徐曉瑩，王鶴，李秀梅，趙延寧，張寧，史文凱，劉蓬*

(1.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺(tái) 264006；2.煙臺(tái)宗哲海洋科技有限公司，山東 煙臺(tái) 265617)

鈍吻黃蓋鰈(Pseudopleuronectesyokohamae)隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)鰈科(Pleruonectida)黃蓋鰈屬(Pseudopleuronectes)[1]，主要分布于太平洋西部近海，多產(chǎn)于中國(guó)的黃海和渤海，是北溫帶淺海冷水底棲魚(yú)類(lèi)[2]。其肉質(zhì)細(xì)嫩、食性溫和、適應(yīng)性強(qiáng)并喜好集群[3]，是黃海、渤海地區(qū)拖網(wǎng)作業(yè)的重要對(duì)象及理想的增殖對(duì)象[4]。

近年來(lái)，隨著中國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，鈍吻黃蓋鰈的集約化養(yǎng)殖不斷擴(kuò)大。鈍吻黃蓋鰈養(yǎng)殖過(guò)程中使用的飼料主要有冰鮮雜魚(yú)和配合飼料。隨著水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖“五大行動(dòng)”中“配合飼料替代幼雜魚(yú)行動(dòng)”的不斷推廣，養(yǎng)殖餌料已經(jīng)開(kāi)始逐漸向人工配合飼料轉(zhuǎn)變。目前，關(guān)于冰鮮雜魚(yú)和配合飼料的飼喂對(duì)比研究已在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、大黃魚(yú)(Larmichthyscrocea)、大口黑鱸(Micropterussalmoides)和斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)等各種經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)中相繼開(kāi)展，主要涉及生長(zhǎng)性能、肌肉營(yíng)養(yǎng)成分、免疫功能和腸道微生物結(jié)構(gòu)等方面[5-8]，但在鈍吻黃蓋鰈的相關(guān)研究中未見(jiàn)報(bào)道。不同飼料對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道健康狀況和菌群組成影響較大，如攝食配合飼料和冰鮮雜魚(yú)的大口黑鱸腸道菌群多樣性不同[9]，攝食植物和海洋動(dòng)物的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群不同[10]。本研究中，通過(guò)高通量測(cè)序等方法，對(duì)投喂不同飼料的鈍吻黃蓋鰈進(jìn)行了生長(zhǎng)性能、腸道結(jié)構(gòu)及腸道菌群分析，從其宏觀生長(zhǎng)及微觀結(jié)構(gòu)、腸道菌群等方面探索了鈍吻黃蓋鰈的營(yíng)養(yǎng)需求，以期為其飼料的合理配制提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用鈍吻黃蓋鰈為煙臺(tái)宗哲海洋科技有限公司自繁自育的健康魚(yú)苗，體長(zhǎng)為(10.16±0.06)cm。配合飼料為賽格林仔稚魚(yú)育苗專(zhuān)用飼料，其常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分為粗蛋白質(zhì)52%、粗脂肪8%、粗灰分17%、粗纖維8%和水分12%；冰鮮雜魚(yú)捕撈自煙臺(tái)沿海，其常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分為粗蛋白質(zhì)21%、粗脂肪3%、粗灰分4%和水分66%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取健康且規(guī)格整齊的鈍吻黃蓋鰈270尾，隨機(jī)分為配合飼料投喂組(CF)、冰鮮雜魚(yú)與配合飼料混合投喂組(MF)及冰鮮雜魚(yú)投喂組(FF)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚(yú)，分別放入126 L的塑料箱中養(yǎng)殖，水溫為(15±1)℃，鹽度為24～30。為保證水質(zhì)，每天定時(shí)更換魚(yú)箱中20%的水量。試驗(yàn)期間，每天7：30和16：30各投喂一次，混合投喂組上午投喂配合飼料，下午投喂冰鮮雜魚(yú)，冰鮮雜魚(yú)經(jīng)過(guò)粉碎后，每次投餌量為魚(yú)體質(zhì)量的3%，配合飼料每次投餌量為魚(yú)體質(zhì)量的1%。養(yǎng)殖試驗(yàn)共進(jìn)行42 d。

1.2.2 生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定 在試驗(yàn)的第0、14、28、42天時(shí)分別稱(chēng)量魚(yú)體質(zhì)量，第42天時(shí)測(cè)量魚(yú)體長(zhǎng)，每天記錄各組魚(yú)的攝食量。稱(chēng)量前停食24 h，分別從各組隨機(jī)取10尾魚(yú)進(jìn)行測(cè)量。

試驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算各組魚(yú)的增重率(GBW，%)、特定生長(zhǎng)率(RSG，%/d)、飼料系數(shù)(RFC)和肥滿(mǎn)度(FC，g/cm3)。計(jì)算公式為

GBW=(Wt-W0)/W0×100%，

(1)

RSG=(lnWt-lnW0)/t×100%，

(2)

RFC=F/(Wt-W0)，

(3)

FC=Wt/L3×100。

(4)

其中：W0、Wt分別為試驗(yàn)魚(yú)初始體質(zhì)量(g)和終末體質(zhì)量(g)；t為試驗(yàn)時(shí)間(d)；F為養(yǎng)殖周期內(nèi)的攝食量(g)；L為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的魚(yú)體長(zhǎng)(cm)。

1.2.3 腸道結(jié)構(gòu)觀察 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，從各組隨機(jī)取3尾魚(yú)，解剖取其腸道，并立即浸入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定液中固定。腸道組織石蠟切片由生工生物工程(上海)股份有限公司制作。后腸組織在固定液中固定24 h后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液反復(fù)沖洗，用叔丁醇脫水，浸蠟包埋，再用冷凍切片機(jī)連續(xù)切片(厚度6 μm)，HE染色。腸道切片在顯微鏡下觀察拍照，并測(cè)量絨毛長(zhǎng)度、絨毛寬度和基層厚度等指標(biāo)。

1.2.4 腸道DNA提取與PCR擴(kuò)增 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，分別從各組隨機(jī)取9尾魚(yú)，無(wú)菌條件下解剖取出完整腸道，每3尾魚(yú)的腸道內(nèi)容物作為1個(gè)混合樣品置入凍存管中，將3個(gè)混合樣品用液氮速凍后保存待測(cè)。腸道樣品基因組DNA的提取和測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。將提取的腸道微生物總DNA用341F(5′CCTAC- GGGNGGCWGCAG 3′)和805R(5′GACTACHVGGGTATCTAATCC 3′)特定引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后在Illumina平臺(tái)完成測(cè)序。

1.2.5 腸道菌群生物信息學(xué)分析 下機(jī)數(shù)據(jù)使用FLASH 1.2.7[11]、QIIME 1.7.0[11]對(duì)樣品原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行拼接、過(guò)濾及質(zhì)控，去除嵌合體后獲得有效數(shù)據(jù)(effective tags)。應(yīng)用Uparse 7.0.1001軟件[12]在97%的一致性水平上對(duì)樣品所有effective tags進(jìn)行聚類(lèi)分析，獲得OTUs?；诳刹僮餍苑诸?lèi)單元OTUs計(jì)算Chao1、Shannon、Simpson和ACE指數(shù)，并進(jìn)行Alpha多樣性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較。顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼料組鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)性能

從表1可見(jiàn)：與冰鮮雜魚(yú)組相比，配合飼料組鈍吻黃蓋蝶增重率、特定生長(zhǎng)率顯著降低(P<0.05)，肥滿(mǎn)度變化不大(P>0.05)；混合投喂組魚(yú)體的增重率、特定生長(zhǎng)率及肥滿(mǎn)度等指標(biāo)均高于配合飼料組，但低于冰鮮雜魚(yú)組(P>0.05)；以濕物質(zhì)為基礎(chǔ)的飼料系數(shù)表現(xiàn)為冰鮮雜魚(yú)組顯著高于配合飼料組(P<0.05)，而以干物質(zhì)為基礎(chǔ)的飼料系數(shù)則表現(xiàn)為配合飼料組顯著高于冰鮮雜魚(yú)組(P<0.05)。

表1 各組鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)性能Tab.1 Growth of Pleuronectes yokohama in each group

2.2 不同飼料組鈍吻黃蓋鰈的腸道結(jié)構(gòu)

鈍吻黃蓋鰈腸道黏膜形態(tài)如圖1所示，不同飼料影響了鈍吻黃蓋鰈腸道組織形態(tài)，冰鮮雜魚(yú)組絨毛相對(duì)致密且高度較高，排列整齊，配合飼料組及混合投喂組的絨毛稀疏且高度較低。

圖1 鈍吻黃蓋鰈后腸黏膜形態(tài)Fig.1 Mucosal morphology in distal intestine of Pleuronectes yokohama

從表2可見(jiàn)，冰鮮雜魚(yú)組鈍吻黃蓋鰈腸道的絨毛長(zhǎng)度和基層厚度顯著高于配合飼料組和混合投喂組(P<0.05)，配合飼料組最低；3組間絨毛寬度無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表2 各組腸道黏膜形態(tài)參數(shù)Tab.2 Morphological parameters of intestinal mucosa in each group μm

