萬雪帥, 謝小兵, 趙海濤, 谷為岳, 張恒輝

1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科, 北京 100730; 2 卡替醫(yī)療技術(shù)有限公司, 北京 101111;3 北京臻知醫(yī)學(xué)科技有限公司, 免疫細胞治療北京市工程研究中心, 北京 102600

1 腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)療法概述

TIL是指存在于腫瘤實質(zhì)和腫瘤間質(zhì)內(nèi)的以T淋巴細胞為主的一類異質(zhì)性淋巴細胞群體,主要由T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞、樹突狀細胞 (DC)、巨噬細胞和髓源性抑制細胞等組成[1]。其中,負載腫瘤抗原特異性T淋巴細胞受體(TCR) 的CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)是最重要的抗腫瘤效應(yīng)淋巴細胞。其細胞表面的TCR特異性識別靶細胞膜主要組織相容性復(fù)合體 1 類分子提呈的腫瘤新抗原后,通過分泌穿孔素溶解破壞靶細胞結(jié)構(gòu),以及高表達Fas 配體 、增加合成與釋放IFN-γ與腫瘤細胞相應(yīng)受體結(jié)合激活腫瘤細胞凋亡等方式,起到殺傷腫瘤細胞的作用[2-3]。同時,CD8+T淋巴細胞在激活后隨即調(diào)高包括PD-1的抑制性免疫檢查點分子膜表達,而IFN-γ誘導(dǎo)腫瘤細胞高表達PD-L1,其與CD8+T淋巴細胞膜PD-1結(jié)合后使其成為功能受損的耗竭效應(yīng)細胞,最終產(chǎn)生免疫逃逸[4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn),PD-1+CD8+細胞占TIL中的多數(shù),且比例明顯高于正常組織及外周血。更重要的是,腫瘤特異性識別CD8+T淋巴細胞的PD-1表達水平經(jīng)過體外培養(yǎng)后下降。這提示PD-1高表達TIL經(jīng)過體外培養(yǎng),能夠改變其耗竭狀態(tài),恢復(fù)抗腫瘤功能。以上發(fā)現(xiàn)為自腫瘤組織內(nèi)分離出TIL,經(jīng)體外擴增后回輸給患者以治療腫瘤提供了理論基礎(chǔ)。

美國國家癌癥研究所Rosenberg團隊[7]最早從多種小鼠腫瘤模型中分離出TIL,并聯(lián)合IL-2治愈了100%的結(jié)腸腺癌負瘤肝轉(zhuǎn)移小鼠和50%的肺轉(zhuǎn)移小鼠,為TIL的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)[8]。此外,該團隊在1986年證實黑色素瘤患者手術(shù)切除腫瘤組織里也存在浸潤淋巴細胞,并在1988年首次用自體TIL治療1例惡性黑色素瘤并致腫瘤消退,開創(chuàng)了TIL療法。隨后,該團隊又進行了多次臨床試驗。最具有代表性的是一項納入93例伴遠處轉(zhuǎn)移的惡性黑色素瘤患者的研究,研究使用3種淋巴細胞清除預(yù)處理方案(單獨化療、2 Gy或12 Gy全身照射)的TIL治療,分別獲得了49%、52% 和 72%的客觀緩解率(ORR),其中 20例(22%)患者實現(xiàn)了完全緩解(CR),并且有19例患者的CR超過3年[9]。由于TIL療法的出色療效,該團隊研發(fā)的 TIL(LN-145,Iovance公司,美國)于2019年5月被美國食品藥品監(jiān)督管理局授予突破性療法認定。

TIL療法即基于TIL的過繼性細胞治療,是將獲取的腫瘤組織消化和分離出浸潤淋巴細胞,經(jīng)體外培養(yǎng)活化和擴增后,將高達1×1011的細胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)殺傷腫瘤細胞。在輸注TIL之前采用化療或全身照射的非清髓性淋巴細胞清除預(yù)處理,淋巴細胞清除后可以經(jīng)由不同機制提高TIL的腫瘤細胞殺傷效率[8]。鑒于IL-2是刺激T淋巴細胞增殖與存活的重要細胞因子,Rosenberg等[10]于1988年開始將IL-2聯(lián)合TIL療法應(yīng)用于抗腫瘤治療并獲得成功。因此,清淋化療預(yù)處理與細胞回輸后大劑量IL-2輸注給藥是目前TIL治療惡性腫瘤的經(jīng)典組合方案。同時,這兩種輔助治療也被認為是TIL治療相關(guān)不良反應(yīng)的主要來源。

