廖錦彬，張 倩，周妙姿，李楚文，周 瑩，張建軍

（1.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東 廣州 510095；2.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 511436；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006）

肺癌是最常見的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung carcinoma, NSCLC）在肺癌中占比最大，其病死率也常居癌癥死因的首位[1]。當(dāng)前，化療方案仍是肺癌治療的主要措施。吉非替尼（Gefi‐tinib,GEF）是經(jīng)典的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase,EGFR-TKI）抑制劑，臨床對(duì)NSCLC 肺癌患者具有顯著效果[2]。但由于EGFR 突變和腫瘤干細(xì)胞增多等原因，GEF 治療后往往出現(xiàn)腫瘤耐藥（multiple drug resistance, MDR），導(dǎo)致患者的預(yù)后和生存較差。因此，尋找高效安全的藥物用于EGFR-TKI輔助治療和克服耐藥性，目前臨床肺癌治療的迫切需要。

紫背萬(wàn)年青（Rhoeo discolor（L’Herit.）Hance）屬于鴨跖草科植物，《全國(guó)中草藥匯編》記載，其以花葉入藥，具有清熱化痰，涼血止痢的功效；用于肺燥咳嗽，咯血，百日咳，淋巴結(jié)結(jié)核，痢疾，便血[3]。已有研究報(bào)道，紫背萬(wàn)年青對(duì)于結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌的細(xì)胞增殖均有抑制作用，能減少癌前病灶數(shù)量和面積，拮抗二乙基亞硝胺對(duì)肝細(xì)胞的損害[4-6]?；谧媳橙f(wàn)年青對(duì)于多種癌細(xì)胞的抑制作用，及其臨床實(shí)踐基礎(chǔ)，本研究擬探討紫背萬(wàn)年青提取物（Water ex‐tract from Rhoeo discolor,WER）與GEF 聯(lián)用對(duì)A549肺癌細(xì)胞的協(xié)同作用，并闡明其可能的分子機(jī)制，為紫背萬(wàn)年青作為肺癌治療的輔助藥物或化療增敏劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人肺癌A549 細(xì)胞廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑 紫背萬(wàn)年青花水提液由廣東省第二中醫(yī)院制備（濃度：0.75g/ml 的生藥量，批次：202012001#）。DMEM 培 養(yǎng) 基（11965118）、RPMI-1640 培 養(yǎng)基（11875119）、胎牛 血 清（10100147）、0.25% 胰蛋白酶（25200056）、青霉素和鏈霉素（15140122）等購(gòu)自Gibco 公司（美國(guó)）；吉非替尼（SML1657）購(gòu)自Sigma 公司（美國(guó)）；抗體Bcl-2（4223）、Bax（2772）、p-PI3K（4228）、p-Akt（4060）和GAPDH（5174）等購(gòu) 自CST 公司（美 國(guó)）；CCK-8（C0041）、Annexin V-FITC 細(xì) 胞凋 亡 檢測(cè) 試 劑盒（C1062S）、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（C1052）和PBS 購(gòu)自上海碧云天公司（中國(guó)）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（G2020）購(gòu)自武漢塞維爾生物科技（中國(guó)）。

1.3 儀器 5424R 型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；OptiMair 型超凈工作臺(tái)（新加坡Esco 公司）；DM2500 型熒光倒置顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；MPR-440F 型低溫冰箱（日本Panasonic 公司）；Epoch 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；Forma 310 系列CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；AI 800 型超靈敏多功能成像儀（美國(guó)GE 公司）；BD Accuri C6 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)A549 細(xì)胞培養(yǎng)在含1%鏈霉素-青霉素和10%胎牛血清的RMPI-1640 培養(yǎng)基中。A549細(xì)胞在37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。