2.3 鈍吻黃蓋鰈腸道菌群的多樣性

對(duì)MiSeg測(cè)序原始數(shù)據(jù)處理后，3組樣品共產(chǎn)生157 646條優(yōu)化序列，有效序列數(shù)為49 331～56 251條。從圖2可見(jiàn)，3組鈍吻黃蓋鰈腸道樣品產(chǎn)生的OTUs數(shù)目為429～483個(gè)，3組共有OTUs為107個(gè)，CF、MF和FF組特有OTUs分別為234、225和269個(gè)。

圖2 各組腸道微生物分類(lèi)Venn圖Fig.2 Venn diagram of intestinal microbiome in each group

對(duì)3組鈍吻黃蓋鰈的Alpha多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示，3組鈍吻黃蓋鰈腸道菌群的Chao1和ACE指數(shù)依次為FF組>CF組>MF組，說(shuō)明冰鮮雜魚(yú)組魚(yú)腸道菌群的物種豐富度最高，混合投喂組物種豐富度最低；混合投喂組魚(yú)腸道菌群的Shannon指數(shù)最小，Simpson指數(shù)最大，說(shuō)明其多樣性較低，其余2組腸道菌群多樣性基本相似。

表3 各組腸道菌群多樣性指數(shù)Tab.3 Diversity index of intestinal flora in each group

2.4 鈍吻黃蓋鰈腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成

在門(mén)水平上，鈍吻黃蓋鰈腸道微生物中豐度排列前10的菌群如圖3所示，冰鮮雜魚(yú)和配合飼料對(duì)鈍吻黃蓋鰈腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度影響不同，3組魚(yú)腸道主要菌群均為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和異常球菌-棲熱菌門(mén)(Deinococcus-Thermus)等，隨飼料中冰鮮雜魚(yú)比例的增高，鈍吻黃蓋鰈腸道菌群中變形菌門(mén)相對(duì)豐度增大，而厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度則降低。

圖3 鈍吻黃蓋鰈腸道門(mén)水平上的物種相對(duì)豐度Fig.3 Bacterial communities in intestinal flora of Pleuronectes yokohama at the phylum level

在屬水平上，鈍吻黃蓋鰈腸道菌群中相對(duì)豐度較高的10個(gè)主要菌群如表4所示，3組魚(yú)腸道的優(yōu)勢(shì)菌群均為微桿菌屬(Microbacterium)，其中，配合飼料組的次優(yōu)勢(shì)菌群為巨型球菌屬(Macrococcus)和異常球菌屬(Deinococcus)，混合投喂組的次優(yōu)勢(shì)菌群為巨型球菌屬(Macrococcus)和發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)，冰鮮雜魚(yú)組的次優(yōu)勢(shì)菌群為紅桿菌科未分類(lèi)菌群unclassified_Rhodobacteraceae和巨型球菌屬(Macrococcus)。

表4 各組鈍吻黃蓋鰈腸道菌群優(yōu)勢(shì)度最高的10個(gè)屬Tab.4 Top ten genera of bacterial communities in intestinal flora of Pleuronectes yokohama in each group

3 討論

3.1 不同飼料對(duì)鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)的影響

集約化養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)取決于飼料，飼料的質(zhì)量決定了養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育情況。本研究中，冰鮮雜魚(yú)組鈍吻黃蓋鰈的特定生長(zhǎng)率分別比配合飼料組和混合投喂組提高了29.66%和14.18%，說(shuō)明冰鮮雜魚(yú)更能促進(jìn)鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)，這與佟偉等[13]對(duì)大菱鲆、叢林梅等[14]對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)(Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)、牛行健等[7]對(duì)斜帶石斑魚(yú)及朱擇敏等[15]對(duì)大口黑鱸的研究結(jié)果一致。人工配合飼料雖營(yíng)養(yǎng)豐富，但與天然餌料在營(yíng)養(yǎng)成分、適口性等方面仍存在較大差異。本研究中，鈍吻黃蓋鰈對(duì)人工配合飼料還未形成很好的適應(yīng)性，因而影響了養(yǎng)殖魚(yú)體的生長(zhǎng)速度。就飼料系數(shù)而言，雖然冰鮮雜魚(yú)組的濕物質(zhì)飼料系數(shù)比配合飼料組增加了2倍，但因冰鮮雜魚(yú)水分含量較高，通過(guò)計(jì)算干物質(zhì)量飼料系數(shù)發(fā)現(xiàn)，冰鮮雜魚(yú)組的干物質(zhì)量飼料系數(shù)比配合飼料組更低，加之冰鮮雜魚(yú)的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，配合飼料還應(yīng)進(jìn)一步改善質(zhì)量以提升其飼料利用率，增加市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)。