眾所周知,CAR-T治療血液腫瘤已取得顯著療效。但實體瘤的高度異質(zhì)性使得針對單一腫瘤靶點不可避免地會導(dǎo)致抗原丟失和/或攜帶原突變深度有限而難以靶向新抗原的腫瘤細胞成為優(yōu)勢亞群,從而導(dǎo)致疾病進展或復(fù)發(fā)。而且,即使過繼性輸注大量T淋巴細胞,由于缺乏特異性腫瘤細胞識別性和對于腫瘤組織的趨化能力而難以有效浸潤到多數(shù)實體瘤組織內(nèi)。同時,腫瘤微環(huán)境中存在的各種免疫逃逸機制(如PD-1/PD-L1和CTLA-4) 和抑制性細胞[如調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)和髓源性抑制細胞]的負向調(diào)節(jié)機制,亦難以克服, 使得輸注的T淋巴細胞很難發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[11]。對于上述實體腫瘤細胞治療的瓶頸,TIL則表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。首先,TIL已經(jīng)過腫瘤細胞的濾過性篩選而具有高度異質(zhì)性腫瘤新抗原的多靶點識別性,其TCR克隆亞群對于腫瘤細胞特異識別率可達40%以上[12],故適用于高突變負荷的實體瘤 (如黑色素瘤等)。其次,由于主要成分為表達趨化因子受體的效應(yīng)記憶T淋巴細胞,因此TIL在回輸至患者體內(nèi)后易于在與腫瘤抗原特異性TCR共同作用下定位于腫瘤組織內(nèi)。此外,與CAR-T腫瘤細胞治療不同的是,TIL療法目前尚未有出現(xiàn)自身免疫毒性反應(yīng)的報道,這是因為TIL是憑借其特異性識別TCR靶向腫瘤MHC提呈的體細胞基因突變新抗原產(chǎn)物,而這些新抗原不會被機體生理組織細胞所提呈,因此不會產(chǎn)生“脫靶”效應(yīng)[13]。

2 TIL在實體腫瘤治療中的應(yīng)用

3 TIL在膽道癌中的應(yīng)用

膽道癌包括肝內(nèi)膽管癌、肝外膽管癌以及膽囊癌。肝內(nèi)膽管癌被認為是僅次于肝細胞癌的原發(fā)肝內(nèi)惡性腫瘤,發(fā)病率約占原發(fā)性肝惡性腫瘤的10%～15%[17]。根治性手術(shù)切除或肝移植是迄今為止唯一可治愈的手段。然而據(jù)報道,根治性手術(shù)后復(fù)發(fā)率高達 50%[18]。與健康的肝臟相比,肝內(nèi)膽管癌腫瘤組織中CTL和 NK 細胞的比例較低,但Treg的比例較高[19]。最常見的炎癥細胞類型是T淋巴細胞,其中CD8+T 淋巴細胞占大部分。B淋巴細胞和NK細胞的數(shù)量則較低[20]。CD8+T淋巴細胞和非Treg CD4+T淋巴細胞主要浸潤于肝內(nèi)膽管癌腫瘤組織的周邊區(qū)域,而 Treg 則常常浸潤到腫瘤組織核心區(qū)域內(nèi)[21]。一般認為,CD8+和CD4+T 淋巴細胞以及 CD20+B淋巴細胞與肝內(nèi)膽管癌的腫瘤學(xué)預(yù)后指標呈正相關(guān),而大量Treg很可能與較差的總生存期相關(guān)[22]。Oshikiri等[23]在58例肝外膽管癌手術(shù)切除標本中發(fā)現(xiàn)32例 (55%) 存在CD8+T淋巴細胞浸潤,且腫瘤內(nèi)CD8+T淋巴細胞是預(yù)測患者生存率增加的可靠指標。如上所述,膽道癌根據(jù)是否存在免疫細胞浸潤可分為存在與缺乏淋巴細胞浸潤兩類[24],即免疫“熱” 型和 “冷” 型?？傮w而言,膽道癌被傾向于界定為低CD8+T淋巴細胞豐度的 “冷腫瘤”,即是大多數(shù)效應(yīng) T淋巴細胞被隔離在腫瘤邊緣的免疫排斥性腫瘤[19,25-26]。臨床觀察也發(fā)現(xiàn),與黑色素瘤、腎細胞癌、NSCLC和結(jié)腸腺癌等其他腫瘤相比,多數(shù)研究晚期膽道癌免疫療法的臨床試驗未達到滿意的療效[27]。因此,能否成功地從膽道癌腫瘤組織中獲得足夠的浸潤淋巴細胞用以制備TIL是高度個體化的,在未能獲得腫瘤組織淋巴細胞浸潤定量證據(jù)的前提下,TIL在膽道癌中的抗腫瘤作用仍難以預(yù)測[23]。

