雷 雨，鄭 洋，謝等等，楊曉星

（1. 甘肅定西市食品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 定西 743000；2. 河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南平頂山 467000；3. 長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434000）

亞麻（Linum usitatissimum） 又稱壁虱胡麻、鴉麻或胡麻等，隸屬于亞麻科亞麻屬。為一年生草本植物，分為纖維用、油用和油纖兼用3 種類型。亞麻籽中含有對人體有益的α -亞麻酸、蛋白質(zhì)、膳食纖維、酚類物質(zhì)等多種功能成分[1]，在預(yù)防心血管疾病和癌癥，以及降低骨吸收率、抗炎、抗抑郁等方面均具有重要作用[2-4]。亞麻籽的主要成分是油（30%～40%） 和蛋白（約20%），還有一定量的亞麻籽膠、木脂素、抗維B6因子和毒性物質(zhì)生氰糖苷等[5]。亞麻籽油中含有十幾種環(huán)肽，總含量為0.5～2.0 mg/g[6]，環(huán)肽是亞麻籽油重要的副產(chǎn)物，與普通直鏈小分子肽相比，環(huán)肽化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，在體外具有廣譜、高效的抗菌活性及其他一些生理活性，如抗腫瘤、消炎、護(hù)肝等，應(yīng)用前景廣闊[7]。

肽類化合物在廣義上是指以酰胺鍵形成的一類化合物，狹義是指以氨基酸肽鍵形成的一類化合物，根據(jù)肽鍵的結(jié)構(gòu)可以分為直鏈肽和環(huán)肽[3]。環(huán)肽在自然界中廣泛分布，動物、植物、真菌、細(xì)菌和海洋生物中都含有特殊結(jié)構(gòu)環(huán)肽。天然的環(huán)肽中常含有非常罕見氨基酸，如D -氨基酸、β -氨基酸和α, β -二脫氫氨基酸等，主要分為雜環(huán)肽和均環(huán)肽，全部由氨基酸組成并且嚴(yán)格按照肽鍵成環(huán)的稱均環(huán)肽；主鏈由肽鍵組成，而以其他官能團(tuán)（如二硫鍵、酯鍵、醚鍵、硫醚鍵等） 成環(huán)，以及含非氨基酸組成的假肽稱為雜環(huán)肽[8]。亞麻籽環(huán)肽是一組存在于亞麻籽和根莖中的疏水性環(huán)型植物肽，由8～9 個(gè)氨基酸組成，使得其分子量近似1 kDa。但不同品種的亞麻籽中環(huán)肽的含量差別很大，可能是受到基因型的影響，也可能與環(huán)境因素有關(guān)[6]。Oyunchimeg S 等人[9]的研究表明，環(huán)肽作為一種抗氧化劑可提高亞麻籽油的穩(wěn)定性，也可被看作是促氧化劑，這取決于濃度和當(dāng)時(shí)所處的環(huán)境。He G 等人[10]研究了亞麻環(huán)肽B3及其類似物對人類惡性瘧原蟲的生存抵制作用。江紫琦[11]的研究表明，傳統(tǒng)的Folin -酚法不適用于環(huán)肽的定量。當(dāng)環(huán)肽含量在0～200 μg/mL 內(nèi)，不管紫外檢測波長是500 nm 還是745 nm，用該法測得的環(huán)肽濃度和吸光值沒有良好的線性關(guān)系?？捡R斯亮藍(lán)法測定環(huán)肽含量，檢測波長為595 nm，環(huán)肽在0～20 μg/mL 及20～200 μg/mL 的質(zhì)量濃度內(nèi)，所得回歸方程線性關(guān)系良好（R2分別為0.99 和0.999）。該法操作簡便快捷、穩(wěn)定性好，可用于快速測定環(huán)肽含量。HPLC 法測環(huán)肽含量，環(huán)肽含量在0.5～8.0 mg/mL內(nèi)，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好線性（R2=0.99）[12-13]。研究利用凱氏定氮法測定總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法提取蛋白，高效液相色譜法檢測蛋白及利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌檢測亞麻籽環(huán)肽的抑菌性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥的亞麻籽、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、1 mol/L 的氫氧化鈉、1 mol/L 的氯化氫、85%的磷酸、硫酸、五水硫酸銅、硫酸鉀、正己烷、果膠酶、Tris-HCl 緩沖液、4%硼酸、考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清白蛋白、乙醇、甲醇、乙腈、氯化鈉、瓊脂粉、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、BCA 試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電子計(jì)價(jià)秤，永康市永州衡器有限公司產(chǎn)品；高效多功能粉碎機(jī)，上海市久品工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；磁力攪拌機(jī)，北京卓信宏業(yè)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；40 目、80 目篩，浙江上虞市五四儀器篩具廠產(chǎn)品；pH 計(jì)，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；低速離心機(jī)，安徽嘉文儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；超低溫冰箱，美國熱電公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國PE 公司產(chǎn)品；全自動凱氏定氮儀，北京盛科信德科技有限公司產(chǎn)品；0.45 μm 濾膜，天津津騰產(chǎn)品；蠕動泵，保定申辰泵業(yè)有限公司產(chǎn)品；全自動高壓滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司產(chǎn)品；超凈試驗(yàn)臺、恒溫振蕩器，北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 亞麻籽樣品的前處理

