章霞,徐志進,李偉業(yè),殷小龍,王易帆,陳爽,馬雪彬
(浙江省舟山市水產(chǎn)研究所,浙江 舟山 316000)
大黃魚(Larimichthyscrocea)隸屬于鱸形目(Perciformes)石首魚科(Sciaenidae)黃魚屬(Larimichthys),是中國海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類之一,養(yǎng)殖產(chǎn)量居中國海水魚類養(yǎng)殖前列[1]。大黃魚體質(zhì)嬌嫩,易受驚嚇,常在養(yǎng)殖操作、養(yǎng)殖運輸和商品運輸過程中出現(xiàn)應激反應,亦常出現(xiàn)充血、掉鱗和受傷等現(xiàn)象,進而引發(fā)疾病甚至死亡,造成巨大的經(jīng)濟損失,這也是制約大黃魚生鮮產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因[2-3]。因此,采用魚用麻醉劑是抑制魚類過度應激、有效避免損傷的重用手段。
烷基磺酸鹽同位氨基苯甲酸乙酯(MS-222)具有易溶于水、使用濃度低、入靜快、作用時間長和復蘇快等特點,被世界各國廣泛應用于各種魚類的麻醉運輸和日常養(yǎng)殖操作[4-5]。研究表明,體質(zhì)量為2.5~3.0 g的長江刀鱭(Coilianasus)幼魚在(25.0±0.5)℃水溫下,理想的MS-222麻醉質(zhì)量濃度為150 mg/L[6];體質(zhì)量為(5.59±0.29)g的巖原鯉(Procyprisrabaudi)幼魚在23~24 ℃的水溫下,MS-222有效麻醉質(zhì)量濃度為120~220 mg/L[7];體質(zhì)量為(130±10)g的大口黑鱸(Micropterussalmoides)幼魚在(28.0±0.5)℃水溫下,MS-222的最適麻醉質(zhì)量濃度為70 mg/L[8],MS-222的麻醉效果被廣泛認可。有關(guān)MS-222對大黃魚的麻醉效果已有一些研究,如體質(zhì)量為450~550 g的大黃魚,MS-222有效麻醉質(zhì)量濃度為50~60 mg/L,16 ℃條件下麻醉效果最穩(wěn)定[9];體質(zhì)量為(250.52±15.30)g的大黃魚,在15 ℃條件下,用40 mg/L的MS-222進行麻醉模擬運輸24 h后,復蘇率可達90%[10]。但這些研究均是圍繞大規(guī)格大黃魚開展的相關(guān)麻醉研究,而針對小規(guī)格大黃魚的相關(guān)研究并未見報道。而在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中,幼魚運輸、標記和科學研究時麻醉劑使用頻繁,為降低損耗并科學應用,有針對性地開展幼魚時期的麻醉效果研究具有重要意義。
本試驗中,對大黃魚幼魚采用不同質(zhì)量濃度的MS-222長時間靜水麻醉,研究其對大黃魚幼魚機體的影響,并確定MS-222長時間靜水麻醉幼魚的有效劑量,以期為大黃魚幼魚長時間?;钸\輸提供科學參考。
試驗用大黃魚幼魚體長為(18.01±0.82)cm,體質(zhì)量為(97.97±9.56)g,由浙江省舟山市水產(chǎn)研究所朱家尖養(yǎng)殖基地提供,試驗魚體質(zhì)健康、規(guī)格相近。試驗前于玻璃鋼養(yǎng)殖桶(400 L)中暫養(yǎng) 1 d。試驗用水為無污染的清澈海水,pH為7.99,鹽度為20±1,水溫為(16±1)℃。試驗用玻璃鋼魚桶(半徑r= 0.40 m,高H=0.40 m,實際水位h=0.20 m)水體體積為100 L。
MS-222購自上海麥克林生化科技有限公司。
1.2.1 麻醉試驗 將MS-222溶于水,配成質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60、70 mg/L的麻醉液。
