◎ 吳小勇，毋 杉，李小鵬，陶桂松，王啟明

（咸陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，陜西 咸陽 712000）

銅綠假單胞菌，俗稱綠膿桿菌，是假單胞菌屬中的一種常見的人和動(dòng)物條件性致病菌，也是正常人的皮膚、呼吸道和腸道、粘膜上的常駐菌，可以引起包括皮膚、眼睛、外耳道、鼻部、口腔、尿路、肺部、骨關(guān)節(jié)等各種感染[1]。銅綠假單胞菌在自然界分布廣泛，主要存在于潮濕的環(huán)境中，極易污染地表滲水。隨著飲水安全越來越受到人們的關(guān)注，國內(nèi)外關(guān)于包裝飲用水受銅綠假單胞菌污染的報(bào)道也日漸增多。國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》GB 19298-2014[2]增加了銅綠假單胞菌指標(biāo)，并且要求同一批次的5 份檢測樣品中均不能檢出(CFU/250 mL)，否則該批包裝飲用水則被判定為不合格。本次對(duì)檢出的銅綠假單胞菌相關(guān)問題進(jìn)行研究，重點(diǎn)分析包裝飲用水監(jiān)督抽檢數(shù)據(jù)的規(guī)律特點(diǎn)，并結(jié)合實(shí)地調(diào)研情況，進(jìn)一步分析包裝飲用水產(chǎn)生銅綠假單胞菌不合格問題的主要原因，提出相應(yīng)對(duì)策和建議，為提升全省包裝飲用水質(zhì)量安全水平提供科研和技術(shù)支撐，更好地保障人民群眾飲水安全和身體健康。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

此次分析的樣品數(shù)據(jù)來源2021 年咸陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心在陜西省范圍內(nèi)開展的277 批次包裝飲用水監(jiān)督抽檢數(shù)據(jù)，由專業(yè)抽樣人員隨機(jī)抽取樣品，抽樣地區(qū)包括西安市、寶雞市、咸陽市、渭南市、漢中市、商洛市、寶雞市、榆林市、延安市、楊凌示范區(qū)。抽樣環(huán)節(jié)包括生產(chǎn)環(huán)節(jié)和流通環(huán)節(jié)。樣品包裝類型包括桶裝飲用水和瓶裝飲用水。樣品分類包括其他飲用水和礦泉水。

1.2 試劑耗材

假單胞菌CN 選擇性培養(yǎng)基平板（北京陸橋，貨號(hào)：PB034）；營養(yǎng)瓊脂（北京陸橋，貨號(hào)：CM807）；綠膿菌素測定培養(yǎng)基（北京陸橋，貨號(hào)：CM707）；乙酰胺肉湯（北京路橋，貨號(hào)：M155）；鈉氏試劑（北京陸橋，貨號(hào)：P-105）；金氏B 培養(yǎng)基（北京陸橋，貨號(hào)：CM1019）；氧化酶試紙（ 北京陸橋， 貨號(hào)：M050）； 無菌濾膜47 mm×0.45 μm( 廣東環(huán)凱， 貨號(hào)：20571102）。

以上試劑均符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》GB 4789.28-2013[3]，均在有效期內(nèi)使用。

1.3 主要儀器

不銹鋼多聯(lián)過濾系統(tǒng)MFS-6A-250（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），生化培養(yǎng)箱SPX-250B Ⅲ（天津泰斯特儀器有限公司），潔凈工作臺(tái)SWCJ-2FD（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），生物安全柜BSC-1300 ⅡA2（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器LDZM-80KCS-Ⅱ（上海申安醫(yī)療器械廠），全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2 Compact（法國梅里埃）。