2.1.1 脫膠處理

（1） 溫水脫膠。稱取50 g 亞麻籽，用自來水沖洗干凈后，按照1∶6 的料液比向其中加入溫水，在磁力攪拌器上以轉(zhuǎn)速1 500 r/min，50 ℃下持續(xù)攪拌，至溫水黏稠、且轉(zhuǎn)子不能夠帶動亞麻籽快速轉(zhuǎn)動時(shí)更換溫水，直至亞麻籽攪拌一段時(shí)間后溶液不出現(xiàn)黏稠狀態(tài)，即脫膠完畢，將脫膠后的亞麻籽置于電熱鼓風(fēng)干燥及中烘干，稱量。

（2） 酶法脫膠。稱取2 份亞麻籽，每份質(zhì)量50 g。第1 份亞麻籽按照1∶6 的料液比向其中加入蒸餾水，使用1 mol/L 的氫氧化鈉溶液和1 mol/L 的氯化氫溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值到7.0 左右，向其中加入果膠酶1 500 U/g，在34 ℃下水浴加熱3 h，在此過程中每隔10 min 攪拌1 次亞麻籽，使其脫膠更加徹底。當(dāng)加入的蒸餾水黏稠到一定程度時(shí)，更換蒸餾水，并且重新調(diào)節(jié)pH 值至7.0 左右，加入果膠酶，34 ℃下水浴加熱。更換3～4 次蒸餾水，當(dāng)亞麻籽基本不黏手時(shí)停止脫膠。將脫膠完畢的亞麻籽置于電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)中烘干，稱量。

第2 份亞麻籽按照1∶6 的料液比加入蒸餾水，使用1 mol/L 的氫氧化鈉溶液和1 mol/L 的氯化氫溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值到3.5 左右，向其中加入果膠酶100 U/g，在55 ℃下水浴加熱4 h，在此過程中每隔10 min 攪拌1 次亞麻籽，使其脫膠更加徹底。當(dāng)加入的蒸餾水黏稠到一定程度時(shí)，更換蒸餾水，并且重新調(diào)節(jié)pH 值至3.5 左右，加入果膠酶，55 ℃下水浴加熱。直至更換3～4 次蒸餾水，所稱取的亞麻籽基本不黏手時(shí)停止脫膠。將脫膠完畢的亞麻籽置于電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)中烘干，稱量。