1)麻醉和復蘇試驗。將停食24 h的幼魚從暫養(yǎng)的玻璃鋼養(yǎng)殖桶(400 L)轉(zhuǎn)移到盛有不同質(zhì)量濃度的MS-222麻醉液養(yǎng)殖水體(100 L)中,每桶放10尾魚,魚水質(zhì)量比約為1∶20,觀察魚體的活動情況,用秒表記錄魚體進入不同麻醉階段的時間。結(jié)合在麻醉劑作用下幼魚表現(xiàn)出的行為變化,參考張麗等[9]、魏鎖成[11]和劉長琳等[12]的研究結(jié)果,將幼魚麻醉過程分為6期,復蘇過程分為4期(表1)。麻醉24 h后記錄存活率,然后轉(zhuǎn)入相同水溫的清水中復蘇。
表1 麻醉和復蘇不同階段魚類的行為特征[9]Tab.1 Behavioural characteristics of fish at different stages of anesthesia and recovery
2)24 h靜水麻醉試驗。根據(jù)上述試驗中麻醉程度、復蘇時間及存活率,選擇能使幼魚進入鎮(zhèn)靜期的兩組MS-222質(zhì)量濃度(20.0、40.0 mg/L),以及空白組(0 mg/L)開展長時間(24 h)靜水麻醉試驗,觀察不同麻醉時間對幼魚機體的影響。每組設3桶重復,每桶放18尾魚。麻醉24 h后放在清水中復蘇6 h,此時記為30 h。分別在試驗的第1.5、3、6、12、24、30 h時從每組取3尾魚,采集其血液、肝臟樣品,用于生理生化指標測定。
1.2.2 理化指標測定 將血液樣品以4 000 r/min離心20 min,抽取上清液測定血清中皮質(zhì)醇濃度;取肝臟樣品測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力。
所有指標均使用商品化試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)進行測定,采用紫外-可見分光光度計測定其吸光度值。
1.2.3 組織結(jié)構(gòu)觀察
1)組織切片觀察。用40 mg/L的MS-222麻醉幼魚24 h后,解剖取其肝臟、鰓絲和腦組織,分別用體積分數(shù)為4%的多聚甲醛固定,再用體積分數(shù)為50%、70%、85%、95%的乙醇和無水乙醇逐級脫水,每級進行2 h;石蠟包埋后,經(jīng)過切片、蘇木精-伊紅(HE)染色、中性樹膠封片等步驟,在光學顯微鏡下觀察組織學特征。
2)電鏡觀察。用40 mg/L的MS-222麻醉幼魚24 h后,解剖取其肝臟、鰓絲和腦組織,分別用體積分數(shù)為2.5%的戊二醛和1%的鋨酸固定,梯度乙醇脫水;用白膠包埋組織,烘干后先進行半薄切片(1 μm),定位需觀察的位置,隨后進行超薄切片(80 nm);用體積分數(shù)為2%的醋酸鈾飽和乙醇溶液避光染色8 min,用體積分數(shù)為70%的乙醇清洗3次,用超純水清洗3次;用質(zhì)量分數(shù)為2.6%的枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min,再用超純水清洗3次,濾紙稍吸干;切片在室溫下干燥過夜,用透射電鏡(HITACHI HT7800)觀察拍照。
試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±S.D.)表示,采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析(one-way ANOVA),用 Duncan法進行組間多重比較,顯著性水平設為0.05。
不同質(zhì)量濃度的MS-222對大黃魚幼魚的麻醉及復蘇效果見表2。
從表2可見:魚體最終的麻醉程度隨著MS-222質(zhì)量濃度的增加,麻醉時間逐漸縮短;當MS-222質(zhì)量濃度為10、20、30 mg/L時,幼魚只能進入輕度鎮(zhèn)靜期(Ⅱ期),無法進入最終麻醉狀態(tài);當MS-222的質(zhì)量濃度為40 mg/L時,幼魚可進入深度鎮(zhèn)靜期(Ⅲ期);當MS-222的質(zhì)量濃度為50 mg/L時,魚體進入麻醉(Ⅳ~Ⅴ期)的時間均大于5 min;當MS-222的質(zhì)量濃度為60 mg/L時,魚體進入麻醉(Ⅳ~Ⅴ期)時間小于5 min,并能進入深度麻醉期(Ⅵ期),麻醉24 h后,該組幼魚的復蘇率仍為100%;當MS-222的質(zhì)量濃度為70 mg/L時,幼魚能進入深度麻醉期(Ⅵ期),但麻醉24 h后,幼魚的復蘇率僅為50%。
