譜儀強(qiáng)大的組分鑒定能力予以了運(yùn)用?？焖俑咝б合嗌V技術(shù)是基于高效液相色譜技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化了色譜參數(shù),同時(shí)升級(jí)、改造了柱子,讓柱子面對(duì)高壓也能夠較好的承受,使柱效增加,進(jìn)而提高高效液相色譜技術(shù)的速度、效率,使檢測(cè)可以在更短的時(shí)間內(nèi)完成［14］。

5 實(shí)際案例應(yīng)用

以復(fù)方氨基酸注射液為例,在對(duì)其焦谷氨酸含量進(jìn)行測(cè)定時(shí),就可對(duì)高效液相色譜技術(shù)予以采用,借以體現(xiàn)在藥品檢驗(yàn)中,高效液相色譜技術(shù)的應(yīng)用效果,具體來說就是,當(dāng)人體未充分吸收到蛋白質(zhì)時(shí),受氨基酸過低的影響,機(jī)體便會(huì)出現(xiàn)新陳代謝障礙,而這個(gè)時(shí)候若對(duì)藥物復(fù)方氨基酸注射液予以使用,則能夠讓患者接收到充足的蛋白質(zhì),進(jìn)而使術(shù)后營(yíng)養(yǎng)狀況得到有效改善［15］。按照氨基酸總量,這一藥物可分為兩種規(guī)格,即 5% 與12%,而含L-谷氨酸含量也有兩種,分別是0.75 mg/ml 和1.80 mg/ml。因?yàn)楸仨氃诟邷貤l件下制備產(chǎn)品,所以極易導(dǎo)致藥物中有焦谷氨酸產(chǎn)生,對(duì)此就可借助高效液相色譜技術(shù)來測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液中焦谷氨酸的含量。

在具體測(cè)定時(shí),應(yīng)優(yōu)化色譜條件、測(cè)定方法。以Agilent ZORBAXSB-C18 色譜柱作為首選,其耐酸性非常強(qiáng),能夠?qū)悠分械牟煌M分峰有效分離,且柱溫一定要控制在適宜范圍內(nèi),以便提高柱效。為了讓分離效果更為理想,設(shè)定pH 值為1.6。同時(shí)將樣品過柱環(huán)節(jié)省略,直接測(cè)定樣品,也降低成分含量,獲得準(zhǔn)確性、可靠性更高的測(cè)定結(jié)果。

綜上所述,隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的日新月異,人們?cè)絹碓阶⒅厮幤返陌踩唾|(zhì)量,只有實(shí)現(xiàn)藥品檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展,才能從根本上保障廣大人民群眾用藥的安全性。隨著高效液相色譜技術(shù)在大范圍內(nèi)的應(yīng)用,人們的用藥安全已經(jīng)得到了基本的保障,該檢測(cè)技術(shù)在今后的發(fā)展空間廣闊、前景遠(yuǎn)大,值得人們引起高度重視。