2.1.2 脫脂處理

將脫膠干燥之后的亞麻籽粉碎，過40 目篩，稱重。取2 份亞麻籽粉末，每份質(zhì)量20 g。向第1 份的亞麻籽粉末中按照1∶3 的料液比加入正己烷并靜置5 h，再將正己烷和油相倒出，繼續(xù)按照1∶3 的料液比向其中加入正己烷過夜。棄去正己烷和油相，將脫脂的亞麻籽粉末在36 ℃下水浴加熱，除去其中的正己烷，過80 目篩，稱量。向第2 份的亞麻籽粉末中按照1∶6 的料液比加入正己烷并靜置5 h，再將正己烷和油相倒出，繼續(xù)按照1∶6 的料液比向其中加入正己烷過夜。棄去正己烷和油相，將脫脂的亞麻籽粉末在36 ℃下水浴加熱，除去其中的正己烷，過80 目篩，稱量。

2.1.3 亞麻籽粉末中環(huán)肽粗蛋白的提取

稱取1 g 脫脂脫膠的亞麻籽粉末，按照1∶20 的料液比向預(yù)處理的亞麻籽粉末中加入蒸餾水混合均勻。使用1 mol/L 的氫氧化鈉溶液和1 mol/L 的氯化氫溶液調(diào)整pH 值至10 左右，在48.4 ℃下水浴加熱90 min，且期間要經(jīng)常攪拌使蛋白充分溶解。然后將溶液倒入離心管中，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心15 min，得到環(huán)肽粗蛋白沉淀。將所得的沉淀物采用上述方法重復(fù)浸提1 次，將2 次浸提后得到的上清液合并，再用1 mol/L 的氫氧化鈉溶液和1 mol/L 的氯化氫溶液調(diào)整pH 值至4.5 左右，使環(huán)肽粗蛋白沉淀，再以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心15 min，倒出沉淀物，并用少量蒸餾水沖洗沉淀3 次，再用1 mol/L 的氫氧化鈉溶液和1 mol/L 的氯化氫溶液調(diào)整pH 值至7.0 左右，攪拌使環(huán)肽粗蛋白重新溶解。將蛋白溶液置于-80 ℃冰箱預(yù)冷凍2 h，再轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱過夜，最后進(jìn)行冷凍干燥24 h，最終得到亞麻籽環(huán)肽粗蛋白，稱量[14]。

2.2 環(huán)肽粗蛋白的測定

2.2.1 凱氏定氮法測定總蛋白

（1） 樣品消解。樣品粉碎后過80 目篩子，稱取樣品0.5 g，放入消化管內(nèi)。分別加入硫酸鉀7 g、五水硫酸銅0.2 g、濃硫酸溶液12 mL 后輕搖消化管使其混勻。經(jīng)4 擋消解儀消化15 min，使蛋白質(zhì)樣品碳化；9 擋下消化60 min 直至樣品呈現(xiàn)藍(lán)綠色的澄清透明狀態(tài)。隨后將消化管冷卻至50～60 ℃。

（2） 凱氏定氮測定。在測定之前，首先檢查氫氧化鈉、水和硼酸試劑桶溶液是否足量，然后設(shè)置模式為蒸餾方式，蒸餾時(shí)間和滴定時(shí)間為30 s。每次樣品管排空，開始測定，記錄數(shù)據(jù)[15]。

2.2.2 考馬斯亮藍(lán)法測定提取蛋白

100 mg 的考馬斯亮藍(lán)G-250，體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液50 mL，85%的磷酸溶液100 mL，加Tris-HCl 緩沖液定容至1 000 mL，即得到考馬斯亮藍(lán)G-250 染色液。在電子天平上稱取12.5 mg 的結(jié)晶牛血清白蛋白于小燒杯內(nèi)，加入少量Tris-HCl 緩沖液溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL 的容量瓶中，用少量Tris-HCl 緩沖液沖洗3 次，將沖洗液倒入容量瓶中，最后用Tris-HCl 緩沖液定容至刻度，配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量濃度為250 μg/mL。稱取25 mg的環(huán)肽粗蛋白溶解于100 mL 的Tris-HCl 緩沖液配制成樣品蛋白溶液。通過檢測吸光度測定待測樣品的蛋白含量[16]。

2.2.3 高效液相色譜法檢測蛋白

首先，稱量冷凍干燥的環(huán)肽粗蛋白5 mg，溶解于50%的乙腈5 mL 中，配置成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的樣品溶液；隨后樣品溶液經(jīng)0.45 μm 有機(jī)系的濾膜過濾后注入待測樣瓶中；超純水和乙腈需提前超聲處理1 h 備用。