1.5 細(xì)胞活力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞消化制成懸浮液，用RMPI-1640 培養(yǎng)基配制成8×104個(gè)/mL 的細(xì)胞混懸液，每孔按100 μL 接種于96 孔板，細(xì)胞貼壁24h 后，將培養(yǎng)基吸出，按需加入含有WER、GEF、WER+GEF 聯(lián)用藥物。實(shí)驗(yàn)分別以PBS 作為空白溶劑對(duì)照。細(xì)胞孵育48h 后，采用CCK8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)條件下吸光值（OD 值），并計(jì)算對(duì)細(xì)胞增值的抑制率（%）=1-（藥物OD值/空白對(duì)照OD值）×100和藥物的IC50。

1.6 Isobologram 法分析藥物相互作用 參照文獻(xiàn)方案[7]，依據(jù)CCK-8 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出不同濃度WER、GEF 對(duì)A549 細(xì)胞的IC50，分別設(shè)為WIC50和GIC50，在橫縱坐標(biāo)軸上繪制a 點(diǎn)（WIC50，0）和b 點(diǎn)（0，GIC50），連接a、b 兩點(diǎn)的直線作為相加線。根據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，求得不同濃度GEF 與WER（2.5mg/mL）聯(lián)用的GWIC50，繪制點(diǎn)c點(diǎn)（2.5，GWIC50）。若點(diǎn)c 在a b 連線下方，則表示兩藥聯(lián)用存在協(xié)同作用；若在連線上方，則表示兩藥聯(lián)用存在拮抗作用。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞消化制成懸浮液，用RMPI-1640 培養(yǎng)基配制成1×106個(gè)/mL 的細(xì)胞混懸液，每孔按2 mL 接種于6 孔板，細(xì)胞貼壁24h 后，將培養(yǎng)基吸出，按需加入含有WER、GEF、WER+GEF 聯(lián)用的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分別以PBS 作為空白溶劑對(duì)照。細(xì)胞孵育48h 后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明，胰酶消化并收集細(xì)胞，分別加入Binding 溶液，AnnexinV-FITC 和PI 溶液，避光反應(yīng)20 min，PBS 清洗，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 細(xì)胞周期檢測(cè) 如上2.4，藥物處理48h后，消化收集細(xì)胞，PBS 清洗、離心、重懸，加入預(yù)冷乙醇，4℃固定12h。然后，PBS清洗、離心、重懸細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書，加入PI染液避光反應(yīng)20 min，PBS清洗，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白 如上2.4，藥物處理48h 后，PBS 清洗細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，高速離心20 min。收集上層清液，蛋白定量并調(diào)整蛋白濃度，加上樣緩沖液，并于100 ℃金屬浴變性10 min。蛋白樣品采用12%SDSPAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜。室溫封閉1 h。隨后，加入相應(yīng)一抗（按1：1000 稀釋），4℃孵育12h，TBST 清洗后加入二抗（按1：2000 稀釋），室溫下孵育2 h，TBST清洗后采用凝膠成像系統(tǒng)和ECL檢測(cè)試劑檢測(cè)分析蛋白表達(dá)。

1.10 數(shù)據(jù)分析 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，數(shù)據(jù)以mean±SEM 表示，采用One-way ANOVA 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WER 與GEF 聯(lián)用協(xié)同抑制A549 細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖 如圖1（A）所示，CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，處理48h 以后，WER 在濃度低于2.5 mg/mL 時(shí)，A549 細(xì)胞的增殖仍保持在約90%以上；濃度提高到5～80 mg/mL 時(shí)，WER 呈現(xiàn)抑制A549 細(xì)胞增殖的作用，且具有濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。計(jì)算得到，WER 抑制作用的IC50 值為14.98mg/mL。因此，我們選擇無(wú)明顯細(xì)胞毒性的2.5mg/mL 與不同濃度的GEF（1.25～40 μmol/L）聯(lián)用使用。如圖1（B）所示，給藥后，GEF 對(duì)A549 細(xì)胞的抑制IC50從13.36 μmol·L-1降低到7.48 μmol/L；其中，與GEF 單用比較，10.0 和20.00 μmol/L 劑量的GEF 與2.5 mg/mL WER 聯(lián)用后，A549 細(xì)胞的增殖率顯著降低，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，如圖1（C）所示，Isobologram 分析結(jié)果提示，GEF 與2.5 mg/m WER 聯(lián)用對(duì)A549 細(xì)胞的IC50坐標(biāo)c（2.5，7.48）落在a 點(diǎn)（WIC50，0）和b 點(diǎn)（0，GIC50）連線的下方，提示，GEF 與2.5 mg/mL WER 聯(lián)用后，對(duì)A549 細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同作用。因此，選擇低濃度、低毒性的7.5 μmol/L 的GEF與2.5 mg/mL 的WER聯(lián)用進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖1.WER與GEF聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力的作用Fig.1 Effects of WER and GEF on cell viability and proliferation of A549 cells