以上設(shè)備均符合檢定校準(zhǔn)要求。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株

陽性對(duì)照：CICC21636 銅綠假單胞菌；陰性對(duì)照：ATCC13525 熒光假單胞菌。

以上菌株來源可追溯，均為F3 代工作菌株。

1.5 方法

在100 級(jí)潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行操作，將250 mL水樣通過孔徑0.45 μm 的濾膜過濾，并將濾膜移至CN 瓊脂培養(yǎng)基上，倒置于36 ℃±1 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)20 ～24 h 和40 ～48 h后觀察濾膜上菌落的生長情況，并對(duì)可疑菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，包括藍(lán)/ 綠色菌落、產(chǎn)熒光（非藍(lán)/ 綠色）菌落、紅褐色菌落。挑取2 ～3 個(gè)藍(lán)/ 綠色菌落，在純化后做綠膿菌素測定實(shí)驗(yàn)，若綠膿菌素測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為陽性，則判斷為銅綠假單胞菌陽性。挑取產(chǎn)熒光（非藍(lán)/ 綠色）菌落純化后至乙酰胺肉湯中，若乙酰胺肉湯產(chǎn)胺，則判定為銅綠假單胞菌陽性。挑取純化后的紅褐色菌落進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)，若氧化酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性，則接種至金氏B 培養(yǎng)基于36 ℃±1 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 ～5 d，每天檢查是否產(chǎn)生熒光性，將5 d 內(nèi)產(chǎn)生熒光的記錄為陽性。最后，對(duì)所有判定為陽性的菌落進(jìn)行計(jì)算計(jì)數(shù)。

1.6 判定

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》GB19298-2014 中的規(guī)定，每250 mL 水樣中不得檢出銅綠假單胞菌，即n=5,c=0,m=0。

2 結(jié)果

監(jiān)督抽檢共277 批次，其中55 批次為瓶裝水，均未檢出銅綠假單胞菌，檢出率為0%；222批次為桶裝水，檢出銅綠假單胞菌37 批次，檢出率為16.7%（表1）。

表1 銅綠假單胞菌檢出結(jié)果表

結(jié)果顯示，在同一批次5 份檢測樣品中，均檢出銅綠假單胞菌的僅有3 批次，占37 批次不合格樣品的8.1%；其中4 份樣品檢出銅綠假單胞菌的有3 批次，占比8.1%；其中3 份樣品檢出銅綠假單胞菌的有6 批次，占比16.2%；其中2 份樣品檢出銅綠假單胞菌的有10 批次，占比27.0%；僅有1 份樣品檢出銅綠假單胞菌的有15 批次，占比40.5%。

3 分析與調(diào)查

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，桶裝水銅綠假單胞菌檢出率明顯高于瓶裝水，且同一批次桶裝水5 份樣品均檢出銅綠假單胞菌的比率較低，表明銅綠假單胞菌污染水體具有偶發(fā)性。結(jié)合生產(chǎn)工藝分析可知，檢出銅綠假單胞菌可能與包裝容器受到污染有關(guān)，此結(jié)論與馬群飛等[4]的研究吻合。一方面，所有檢出銅綠假單胞菌的樣品均為桶裝水，桶裝水的包裝容器存在重復(fù)利用的情況，即使用結(jié)束后回收舊桶，通過清洗消毒等工序后重復(fù)使用，導(dǎo)致水桶來源較雜、報(bào)廢率低，部分桶超期服役，這對(duì)后期桶的消毒以及桶蓋密封性都帶來很大的挑戰(zhàn)[5]。另一方面，空桶的清洗消毒是生產(chǎn)環(huán)節(jié)中很重要的一個(gè)步驟，清洗消毒過于簡單易導(dǎo)致清洗消毒達(dá)不到效果。瓶蓋的消毒同樣重要，若不消毒或消毒不徹底就投入使用，也可能受到銅綠假單胞菌污染。

桶裝水5 份樣品中有91.9%的樣品存在銅綠假單胞菌分布不均勻的情況，即5 桶水中有一部分，甚至只有1 桶水被銅綠假單胞菌污染，表1 中5 桶水中均檢出銅綠假單胞菌的樣品僅有3 例，結(jié)合實(shí)地調(diào)研分析，部分周轉(zhuǎn)桶清洗不到位是導(dǎo)致成品水被銅綠假單胞菌污染的主要因素。瓶裝水的包裝容器是一次性消費(fèi)使用的，不存在重復(fù)利用的情況，這對(duì)于控制微生物的污染有很大的幫助。

3.2 企業(yè)調(diào)研

3.2.1 包裝飲用水水源調(diào)查

重點(diǎn)對(duì)包裝飲用水生產(chǎn)企業(yè)所用水源的質(zhì)量狀況和特點(diǎn)進(jìn)行研究分析，銅綠假單胞菌在自然界中廣泛存在，主要在淡水和土壤中最為常見。水源水易帶入，過濾除菌設(shè)備的濾膜孔徑至少應(yīng)達(dá)到0.45μm，企業(yè)若長期對(duì)過濾裝置不進(jìn)行清洗消毒或者不定期更換，會(huì)導(dǎo)致成品水中帶入銅綠假單胞菌。