參考鄒仙果[3]和左洋等人[13]關(guān)于高效液相色譜法洗脫亞麻籽環(huán)肽的方法，試驗(yàn)采用C18分析柱，設(shè)置流動相A 相為乙腈、B 相為超純水，柱溫30 ℃，紫外檢測波長214 nm，每次進(jìn)樣量10 μL，洗脫流速0.8 mL/min。采用的洗脫梯度為體積分?jǐn)?shù)45%～65%的乙腈溶液（0～25 min），體積分?jǐn)?shù)65%的乙腈溶液（25～45 min），體積分?jǐn)?shù)65%～45%的乙腈溶液（45～50 min）。

2.3 環(huán)肽粗蛋白的分離純化與檢測

2.3.1 柱層析法

根據(jù)郭其洪等人[17]的方法并稍作修改，向25g 的葡聚糖凝膠G-15 中加入3～4 倍體積的Tris-HCl 緩沖液，浸泡24 h，使葡聚糖凝膠G-15 充分溶脹，使用移液槍除去上層漂浮的凝膠，避免影響洗脫效果。將充分溶脹的葡聚糖凝膠G-15 在120 W 下超聲處理1.5 h，使氣泡完全逸出。將層析柱用鐵架臺固定，連接蠕動泵。將脫氣的葡聚糖凝膠G-15 使用玻璃棒引流裝柱，最好1 次裝完凝膠懸液，如果不能，則要在下層凝膠未完全沉淀時(shí)向其中2 次加入凝膠懸液，且加入后使用玻璃杯攪拌，在不觸碰已經(jīng)完全沉淀的凝膠前提下將2 次加入的凝膠懸液混勻。裝柱過程中避免出現(xiàn)氣泡或者斷層，裝柱后上層界面應(yīng)保持平整。使用蠕動泵將流速控制在3 mL/5 min，使用Tris-HCl 緩沖液平衡7 個(gè)柱體積，流出的溶液pH 值和加入緩沖液的pH 值相近即可。

將提取的環(huán)肽粗蛋白配制成5 mg/mL 的溶液（Tris-HCl 緩沖液配置），隨即進(jìn)行過濾，吸取蛋白樣品溶液進(jìn)行上樣。靜置一段時(shí)間后，用Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)的流速為3 mL/5min，每管收集3 mL，在收集9～10 個(gè)柱體積后停止。

2.3.2 BCA 法檢測蛋白

（1） 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備。取1 mL 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)（20 mg BSA） 中，充分溶解后配制成20 mg/mL 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。取質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL 稀釋至1 mL，得到1 mg/mL 的蛋白溶液，依次將蛋白進(jìn)行稀釋，分別得到0.500，0.400，0.300，0.200，0.100，0.050，0.025 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。置于-20 ℃下保存。

（2） BCA 工作液的配制。根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA 試劑A 加1 體積BCA 試劑B（50∶1） 配制適量BCA 工作液，充分混勻，配制成BCA 工作液5.1 mL。BCA 工作液室溫24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

（3） 蛋白濃度檢測。96 孔板中分別依次加入100 μL 的梯度蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液或洗脫下來的收集液，并向每一個(gè)孔中加入100 μL 的BCA 工作液，于60 ℃下孵育30 min，使用酶標(biāo)儀檢測樣品在波長562 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白濃度[18]。

2.4 環(huán)肽粗蛋白的抑菌試驗(yàn)

