黃紅葉，林志剛，陳水金，陳樂春，張幻真，陳進(jìn)城，蔣晶晶，江 煜，王曉華，方佳鈺

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實驗室，福建 福州 350003）

神經(jīng)病理性疼痛是一種復(fù)雜的慢性疼痛，由中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或功能障礙引起[1]。行為學(xué)上，它的特征是異常的自發(fā)性疼痛，疼痛知覺的改變，以及刺激誘發(fā)的異常疼痛癥狀，已造成巨大的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。臨床與動物研究均發(fā)現(xiàn)推拿可顯著緩解神經(jīng)病理性疼痛，但鎮(zhèn)痛機(jī)制尚不明確[3-4]。

鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（calmodulin dependent protein kinase II,CaMKⅡ）是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸化蛋白激酶，參與疼痛中樞敏化，對神經(jīng)元可塑性有重要意義[5]。突觸素（synaptophysin，SYP）表達(dá)于突觸囊泡膜，參與了突觸的形成與調(diào)節(jié)，在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。CaMKⅡ和SYP 是突觸相關(guān)蛋白，其在神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角中的表達(dá)增加[7-8]，在海馬中降低[9-10]，提示神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生可能與脊髓背角和海馬的突觸可塑性的改變有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)推拿能夠抑制脊髓背角突觸可塑性[11],基于此，本研究通過觀察推拿手法對CCI大鼠海馬神經(jīng)元及突觸相關(guān)蛋白CaMKⅡ與SYP 的表達(dá)，探討推拿手法的鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 取32 只體質(zhì)量180-200g，成年雄性SD 大鼠，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。正式實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、推拿組，每組8只。

1.2 實驗試劑與器材 大鼠固定器（專利號：201821139321.X）、自制推拿按摩指套（專利號：ZL201821318407.9）、HE 染色試劑盒（索萊寶）、兔多克隆抗體CAMKⅡ（proteintech）、兔多克隆抗體Syn‐aptophysin（proteintech）、GAPDH 內(nèi)參（proteintech）、488 綠色熒光二抗（proteintech）、HRP 標(biāo)記抗兔二抗（proteintech）、BCA 蛋白定量試劑盒（博士德）、SDSPAGE 凝膠制備試劑盒（博士德）、蛋白質(zhì)常規(guī)分子量標(biāo)（proteintech）、ECL 超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（百賽生物）、抗熒光淬滅封片液（碧云天）、ImageLab 圖像分析系統(tǒng)，ImageJ圖像處理軟件。

1.3 造模方法 根據(jù)Bennett和Xie[12]方法制備坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(Chronic Constriction Injury，CCI) 大鼠模型。用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg，i.p.）麻醉大鼠后，暴露大鼠右大腿坐骨神經(jīng)，使用4-0 鉻制羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)，結(jié)扎4 道，每道間隔1.0-1.5mm，以觀察到大鼠后肢肌肉輕微抽動為宜?？瞻捉M不做任何處理，假手術(shù)組大鼠僅暴露右坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎。

1.4 推拿干預(yù) 手法操作前先將大鼠置于推拿操作固定裝置5min，適應(yīng)環(huán)境。操作時，用右手拇指對大鼠右后肢委中穴進(jìn)行推拿按揉法操作。手法選擇：按揉法為臨床常用治療手法，對于疼痛有明顯緩解作用。依據(jù)前期預(yù)實驗經(jīng)驗，自制推拿按摩指套（專利號：ZL201821318407.9）最佳手法頻率為30 次/分鐘，力量約4-6N，持續(xù)10 分鐘。穴位選擇：由于“委中穴”所在位置為大鼠股二頭肌，此處肌肉較為豐滿，便于進(jìn)行按揉手法操作；此外，由大鼠腰膨大發(fā)出的脊神經(jīng)根穿出椎間孔后向下組成坐骨神經(jīng)，支配股二頭肌，因此我們選取右后肢“委中穴”進(jìn)行推拿按揉治療，可使推拿起到較好治療作用。推拿治療從術(shù)后第4天開始，每日1次，連續(xù)14天。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 機(jī)械足反射閾值（PWT）參照Chaplan[13]的研究，每只大鼠被放入有鋼絲網(wǎng)底部的有機(jī)玻璃盒子中，以適應(yīng)周圍環(huán)境30 分鐘。使用不同等級的Von-Frey 纖毛刺激大鼠右后爪足底表面，由低等級逐級向高等級測試，引起大鼠出現(xiàn)縮足、舔腳等反應(yīng)時的刺激強(qiáng)度定義為機(jī)械足反射閾值（PWT）。分別在術(shù)前1 天、術(shù)后第4、10、14 和18 天觀察各組大鼠PWT改變。