3.2 不同飼料對(duì)鈍吻黃蓋鰈腸道結(jié)構(gòu)的影響

魚(yú)類(lèi)腸道健康與腸道絨毛形態(tài)密切相關(guān)，絨毛的長(zhǎng)度和寬度影響著腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[16]。腸道基層厚度影響腸道穩(wěn)固性，對(duì)魚(yú)體健康極為重要。本研究中，攝食配合飼料的鈍吻黃蓋鰈腸道絨毛長(zhǎng)度顯著低于冰鮮雜魚(yú)組，結(jié)合生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，配合飼料組的鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)較慢，這可能是配合飼料適口性差、誘食作用弱等原因，導(dǎo)致鈍吻黃蓋鰈腸道形態(tài)發(fā)育不如冰鮮雜魚(yú)組好，從而影響腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而影響了魚(yú)的生長(zhǎng)。

3.3 不同飼料對(duì)鈍吻黃蓋鰈腸道菌群多樣性的影響

魚(yú)類(lèi)腸道中微生物與宿主在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成穩(wěn)定的共生關(guān)系，直接或間接地影響著宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收、代謝免疫等功能[17]。魚(yú)類(lèi)腸道菌群組成與其攝食的飼料也有關(guān)[18]。本研究中，配合飼料降低了鈍吻黃蓋鰈腸道菌群的多樣性，結(jié)合配合飼料高溫高壓的生產(chǎn)加工方式，這可能與配合飼料中的微生物多樣性較低有關(guān)。

本研究中，3組鈍吻黃蓋鰈腸道的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為變形菌門(mén)，第二位是放線菌門(mén)，第三位是厚壁菌門(mén)。變形菌門(mén)是細(xì)菌中最大的門(mén)，許多病原菌均位列其中，可導(dǎo)致生物功能失調(diào)，增加疾病風(fēng)險(xiǎn)[19]。冰鮮雜魚(yú)組變形菌門(mén)豐度最高，這可能與冰鮮雜魚(yú)攜帶的微生物數(shù)量高于配合飼料有關(guān)。放線菌門(mén)是水生生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的細(xì)菌門(mén)，是抗生素的主要生產(chǎn)菌，其中許多種類(lèi)屬于潛在的益生菌[20]。厚壁菌門(mén)中存在許多能夠促進(jìn)碳水化合物轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，有助于提高宿主對(duì)飼料的消化能力[21]。研究表明，擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)豐度的比值影響?zhàn)B殖魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)速度[9]。本研究中，配合飼料組擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)豐度的比值最低，鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)速度也最慢，這與郁二蒙等[9]對(duì)攝食不同飼料的大口黑鱸腸道菌群的研究結(jié)果一致。推測(cè)攝食配合飼料的鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)較慢，可能與其腸道中擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)豐度的比值下降有關(guān)。

研究表明，紅桿菌科中的大多數(shù)成員具有合成維生素B12的路徑，而維生素B12可促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[22]。紅桿菌科中的魯杰氏菌(Ruegeriamobilis)對(duì)致病菌有抑制作用，具有開(kāi)發(fā)成為益生菌的潛能[23]。本研究中，在屬水平上對(duì)鈍吻黃蓋鰈腸道進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，冰鮮雜魚(yú)組未分類(lèi)的紅桿菌科豐度顯著高于配合飼料組和混合投喂組。由此可見(jiàn)，投喂冰鮮雜魚(yú)相對(duì)提高了鈍吻黃蓋鰈腸道有益菌的含量，這也為鈍吻黃蓋鰈腸道微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)提供了數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

1)通過(guò)分析投喂配合飼料和冰鮮雜魚(yú)在鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)性能、腸道結(jié)構(gòu)和腸道菌群方面的差異，發(fā)現(xiàn)冰鮮雜魚(yú)更能促進(jìn)鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)及腸道健康。

2)配合飼料組鈍吻黃蓋鰈腸道菌群多樣性減少，可能與人工配合飼料的營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)法滿(mǎn)足魚(yú)體及其腸道內(nèi)土著細(xì)菌的生長(zhǎng)需求有關(guān)。因此，在養(yǎng)殖過(guò)程中可在配合飼料中添加有利于鈍吻黃蓋鰈腸道健康的益生菌，以促進(jìn)鈍吻黃蓋鰈的健康生長(zhǎng)。