TIL的檢測與分析已被用于對于膽道癌的評估。Yoon等[28]于2021年發(fā)表了121例晚期膽道癌患者(肝內(nèi)膽管癌68例,膽囊癌41例,Vater壺腹癌12例)的基因組測序與臨床療效的相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)KRAS改變和染色體不穩(wěn)定與PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑治療耐藥相關(guān),這類患者中95.0%接受治療后未觀察到臨床獲益。同時,還發(fā)現(xiàn)這些患者腫瘤組織中TIL密度低下,表明存在免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境和免疫原性被削弱。相比之下,腫瘤內(nèi)TIL密度高的患者則對免疫治療反應(yīng)良好。另一方面,一項包含 308 例膽道癌患者的隊列研究[29]發(fā)現(xiàn),受高水平微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 (MSI-H) 影響的患者大多具有非典型組織形態(tài)學(xué),顯示出更長的總體生存期和更高數(shù)量的 CD8+T淋巴細胞、FOXP3+Treg細胞、CD20+B淋巴細胞。這些數(shù)據(jù)表明,腫瘤體細胞突變分析結(jié)果和基因組穩(wěn)定性標志物與膽道癌的TIL浸潤程度存在相關(guān)性,并可用于預(yù)測免疫治療后的病情轉(zhuǎn)歸。

由于TIL 療法在很大程度上取決于對新抗原的識別,可能被TIL的TCR直接特異性靶向的基因組研究同樣具有重大的臨床應(yīng)用價值。一項對260例膽道癌患者腫瘤組織的基因組譜系研究揭示了包括新的潛在治療靶點的基因組改變譜。在膽囊癌和肝外膽管癌中觀察到具有較高APOBEC相關(guān)突變特征負荷的突變特征的梯度譜。包括ELF3在內(nèi)的32個顯著改變的基因被鑒定出來,近40%的病例具有靶向遺傳改變。涉及FGFR2和PRKACA或PRKACB的基因融合分別優(yōu)先發(fā)生在ICC和肝外膽管癌中[30]。這些發(fā)現(xiàn)為TIL的腫瘤識別性提供了特異性靶點。

迄今為止公布的基礎(chǔ)研究結(jié)果為TIL療法提高膽道癌患者的常規(guī)治療獲益提供了依據(jù)。Sawasdee 等[31]在使用吉西他濱與CTL聯(lián)合治療吉西他濱耐藥的膽道癌細胞體外研究中,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療增加了DC細胞激活的 T 淋巴細胞對耐藥膽道癌腫瘤細胞的殺傷活性,分析可能是由于HLA Ⅰ類分子的誘導(dǎo)上調(diào)改變了抗原呈遞過程,從而增進了CTL細胞毒性功能 。除化療外,對腫瘤免疫治療的體外研究也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象。Morisaki 等[32]用西妥昔單抗培養(yǎng)細胞因子激活的殺傷細胞,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥顯著增強了細胞毒性,并發(fā)現(xiàn)這種增強效應(yīng)被反應(yīng)體系內(nèi)加入的人免疫球蛋白所抑制,表明被激活的NK細胞以抗體依賴性作用方式提高了細胞毒性。這些體外研究和動物模型的研究結(jié)果證實了抗腫瘤藥物直接或間接影響TIL的作用功能,并可能助益膽道癌的臨床免疫治療,并可作為未來臨床轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。