表2 不同濃度MS-222對幼魚的麻醉及復蘇效果(n=10)Tab.2 Anaesthetic and recovery effects of MS-222 on juvenile at different concentrations(n=10)
用40 mg/L的MS-222麻醉24 h時,對大黃魚幼魚肝臟、鰓絲和腦組織結(jié)構(gòu)的影響見圖1、圖2。組織切片觀察顯示:空白組幼魚肝細胞有少數(shù)空泡,但細胞核完整,細胞排列有序(圖1A),而40 mg/L麻醉組出現(xiàn)肝細胞腫脹,部分肝細胞核溶解、消失,細胞核皺縮,核膜形變,胞漿嗜酸性下降,胞漿內(nèi)脂質(zhì)沉積(圖1B);空白組幼魚鰓絲排列整齊(圖1C),而40 mg/L麻醉組鰓絲的次級鰓絲遠端腫脹,上皮細胞壞死,鰓絲內(nèi)紅細胞聚集,鰓絲膨大,紅細胞滲出(圖1D);空白組幼魚腦組織神經(jīng)元細胞質(zhì)濃染,神經(jīng)元細胞核明顯(圖1E),而40 mg/L麻醉組腦組織疏松水腫神經(jīng)元細胞質(zhì)淡染,神經(jīng)元細胞核不明顯(圖1F)。
A—空白組肝臟;B—40 mg/L的MS-222麻醉組肝臟;C—空白組鰓絲;D—40 mg/L的MS-222麻醉組鰓絲;E—空白組腦;F—40 mg/L的MS-222麻醉組腦。a—核膜;b—胞漿;c—紅細胞;d—神經(jīng)元細胞;e—神經(jīng)元細胞核。A—liver in blank group;B—liver in 40 mg/L MS 222 anesthesia group;C—gill in blank group;D—gill in 40 mg/L MS 222 anesthesia group;E—brain in blank group;F—brain in 40 mg/L MS 222 anesthesia group. a—nuclear membrane;b—cytoplasm;c—red blood cell;d—neuron;e—neuronal nucleus.圖1 麻醉24 h時幼魚肝臟、鰓絲和腦的組織結(jié)構(gòu)Fig.1 Histological structure of liver,gill filament and brain of juvenile under anesthesia for 24 hours
BC—膽小管;N—細胞核;LD—脂滴;M—線粒體;RER—粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);Epc—上皮細胞;BM—基底膜;Cap—血管腔;Enc—內(nèi)皮細胞;PC—柱細胞;CCS—泌氯細胞。BC—bile canaliculus;N—nucleus;LD—lipid droplet;M—mitochondria;RER—rough endoplasmic reticulum;Epc—epithelial cell;BM—basement membrane;Cap—capillary;Enc—endothelial cells;PC—pillar cell;CCS—chloride secreting cells.圖2 麻醉24 h時幼魚肝臟、鰓絲和腦的超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of liver,gill filament and brain of juvenile fish under anesthesia for 24 hours