首先配置500 mL LB 培養(yǎng)基（2.5 g 酵母浸粉、5.0 g 胰蛋白胨、5.0 g 氯化鈉，加入少量蒸餾水使其溶解，定容至500 mL，調(diào)節(jié)pH 值至7.2 左右），分為4 瓶。其中，2 瓶中各加入1 mL 的大腸桿菌，其余2 瓶中各加入1 mL 的金黃色葡萄球菌，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。將活化的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各吸取1 mL 轉(zhuǎn)移至新的LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。接著稱取5，10，15，20，25，30，35 mg 的環(huán)肽粗蛋白，分別溶于10 mL的蒸餾水中，配制成不同濃度梯度的環(huán)肽粗蛋白。最后配置營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.5 g，氯化鈉2.5 g，瓊脂粉7.5 g，定容至500 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2 左右），滅菌處理。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌稀釋至106個(gè)/mL，采用濾紙片法做抑菌試驗(yàn)，其中采用生理鹽水做空白對照，每組蛋白設(shè)置3 組平行，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h。觀察并用直尺用十字交叉法測量其抑菌圈直徑，取平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 亞麻籽樣品的前處理結(jié)果

3.1.1 亞麻籽脫膠處理對產(chǎn)品的影響

不同處理方法對亞麻籽脫膠效果的影響見表1。

表1 不同處理方法對亞麻籽脫膠效果的影響

由表1 可知，采用溫水脫膠時(shí)亞麻籽的粘壁程度相當(dāng)嚴(yán)重，且在脫膠后干燥耗時(shí)較長，亞麻籽顏色較淺，脫膠量為8.43 g；采用1 500 U/g 的酶法脫膠時(shí)亞麻籽粘壁程度較輕，且在脫膠后干燥的耗時(shí)相對較短，亞麻籽顏色較淡，脫膠量為9.01 g；采用100 U/g 的酶法脫膠時(shí)亞麻籽粘壁程度較輕，且在脫膠后干燥耗時(shí)短，亞麻籽顏色較深，脫膠量為9.34 g。所以，試驗(yàn)采用100 U/g 的酶法進(jìn)行脫膠。

3.1.2 亞麻籽脫脂處理對蛋白提取量的影響

不同脫脂處理對亞麻籽蛋白得率的影響見表2。

表2 不同脫脂處理對亞麻籽蛋白得率的影響

由表2 可知，采用1∶3 的料液比進(jìn)行脫脂，經(jīng)堿溶酸沉法和冷凍干燥后，所得的蛋白質(zhì)質(zhì)量和1∶6 的料液比處理的亞麻籽粉末所得到的蛋白質(zhì)質(zhì)量相差不大，但是在蛋白純度和純蛋白提取率方面，1∶6 的料液比效果更好。所以，試驗(yàn)采用1∶6 的料液比方法進(jìn)行亞麻籽的脫脂處理。

3.2 環(huán)肽粗蛋白的測定結(jié)果

3.2.1 凱氏定氮法結(jié)果

（1） 凱氏定氮法測定原理。

（2） 蛋白質(zhì)含量的計(jì)算。

式中：X——樣品中蛋白質(zhì)的百分含量，%；

V1——樣品消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL；

V2——試劑空白消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL；

N——硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度，%；

0.014——1 N 硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 m 相當(dāng)于氮的克數(shù)；

M——樣品的質(zhì)量，g；

F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

計(jì)算可得在0.5 g 的亞麻籽粉末樣品中蛋白質(zhì)含量約為0.23 g。

3.2.2 考馬斯亮藍(lán)法結(jié)果

（1） 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2） 蛋白質(zhì)得率計(jì)算。由圖1 可計(jì)算出，樣品蛋白的質(zhì)量濃度為145.8 mg/mL。

3.2.3 高效液相色譜法結(jié)果

環(huán)肽粗蛋白的高效液相圖譜見圖2。

圖2 環(huán)肽粗蛋白的高效液相圖譜

參考左洋等人[13]關(guān)于亞麻籽環(huán)肽分離純化的研究中亞麻籽粗環(huán)肽標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖譜，判斷該環(huán)肽粗蛋白中含有CLF，CLG，CLC，出峰時(shí)間在3～6 min。

3.3 環(huán)肽粗蛋白的純化與檢測結(jié)果

3.3.1 BCA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

BCA 標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 BCA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.2 分離管的蛋白濃度及分析