2.2 WER 與GEF 聯(lián)用協(xié)同誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡 如圖2（A）所示，流式檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物處理后，對(duì)照、WER、GEF 和WER+GEF 組的A549 細(xì)胞凋亡率 分 別 為（6.55±0.92）% 、（9.49±1.18）% 、（21.36±2.37）%和（32.13±4.06）% ；與GEF 單 用 組 對(duì) 比，WER+GEF 聯(lián)用組，細(xì)胞凋亡率顯著升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨后，如圖2（B 和C）所示，Western blot 檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，藥物處理后，與GEF單用組對(duì)比，WER+GEF 聯(lián)用組的Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)比例顯著上調(diào)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2.WER與GEF 聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的作用Fig.2 Effects of WER and GEF on apoptosis of A549 cells

圖3.WER與GEF 聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞周期的作用Fig.2 Effects of WER and GEF on cell cycle of A549 cells

2.3 WER 與GEF 聯(lián)用協(xié)同阻滯A549 細(xì)胞的細(xì)胞周期 如圖3 所示，流式檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物處理后，對(duì)照、WER、GEF 和WER+GEF 組的A549 細(xì)胞的G0/G1 期DNA 含量百分比平均值分別為29.51%、33.81%、44.28% 和61.57%。與GEF 單 用 對(duì) 比，WER+GEF聯(lián)用組的G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，細(xì)胞分裂周期停滯在G0/G1 期的能力更強(qiáng)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 WER 與GEF 聯(lián)用協(xié)同 降低p-PI3K 和p-AKT 的蛋白水平 如圖4 所示，Western blot 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物處理后，與GEF 單用對(duì)比，WER+GEF 聯(lián)用組細(xì)胞中PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K 和p-Akt的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4.WER與GEF 聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)的作用Fig.2 Effects of WER and GEF on protein level of p-PI3 and p-AKT of A549 cells