組織超微結(jié)構(gòu)觀察顯示:40 mg/L的MS-222麻醉組肝細胞明顯水腫,整體呈崩解狀態(tài),細胞膜大面積破損、不連續(xù),膜內(nèi)低電子密度水腫區(qū),膽小管迂曲、擴張;細胞核染色質(zhì)均勻、局部核周隙增寬,胞內(nèi)可見較大量脂滴;線粒體輕度腫脹,部分線粒體膜破損,基質(zhì)外溢,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張(圖2(a))。鰓絲鰓小片結(jié)構(gòu)變形,局部鰓小片斷裂,上皮細胞增生肥大,胞內(nèi)可見較多脂滴;基底膜厚薄不均一,局部復層化、連續(xù),血管腔狹窄,其中可見較多血細胞,輕度栓塞;內(nèi)皮細胞局部脫落游離,柱細胞數(shù)量減少;泌氯細胞明顯水腫,細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張、空泡變性(圖2(b))。腦中神經(jīng)元細胞輕度水腫,細胞膜局部小區(qū)域破損、不連續(xù),膜內(nèi)基質(zhì)分布均勻;細胞核呈圓形,以常染色質(zhì)為主,染色質(zhì)均勻,線粒體輕度固縮,大多線粒體膜完整;嵴存在,少量線粒體輕度固縮,膜內(nèi)電子密度高,嵴擴張,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見明顯擴張,表面可見核糖體附著(圖2(c))。
2.3.1 皮質(zhì)醇濃度 從圖3可見:靜水中的幼魚經(jīng)MS-222麻醉處理24 h內(nèi),20 mg/L麻醉組幼魚血清皮質(zhì)醇濃度大致呈現(xiàn)先增長后下降再增長的趨勢,在1.5 h內(nèi)皮質(zhì)醇濃度迅速上升,且顯著高于空白組、40 mg/L麻醉組(P<0.05);40 mg/L麻醉組在麻醉期間皮質(zhì)醇濃度變化趨勢與空白組較為一致,波動較??;麻醉期間,空白組及20、40 mg/L麻醉組皮質(zhì)醇峰值時間點分別為24、1.5、24 h,麻醉24 h時,3個麻醉組的血清皮質(zhì)醇濃度相近(P>0.05);復蘇6 h后,20、40 mg/L麻醉組幼魚血清皮質(zhì)醇濃度均恢復至空白組水平(P>0.05)。
標有不同字母者表示相同時間下不同麻醉組間有顯著性差異(P<0.05),標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同。Means with different letters are significant differences at the same time in different MS-222 groups (P<0.05)and the means with the same letter are not significant differences(P>0.05),et sequentia.圖3 不同濃度麻醉組幼魚血清皮質(zhì)醇濃度的變化Fig.3 Changes in serum cortisol concentration of juvenile under different concentrations of MS-222
2.3.2 SOD活力 從圖4(a)可見:MS-222對幼魚肝臟中的SOD有顯著性影響,總體上來看,20 mg/L麻醉組SOD活性變化較40 mg/L麻醉組變化更為劇烈,空白組則波動較小;在麻醉的各個時間點,20、40 mg/L麻醉組SOD活性均顯著高于空白組(P<0.05);復蘇6 h后,20、40 mg/L麻醉組幼魚SOD活性均恢復至空白組水平(P>0.05)。
圖4 不同濃度麻醉組幼魚肝臟SOD、CAT和GSH-Px活力的變化Fig.4 Changes in activities of SOD,CAT and GSH-Px in liver of juvenile under different concentrations of MS-222
2.3.3 CAT活力 從圖4(b)可見:MS-222對幼魚肝臟中的CAT活力有顯著性影響,在1.5、3、12 h時,20 mg/L麻醉組CAT活力顯著高于空白組(P<0.05);在1.5、24 h時,40 mg/L麻醉組幼魚的CAT活力顯著高于空白組(P<0.05);復蘇6 h后,40 mg/L麻醉組幼魚CAT活力恢復至空白組水平(P>0.05)。