1.5.2 HE 染色 推拿干預(yù)14 天后，每組取4 只大鼠，麻醉后灌流固定，取出大鼠全腦，置于4%多聚甲醛中固定48h，經(jīng)脫水、包埋、切片和置片程序備好石蠟切片。取海馬區(qū)域的石蠟切片，經(jīng)梯度酒精脫水，蘇木素染色5min，流水沖洗3min，鹽酸酒精分化2s，伊紅染色30s，流水沖洗5min 后中性樹脂封片。400 倍鏡下觀察左側(cè)海馬神經(jīng)元形態(tài)，染色結(jié)果為細(xì)胞核藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)紅色。

1.5.3 免疫熒光染色 海馬石蠟切片梯度酒精脫水，放入煮沸的EDTA 修復(fù)液中高溫修復(fù)2h。經(jīng)PBS 洗滌，加入0.3%Triton 穿透10min，再加入BSA 封閉液，37℃烘箱封閉1h。加入CaMKⅡ抗體(1∶200)4℃過夜。第二天經(jīng)PBS 洗滌后加入488 標(biāo)記的驢抗兔IgG（二抗，1:500）37℃烘箱避光孵育2h。PBS 洗滌后，使用抗熒光淬滅封片液封片。200倍鏡下以左側(cè)海馬為觀察部位，在相同條件下，拍照采集圖片。用ImageJ 圖像分析軟件對CaMKⅡ免疫熒光圖片進(jìn)行分析，計算CaMKⅡ平均光密度。

1.5.4 Western Blot 推拿干預(yù)14 天后每組取4 只大鼠，麻醉后斷頭處死，迅速取出左側(cè)海馬放入EP 管中，-80℃冰箱保存。稱重后加入相應(yīng)裂解液，離心取上清液。BCA 法測定蛋白濃度，樣品用12%凝膠濃度進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜、牛奶封閉1h，加入SYP 抗體（1:1000）搖床4℃過夜。TBST 洗滌后加入二抗（驢抗兔IgG，1:5000），室溫?fù)u床2h。PVDF 膜放入顯色液后進(jìn)行圖像掃描，使用Image Lab 軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，以GAPDH 為內(nèi)參，計算目的蛋白相對灰度值。

1.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。其余數(shù)據(jù)采用Oneway-ANOVA（單因素方差分析）分析組間差異，方差齊用LSD 法，方差不齊用Games Howell法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)結(jié)果CCI 術(shù)后，模型組大鼠出現(xiàn)跛行，右后足呈明顯跖屈與外翻畸形，且常見舔舐、懸空等后肢保護(hù)現(xiàn)象，對機(jī)械刺激敏感。經(jīng)推拿治療后，大鼠跛行與足跖屈、外翻畸形有所改善，偶見右后肢保護(hù)現(xiàn)象，對機(jī)械痛刺激敏感性有所下降。如圖1 所示，各組大鼠在造模前PWT 均無差異（P＞0.05），空白組與假手術(shù)組PWT 術(shù)后均無差異（P＞0.05），與假手術(shù)組相比，模型組術(shù)后第4-18 天PWT出現(xiàn)明顯下降（P＜0.001），與模型組相比，推拿組PWT逐漸升高，術(shù)后第10-18天差異明顯（第10天P＜0.05，第14天P＜0.05，第18天P＜0.01）。

圖1 各組大鼠右后足PWT值變化(g)

2.2 形態(tài)學(xué)結(jié)果HE 染色 從圖2 可見，空白組與假手術(shù)組海馬神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整。與空白組及假手術(shù)組相比，模型組海馬神經(jīng)元損傷，排列紊亂，結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞固化萎縮明顯；相比模型組，推拿組在一定程度上恢復(fù)了神經(jīng)元的損傷，神經(jīng)元排列有序，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞固化與萎縮減輕，具有顯著效果。