3 討論

吉非替尼是第一代EGFR-TKIs，在治療具有激活EGFR 突變的NSCLC 患者中療效顯著，可改善無(wú)進(jìn)展生存期，但是GEF對(duì)野生型EGFR和KRAS突變患者不敏感，且大部分患者在接受GEF 治療一年左右會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥[8]。根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)肺癌病理和臨床表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)，可將肺癌歸屬于“肺積”、“息賁”、“勞嗽”等中醫(yī)疾病范疇。《素問(wèn).咳論》中記載肺咳之狀，咳而喘息有音，甚則唾血”，肺所導(dǎo)致的咳之癥狀，具有咳而氣喘，呼吸有聲，甚至伴有唾血等特點(diǎn)，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中常見的肺癌臨床表現(xiàn)相似[9]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于紫背萬(wàn)年青藥效的研究較少，僅見羅利瓊等[10]研究了其內(nèi)生真菌類群的分布及抗菌、抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)生真菌的發(fā)酵液有抗菌作用，并對(duì)肝癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞有抑制作用。國(guó)外的相關(guān)研究主要集中在墨西哥，Arriaga-Alba 等報(bào)道紫背萬(wàn)年青醇提物具有抗氧化、抗誘變和抗基因毒性的作用，不具有致突變或基因毒性，其抗致突變性的機(jī)制可能為烷基化，修正ogt基因編碼的烷基鳥嘌呤轉(zhuǎn)移蛋白酶[4]。Rosales-Reyes等[5]研究表明紫背萬(wàn)年青的水提物對(duì)肝癌大鼠有良好的保護(hù)作用，且藥物對(duì)肝臟沒有損害作用。García-Varela 報(bào)道[11]紫背萬(wàn)年青具有抗微生物和抗真菌作用，其水、甲醇、乙醇提取物對(duì)結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌的細(xì)胞增殖均有抑制作用[6]，能減少癌前病灶數(shù)量和面積[5]，拮抗二乙基亞硝胺對(duì)肝細(xì)胞的損害。紫背萬(wàn)年青提取物具有清熱化痰，涼血止痢的功效，用于肺燥咳嗽，咯血，百日咳，淋巴結(jié)結(jié)核[3]，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中常見的肺癌臨床表現(xiàn)相似。因此，研究紫背萬(wàn)年青提取物與吉非替尼聯(lián)用對(duì)A549 肺癌細(xì)胞的協(xié)同抑制作用，并闡明其可能的分子作用機(jī)制，對(duì)于克服吉非替尼耐藥或者增加其對(duì)癌細(xì)胞的敏感性都具有重要的意義。

本研究通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)紫背萬(wàn)年青提取物WER（劑量大于10 mg/kg）和吉非替尼GEF（劑量大于5μmol/L）可以顯著抑制A549 細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力，且呈劑量依賴性。低劑量的WER 或GEF 單獨(dú)給藥時(shí)對(duì)A549 細(xì)胞的增殖和活力抑制作用不明顯；但是WER 和GEF 兩藥聯(lián)用后則抑制效果顯著，通過(guò)Isobologram 分析也進(jìn)一步明確低劑量WER 和GEF 聯(lián)用對(duì)A549 細(xì)胞的增殖和活力具有協(xié)同抑制作用。流式檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WER 和GEF 聯(lián)用可以促進(jìn)A549 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的蛋白表達(dá)檢測(cè)提示，WER 和GEF 聯(lián)用可以干預(yù)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2 家族的表達(dá)水平；WER 和GEF 聯(lián)用促進(jìn)促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)，降低抑制凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，提示兩藥聯(lián)用后促進(jìn)A549 的細(xì)胞凋。同時(shí)，流式檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)WER+GEF 聯(lián)用組的G0/G1 期細(xì)胞比例明顯升高，細(xì)胞分裂周期停滯在G0/G1 期的能力更強(qiáng)。因此，WER+GEF 聯(lián)合用藥后，對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞G0/G1期阻滯，起到協(xié)同作用。

PI3K/Akt 信號(hào)通路體系是細(xì)胞生存和發(fā)育的重要通路。已有研究證實(shí)，激活PI3K/Akt 通路是腫瘤耐藥性形成的因素之一[7]。肺癌的多種生長(zhǎng)因子主要通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，腫瘤細(xì)胞經(jīng)化療藥物作用后增加了Akt 磷酸化水平，并激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，活化的Akt 進(jìn)一步激活其下游因子使癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[7,12]。本研究結(jié)果表明，WER+GEF 聯(lián)用后可以顯著降低PI3K 和Akt 蛋白的磷酸化水平；結(jié)果提示，兩藥聯(lián)用可協(xié)同抑制PI3K/Akt 通路的激活，從而增強(qiáng)藥物對(duì)細(xì)胞的作用。

綜上所述，WER 和GEF 聯(lián)合用藥后起到協(xié)同作用，顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和增加細(xì)胞G0/G1期阻滯，其可能的機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制作用密切相關(guān)。本研究為紫背萬(wàn)年青作為肺癌治療的輔助藥物或化療增敏劑的提供新的研究資料。