3.2.2 開展灌裝間空氣清潔度檢測

包裝飲用水的生產(chǎn)環(huán)境較為濕潤，有利于銅綠假單胞菌的生長繁殖，而且很難被徹底清除。部分小企業(yè)灌裝車間的空氣清潔度達(dá)不到要求（靜態(tài)時(shí)應(yīng)達(dá)到10 000 級(jí)且灌裝局部空氣清潔度應(yīng)達(dá)到100 級(jí)，或者灌裝車間的空氣清潔度整體應(yīng)達(dá)到1 000 級(jí)）。

3.2.3 生產(chǎn)工藝關(guān)鍵控制點(diǎn)調(diào)查

通過實(shí)地調(diào)研并進(jìn)行評(píng)價(jià)性檢測，深入了解包裝飲用水生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)工藝現(xiàn)狀，重點(diǎn)針對(duì)蓄水池、管道、灌裝線等各種設(shè)備的清洗消毒關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行分析研究，我們了解到目前水廠對(duì)包裝飲用水采取的殺菌方式主要有UV 消毒、臭氧消毒、消毒劑（二氧化氯、次氯酸、食品級(jí)改性過氧化氫和過氧乙酸等）消毒。部分企業(yè)質(zhì)量管理不規(guī)范，管道、包材的清洗、消毒不嚴(yán)格，水處理設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)不到位，容易導(dǎo)致凈化水微生物滋生。

3.2.4 包裝材料污染因素

水桶由于在運(yùn)輸、銷售以及清洗過程中會(huì)產(chǎn)生一定的磨損，存在細(xì)小的縫隙，給清洗和消毒過程造成了巨大的干擾，部分水企在回收舊桶時(shí)缺乏相應(yīng)規(guī)程，通常為降低成本，使一些水桶超期服役，不易清洗。我們對(duì)歷年來有過銅綠假單胞菌檢出的企業(yè)進(jìn)行回收桶檢測，隨機(jī)抽取10 家，每家隨機(jī)抽取5 個(gè)經(jīng)過清洗消毒后的空桶，密封后送往實(shí)驗(yàn)室使用濾膜法檢測，仍有7 家企業(yè)每5 桶檢出銅綠假單胞菌及其他細(xì)菌。

3.2.5 部分企業(yè)對(duì)殺菌控制不嚴(yán)格

對(duì)臭氧濃度、紫外線強(qiáng)度、過濾除菌濾料的控制還沒有形成有效的管理模式。一些企業(yè)為了減少產(chǎn)生溴酸鹽，對(duì)臭氧殺菌工藝的水流速、臭氧流量、臭氧濃度設(shè)置偏低，不能保證有效殺菌。同時(shí)，缺乏對(duì)滅菌效果的評(píng)價(jià)和管道、容器、設(shè)備清洗消毒效果、消毒劑殘留的驗(yàn)證手段。

3.2.6 生產(chǎn)人員衛(wèi)生意識(shí)淡薄

未按照相關(guān)消毒要求進(jìn)入生產(chǎn)車間，不嚴(yán)格按照程序操作等都可能導(dǎo)致銅綠假單胞菌被帶入成品水中。況且，部分小企業(yè)不具備出廠檢驗(yàn)?zāi)芰?，通常灌裝后直接銷售。

4 結(jié)論

銅綠假單胞菌是食源性和水源性致病菌,是衡量飲用水衛(wèi)生狀況的重要指標(biāo)。包裝飲用水在各個(gè)環(huán)節(jié)都有被污染的可能性，如生產(chǎn)源水污染、設(shè)備未徹底消毒、灌裝車間空氣潔凈度未達(dá)到要求、反滲透膜長期不更換、包材污染、生產(chǎn)人員二次污染等都會(huì)引起銅綠假單胞菌超標(biāo)。

綜合以上，提出以下幾方面建議：①加強(qiáng)水源的監(jiān)管，定期對(duì)水源水進(jìn)行監(jiān)測。②加強(qiáng)水處理方式，建議在濾膜及反滲透系統(tǒng)前增加紫外線殺菌裝置，可以一定程度上控制銅綠假單胞菌的污染。③制定包裝水桶回收規(guī)程，及時(shí)淘汰報(bào)廢桶，并且強(qiáng)化包材清洗流程，定期監(jiān)測水桶及瓶蓋消毒效果。④建議企業(yè)研發(fā)使用一次性水桶或其他包裝材料，從根源杜絕包裝材料受到銅綠假單胞菌污染。⑤對(duì)水企從業(yè)人員進(jìn)行培訓(xùn)，對(duì)檢驗(yàn)員應(yīng)定期培訓(xùn)考核。⑥對(duì)空氣潔凈度定期監(jiān)測，避免環(huán)境導(dǎo)致銅綠假單胞菌的污染。