圖2 各組大鼠海馬HE染色結(jié)果（×400）

2.3 免疫熒光染色 如圖3 所示，海馬區(qū)CaMKⅡ主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞膜?？瞻捉M與假手術(shù)CaMKⅡ陽性表達(dá)無差異（P＞0.05）。與空白組和假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬的CaMKⅡ陽性表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，推拿組海馬CaMKⅡ陽性表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 Western Blot 如圖4-5 所示，空白組與假手術(shù)組SYP 表達(dá)無差異（P＞0.05），與空白組及假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬SYP 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05）；與模型組相比，推拿組大鼠SYP蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠海馬SYP及內(nèi)參的灰度條帶

圖5 各組大鼠海馬SYP及內(nèi)參的蛋白表達(dá)

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是一種以自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏為特征的慢性疼痛，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的傷害性刺激可引起脊髓背角突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變，這些可塑性變化可導(dǎo)致脊髓背角中樞敏化，從而維持神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生[14]。突觸可塑性包含結(jié)構(gòu)可塑性與功能可塑性，主要表現(xiàn)為突觸傳遞的長時程增強(qiáng)（long-term poten‐tiation,LTP），均與疼痛密切相關(guān)。突觸是兩個神經(jīng)元相互接觸并能傳遞信息的結(jié)構(gòu)，主要由突觸前部（突觸前膜與突觸囊泡）、突觸間隙（其中包含大量神經(jīng)遞質(zhì)）以及突觸后膜（由細(xì)胞骨架蛋白與調(diào)節(jié)蛋白組成）構(gòu)成[15]。CaMKII是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在突觸前后膜均有廣泛表達(dá)，CaMKII可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，調(diào)控突觸傳遞和突觸可塑性，從而對疼痛產(chǎn)生影響[16]。研究發(fā)現(xiàn)突觸前膜的CaMKⅡ通過調(diào)控靶點(diǎn)的磷酸化促進(jìn)興奮性遞質(zhì)的釋放，使其作用于突觸后膜的NMDA受體，進(jìn)而激活CaMKⅡ，從而誘導(dǎo)突觸后膜的長時程增強(qiáng)與突觸結(jié)構(gòu)重塑[17]。突觸素（synaptophysin,SYP）是一種位于突觸前膜，并能與突觸囊泡相互聯(lián)系的鈣結(jié)合蛋白，在神經(jīng)遞質(zhì)釋放及囊泡再循環(huán)的過程中發(fā)揮重要作用[18]，同時突觸素也直接參與了突觸的形成與調(diào)節(jié)，是突觸可塑性的重要標(biāo)志[19]。經(jīng)典的理論認(rèn)為CaMKⅡ與突觸囊泡相接后，可提高突觸素與突觸囊泡的結(jié)合力，從而調(diào)節(jié)突觸可塑性[20]。由此可見，CaMKⅡ與SYP在突觸可塑性中發(fā)揮重要作用。

本團(tuán)隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，CCI大鼠出現(xiàn)脊髓背角突觸間隙變窄、突觸前膜活性帶長度增加及突觸后膜致密物變厚等結(jié)構(gòu)變化[21]，同時也出現(xiàn)明顯LTP增強(qiáng)現(xiàn)象[11]，這說明CCI大鼠脊髓背角發(fā)生結(jié)構(gòu)與功能可塑性。推拿不僅緩解CCI 大鼠疼痛，同時也逆轉(zhuǎn)了這些突觸可塑性改變，意味著推拿通過調(diào)控脊髓背角突觸可塑性發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。目前推拿鎮(zhèn)痛機(jī)制研究主要圍繞外周與脊髓[22,23]，但疼痛并非簡單的外周與脊髓水平傷害性刺激的直接產(chǎn)物，更有可能是由高級中樞對傷害性刺激信號整合、處理而產(chǎn)生的。海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成之一，不僅接受疼痛信息的傳入，還能處理整合疼痛信息，調(diào)節(jié)疼痛所引起的機(jī)體反應(yīng)，參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展[24]。研究發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)損傷后，大鼠的海馬的長時程增強(qiáng)（LTP）受損[25]，并出現(xiàn)樹突棘萎縮，樹突分支數(shù)目減少以及突觸后致密物變薄、活性帶長度縮短等突觸結(jié)構(gòu)可塑性的表現(xiàn)[10,26]，這表明海馬突觸可塑性同樣參與了神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)的形成與維持?；诖?，我們選擇了海馬作為推拿鎮(zhèn)痛機(jī)制進(jìn)一步研究對象。