分離純化的蛋白濃度圖見圖4。

圖4 分離純化的蛋白濃度圖

由圖4 可知，在洗脫的管子中，前面30 個(gè)左右的收集液管是蛋白質(zhì)含量較高，是由加入的蛋白質(zhì)中未經(jīng)過凝膠孔徑而直接留下來的混合蛋白質(zhì)；從第65 個(gè)洗脫管到74 個(gè)洗脫管中有一個(gè)較小的峰值，推測該范圍是洗脫下的相對分子量小于1 500 的含有環(huán)肽的混合蛋白；在第2 管、第17 管和第50 管中出現(xiàn)蛋白含量激增的情況，推測可能是由于試驗(yàn)操作的失誤，導(dǎo)致的蛋白含量大幅度增加。

3.4 環(huán)肽粗蛋白的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

以濾紙片法測定抑菌圈，生理鹽水作為空白對照，抑菌圈為0，測定不同質(zhì)量濃度梯度的環(huán)肽粗蛋白對大腸桿菌的抑菌效果。

不同質(zhì)量濃度環(huán)肽蛋白對抑菌結(jié)果的影響見表3。

表3 不同質(zhì)量濃度環(huán)肽蛋白對抑菌結(jié)果的影響

由表3 可知，對于大腸桿菌而言，較低質(zhì)量濃度的環(huán)肽粗蛋白對大腸桿菌并幾乎沒有抑菌作用，在質(zhì)量濃度達(dá)到15 mg/mL 時(shí)才會出現(xiàn)抑菌效果，且抑菌圈小于5 mm，抑菌效果一般；當(dāng)環(huán)肽粗蛋白濃度達(dá)到30 mg/mL 時(shí)，對大腸桿菌形成的抑菌圈大于5 mm，抑菌效果為中等。對于金黃色葡萄球菌而言，同樣低質(zhì)量濃度的環(huán)肽粗蛋白幾乎不產(chǎn)生抑菌效果，只有當(dāng)環(huán)肽粗蛋白的質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL 時(shí)，才會產(chǎn)生抑菌圈，且抑菌圈的平均直徑小于5 mm，抑菌效果一般；只有當(dāng)環(huán)肽粗蛋白的質(zhì)量濃度達(dá)到35 mg/mL 時(shí)，才會對金黃色葡萄球菌形成大于5 mm的抑菌圈，抑菌效果為中等。

4 結(jié)論

通過對亞麻籽中環(huán)肽的研究，結(jié)果表明，脫膠脫脂方法都會影響環(huán)肽的提取，在100 U/g 酶法脫膠時(shí)亞麻籽粘壁程度較輕，且在脫膠后干燥耗時(shí)短，亞麻籽顏色較深，脫膠量為9.34 g。采用1∶3 的料液比所得的蛋白質(zhì)質(zhì)量和1∶6 的料液比處理的亞麻籽粉末所得到的蛋白質(zhì)質(zhì)量相差不大，但是在蛋白純度和純蛋白提取率方面，1∶6 的料液比效果更好。試驗(yàn)通過2 種不同的方法測定蛋白質(zhì)，得出凱氏定氮法在0.5 g 的亞麻籽粉末樣品中蛋白質(zhì)含量約為0.23 g，考馬斯亮藍(lán)法得出環(huán)肽粗蛋白的提取率為64.9%，提取的蛋白純度為58.32%。此外，試驗(yàn)通過HPLC 對環(huán)肽蛋白進(jìn)行測定，得出提取的環(huán)肽粗蛋白中含有氧化的環(huán)肽，并對提取出的環(huán)肽粗蛋白采用了柱層析法進(jìn)行分離純化，證明了成功分離出環(huán)肽。同時(shí)，對提取的環(huán)肽粗蛋白進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)環(huán)肽粗蛋白對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有一定的抑菌作用，且對大腸桿菌的抑菌作用比金黃色葡萄球菌的抑菌能力強(qiáng)。目前，對于亞麻籽環(huán)肽的制備、抑菌效果等方面的研究還不夠深入，所以，優(yōu)化亞麻籽的制備工藝對深入發(fā)展亞麻籽產(chǎn)業(yè)具有十分重要的意義。