2.3.4 GSH-Px活力 從圖4(c)可見:MS-222對幼魚肝臟中的GSH-Px活力有顯著性影響,但影響出現(xiàn)的時間稍晚;20 mg/L麻醉組GSH-Px活力在6 h時開始出現(xiàn)明顯變化,在12、24時顯著高于空白組(P<0.05);而40 mg/L麻醉組則在3 h時開始出現(xiàn)顯著變化,且在3、12、24 h時顯著高于空白組(P<0.05),6 h時顯著低于空白組(P<0.05);復蘇6 h后,20 mg/L麻醉組幼魚GSH-Px活力恢復至空白組水平(P>0.05),而40 mg/L麻醉組則顯著高于空白組(P<0.05)。
麻醉劑濃度直接影響對魚類的麻醉效果,濃度過低起不到抗應激作用,濃度過高則容易引起魚類休克甚至死亡。為此,探究不同應用條件、應用目的時的給藥劑量對有效開展麻醉工作至關(guān)重要。有研究表明,體質(zhì)量為(200±50)g的黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco),用20 mg/L的MS-222麻醉24 h時,存活率達到100%[13];體質(zhì)量為(360.4±50)g的大口黑鱸靜水麻醉24 h,MS-222的適宜質(zhì)量濃度為50~60 mg/L[14];體質(zhì)量為500~600 g的大菱鲆(Scophthalmusmaximus),在水溫為8 ℃、魚水質(zhì)量比為1∶3條件下,40 mg/L的MS-222適用于魚的長時間(24 h)運輸[15]。張麗等[9]研究表明,體質(zhì)量為450~550 g的大黃魚在水溫(10.5±0.5)℃下,MS-222麻醉的有效質(zhì)量濃度為50~60 mg/L,且在16 ℃時大黃魚進入麻醉所需時間最長,也最穩(wěn)定。本試驗中,體質(zhì)量為(97.97±9.56)g的大黃魚幼魚在水溫為(16±1)℃下,MS-222質(zhì)量濃度為50~60 mg/L時,魚體能進入深度麻醉期,麻醉24 h后大黃魚幼魚復蘇率為100%,這與張麗等[9]的研究結(jié)果較為一致。而本研究中大黃魚幼魚麻醉24 h的MS-222適宜劑量(40 mg/L)高于黃顙魚[13],與大口黑鱸[14]、大菱鲆[15]相近,這是因為不同魚種、規(guī)格、溫度和麻醉時間等均會影響MS-222的使用濃度。如MS-222在50~70 mg/L時,對體質(zhì)量為(83.3±7.8)g的大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)幼魚有良好的麻醉效果[16];體質(zhì)量為(81.9±0.36)g的鸚鵡魚(Amphilophuscitrinellus)長距離運輸(12 h)時,MS-222麻醉的有效質(zhì)量濃度為40 mg/L[17];在15、20、25 ℃下,體質(zhì)量為260~530 g的圓斑星鰈(Veraspervariegates)成魚,MS-222麻醉的有效質(zhì)量濃度分別為180~300、160~280、150~230 mg/L[18]。因此,在開展實際生產(chǎn)活動時需科學參考、適當摸索后再用藥。有研究認為,深度鎮(zhèn)靜期是運輸?shù)倪m宜時期[11],麻醉期是試驗操作的最佳時期[19]。根據(jù)本研究結(jié)果,后續(xù)對大黃魚幼魚長時間麻醉應用可選用小于40 mg/L的MS-222進行運輸試驗探索,養(yǎng)殖短暫性操作可選用小于60 mg/L的質(zhì)量濃度進行試驗探究。
魚用麻醉劑是一類能不同程度地抑制魚腦感覺中樞使魚失去反射動作的物質(zhì)。其作用原理是:首先抑制腦的皮質(zhì)(觸覺喪失期),再作用于基底神經(jīng)節(jié)與小腦(興奮期),最后作用于脊髓(麻醉期)[20]。適量的麻醉劑可降低魚類耗氧率和氨氮排泄率,抑制魚類的過度應激,有效減少操作中的損傷或死亡。但過量的MS-222進入魚體后會富集在脾、肝臟等器官,并引起肝臟受損等問題,大劑量的麻醉劑也會麻痹呼吸和舒縮中樞,導致魚體死亡,進而影響成活率[21-22]。