慢性疼痛可誘導(dǎo)脊髓背角突觸長時程增強(qiáng)，但對海馬區(qū)LTP 有損害作用。同時海馬樹突長度和棘突密度顯著減少，脊髓背角樹突長度和密度顯著增加[27]。另有研究發(fā)現(xiàn)疼痛大鼠脊髓背角突觸相關(guān)蛋白CaMK Ⅱ和SYP 表達(dá)增加[7-8]，在海馬中表達(dá)減少[9-10]，這表明神經(jīng)病理性疼痛模型中，海馬突觸可塑性減弱，脊髓背角突觸可塑性增強(qiáng)，疼痛導(dǎo)致脊髓背角與海馬突觸可塑性發(fā)生完全相反的變化。本研究采用慢性壓迫性損傷模型來模擬腰椎間盤突出癥神經(jīng)性疼痛，該模型利用羊腸線對坐骨神經(jīng)進(jìn)行機(jī)械性壓迫，造成慢性神經(jīng)損傷，這種神經(jīng)損傷能夠保持穩(wěn)定的疼痛狀態(tài)，非常接近于臨床上腰椎間盤突出壓迫周圍神經(jīng)引起下肢放射痛的病理過程[28]。

腰椎間盤突出癥中醫(yī)稱為“腰痛病”，并將其歸于“經(jīng)筋”病范疇。經(jīng)筋功能失常表現(xiàn)如《素問·長刺節(jié)論》所云：“病在筋，筋攣節(jié)痛，不可以行，名為筋痹”即肢體疼痛、活動不利等，這與腰椎間盤突出癥臨床表現(xiàn)吻合。中醫(yī)認(rèn)為腰痛病病機(jī)主要包括“不通則痛”與“不榮則痛”，并在《素問·血?dú)庑沃酒放c《素問·調(diào)經(jīng)》中提到“……經(jīng)絡(luò)不通，病生于不仁，治之以按摩醪藥”及“神不足者，視其虛絡(luò)，按而致之，……以通其經(jīng)，神氣乃平”等治療方法，由此可見中醫(yī)推拿治療“經(jīng)筋”疾病有著悠久的歷史。目前推拿也已廣泛應(yīng)用于腰椎間盤突出癥的治療，主要包括按揉法、推法、拿法和點(diǎn)法等[29]，均能明顯緩解疼痛，有著具有顯著的臨床療效[30]。慢性壓迫性損傷模型是對于坐骨神經(jīng)的直接壓迫，長期的壓迫又致神經(jīng)所支配區(qū)域氣血失于濡養(yǎng)，因此，本病病機(jī)同時包含“不通則痛”與“不榮則痛”，通過對疼痛部位的點(diǎn)按、按揉，推拿可發(fā)揮疏經(jīng)通絡(luò)、促進(jìn)運(yùn)行氣血的功效，從而達(dá)到“通則不痛”、“榮則不痛”鎮(zhèn)痛作用[31-32]。

本研究結(jié)果顯示，CCI手術(shù)可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)疼痛行為，降低機(jī)械足反射閾值，推拿可緩解大鼠疼痛行為（P＜0.05），升高大鼠機(jī)械足反射閾值（P＜0.05），這與我們前期研究一致[32]；HE 染色下觀察到空白組與假手術(shù)組大鼠左側(cè)海馬神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)完整且飽滿，CCI 造模后海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞明顯，排列紊亂，細(xì)胞固化萎縮，經(jīng)推拿治療后，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯改善，排列趨于整齊，由此可推斷推拿可保護(hù)CCI 大鼠海馬神經(jīng)元，減少神經(jīng)元損傷；神經(jīng)元之間通過突觸聯(lián)系，神經(jīng)元的變化與突觸相關(guān)蛋白密切相關(guān)。模型組大鼠海馬CaMKII 與SYP 蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05），提示CCI會導(dǎo)致海馬突觸可塑性降低，這與之前的研究一致[33]；推拿治療可使海馬CaMKII 與SYP 蛋白表達(dá)明顯上升（P＜0.05），即增強(qiáng)了這兩個蛋白的活性，鑒于這兩個蛋白對于突觸可塑性的重要意義，我們推測認(rèn)為推拿可使海馬CaM‐KII 與SYP 表達(dá)上調(diào)，加強(qiáng)了海馬突觸之間的聯(lián)系，從而改善海馬突觸可塑性，達(dá)到鎮(zhèn)痛的效果。

綜上所述，推拿鎮(zhèn)痛機(jī)制可能是通過上調(diào)海馬CaMKII與SYP表達(dá)，改善海馬突觸可塑性而起效。