孫偉紅等[23]研究表明,體質(zhì)量為(300±50)g的大菱鲆,在水溫12~13 ℃下進行60 mg/L的MS-222暴露試驗,在60 h時肌肉中MS-222的富集量達到最高值,平均為47.8 μg/g;肝臟中的MS-222在50 h后基本平衡,平均最大富集量可達67.9 μg/g。朱敏[24]研究表明,大劑量MS-222會引起魚體肝臟、神經(jīng)中樞等方面出現(xiàn)問題。本研究中,組織切片顯微觀察和超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察結(jié)果表明,用MS-222麻醉24 h的大黃魚幼魚,肝細胞腫脹,細胞核皺縮,線粒體輕度腫脹,部分線粒體膜破損;鰓絲的次級鰓絲遠端腫脹,上皮細胞壞死,鰓絲內(nèi)紅細胞聚集,鰓絲膨大,紅細胞滲出,泌氯細胞明顯水腫,細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張、空泡變性;腦組織中出現(xiàn)神經(jīng)細胞固縮,組織疏松水腫,細胞膜局部小區(qū)域破損且不連續(xù),少量線粒體輕度固縮等現(xiàn)象。推測用40 mg/L的MS-222麻醉24 h時,可能對大黃魚肝臟、鰓絲和腦組織有一定損傷,但具體的損傷情況及機理還需從復蘇養(yǎng)殖、分子毒理及蛋白質(zhì)代謝等多方面對麻醉效應和富集消除規(guī)律進行后續(xù)研究。
魚類各種酶類、代謝產(chǎn)物和血液指標可在某種程度上反映各組織或器官的功能變化,是重要的生理、毒理和病理學評價指標。魚類的抗氧化系統(tǒng)中的小分子非酶抗氧化劑如SOD、CAT和GSH-Px等,可在魚類處于脅迫的環(huán)境中使機體內(nèi)過氧化氫分解,清除生物體內(nèi)的過氧化氫[25],這些指標可間接反映生物體生理上的變化。本試驗表明,20、40 mg/L的MS-222對大黃魚幼魚肝臟抗氧化酶活力相較于空白組均有增強作用,這是因為在MS-222的脅迫下,魚體產(chǎn)生了應激反應,前期呼吸加快,產(chǎn)生大量的自由基,從而引起清除自由基的抗氧化相關(guān)酶類活力增強。在麻醉復蘇后,抗氧化相關(guān)酶活性又下降至空白組水平,可見,20、40 mg/L的MS-222對大黃魚幼魚肝臟的影響是可逆的,此時魚體生理機能尚能維持正常運行。本試驗結(jié)果與MS-222和丁香酚作用錦鯉(Cyprinuscarpio)的研究結(jié)果相似[26]。
血液中激素濃度的變化是魚類應激反應的首要表現(xiàn)。在遭遇環(huán)境脅迫時,魚體內(nèi)的腎上腺素和皮質(zhì)醇(酮)大量分泌,調(diào)節(jié)機體的代謝以維持生理平衡[27-28]。有研究表明,魚體在受到麻醉后,血液皮質(zhì)醇水平短時間內(nèi)迅速升高[29];10~20 mg/L的MS-222適于大口黑鱸麻醉后進行運輸,麻醉運輸組血清皮質(zhì)醇變化差異顯著高于基礎組[30];麻醉運輸組與非麻醉運輸組美洲鰣(Alosasapidissima)幼魚血清中皮質(zhì)醇的濃度均顯著高于麻醉前的基礎組[31]。本試驗中,用20 mg/L的MS-222麻醉大黃魚幼魚后,血清皮質(zhì)醇含量在1.5 h時內(nèi)迅速升高且顯著高于空白組,之后趨于平穩(wěn),這與上述結(jié)果一致;而40 mg/L的MS-222麻醉組血清皮質(zhì)醇濃度變化較為平穩(wěn),各個時間點與空白組無顯著性差異,這可能是40 mg/L的MS-222降低了魚體對外界刺激的反應能力??梢姡琈S-222 在抑制魚體脅迫應激反應中起到了重要作用。
1)隨著MS-222質(zhì)量濃度的增加,大黃魚幼魚的麻醉時間逐漸縮短,且復蘇整體時間延長。24 h的麻醉運輸可選用質(zhì)量濃度為40 mg/L的MS-222。
2)用40 mg/L的MS-222麻醉24 h,對大黃魚幼魚SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化應激酶活性的影響作用是可逆的,但對其組織結(jié)構(gòu)可造成一定損傷,但不致死。今后還需從分子毒理及蛋白質(zhì)代謝等多方面對MS-222的麻醉效應進行研究評估。