盡管目前尚無以TIL為代表的過繼性細胞治療應(yīng)用于膽道癌單一病種的臨床隊列報道,但近期的多癌種臨床報道提供了少數(shù)接受TIL治療的膽道癌患者療效信息。Kverneland 等[33]于2021年報道了應(yīng)用CTLA-4單抗與納武單抗聯(lián)合常規(guī)TIL療法 (結(jié)合清淋化療預(yù)處理與大劑量IL-2) 治療包括10個癌種的25例患者的療效。入組患者中的5 例膽道癌于治療后觀察到了30%～63%的腫瘤消退。其中,3例以肺部轉(zhuǎn)移為靶病灶的患者中,1例的胸膜下小結(jié)節(jié)病灶顯著消退,評估為PR (無進展生存期為199天,總生存期為870天),其他2例患者獲腫瘤穩(wěn)定的治療反應(yīng)。由于該臨床研究包括的膽道癌病例較少,達到ORR的病例靶病灶較小且不存在其他遠處轉(zhuǎn)移病灶,因而尚有待更多病例治療后反應(yīng)數(shù)據(jù)的發(fā)布,以提供從TIL治療中實際獲益有說服力和代表性的結(jié)論。

為了實現(xiàn)TIL對膽道癌新抗原的可靠識別性,Rosenberg團隊分析全外顯子組測序HLA Ⅰ類分子的數(shù)據(jù)鑒定和分選腫瘤細胞表達的體細胞突變肽,并將這些突變表位導(dǎo)入 MHC 匹配的抗原呈遞DC細胞,將其與Young TIL 共培養(yǎng),再通過ELISPOT分析IFN-γ 的合成與分泌機能,分選出新抗原特異性 CD8+T淋巴細胞,在體外大量擴增后給予患者回輸治療。使用這樣的技術(shù)路徑,Rosenberg團隊通過獲取1例膽道癌患者手術(shù)病理組織,從分選獲得的TIL中鑒定出可以識別ERBB2IP突變的MHC Ⅱ抗原HLA-DQO6限制性CD4+T淋巴細胞。富集了95%以上ERBB2IP突變的反應(yīng)性CD4+T淋巴細胞的TIL回輸后誘導(dǎo)了患者肝和肺多發(fā)轉(zhuǎn)移灶的顯著消退。這表明腫瘤抗原特異性CD4+T淋巴細胞與CD8+CTL一樣,能夠在一定條件下發(fā)揮關(guān)鍵的抗腫瘤免疫作用[34]。

4 TIL治療膽道癌的困境和未來發(fā)展方向

使用上述技術(shù)獲得的新抗原特異性效應(yīng)TIL的顯著療效還見于黑色素瘤與結(jié)直腸癌患者的治療[35-36]。然而,這種方法需要付出高昂的成本、冗長的細胞制備周期、復(fù)雜的專用設(shè)備等代價,因而尚未廣泛應(yīng)用于臨床。

TCR的高度多樣性、優(yōu)異的浸潤腫瘤部位的能力以及TIL的低毒性是TIL療法相對于其他過繼性細胞治療的優(yōu)勢。然而,TIL療法仍面臨嚴峻挑戰(zhàn)。除生產(chǎn)成本與周期等條件的限制外,TIL治療后腫瘤反應(yīng)性也有待更多的臨床研究結(jié)果作為評估的依據(jù)。

TIL過繼性回輸與其他抗腫瘤方法學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用已證實能夠提高惡性腫瘤患者的治療獲益。與前述體外研究結(jié)果相一致,放療、化療與TIL聯(lián)合治療已分別在頭頸部癌與卵巢癌的治療中顯示出患者獲益的提升[37-38]。因此改進TIL治療體系,以提高傳統(tǒng) TIL 療法的性能與適用性是未來研究的主要策略。采用基因編輯技術(shù)敲除 TIL 的 PDCD1 基因可防止其與腫瘤微環(huán)境中的 PD-L1 結(jié)合并增加 TIL 功能[39]。有報道表明,改造 TIL以過度表達細胞因子(如 IL-2 和 IL-12),使治療細胞在腫瘤組織內(nèi)維持高細胞因子水平,可以提高抗腫瘤活性和生存期[40]。類似的改進還包括使用趨化因子CXCR2 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL (NCT01740557),以強化治療細胞趨化定位于腫瘤組織內(nèi)部的能力[41]。然而這些技術(shù)改進能否提高TIL針對膽道癌患者的療效,還需要相關(guān)的臨床研究加以驗證。

TIL療法在膽道癌的臨床應(yīng)用條件則更為復(fù)雜,膽道癌患者免疫微環(huán)境異質(zhì)性強,不同患者免疫微環(huán)境差異很大。根據(jù)腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤的差異性將腫瘤免疫微環(huán)境分為3種[42]:(1)免疫炎癥型(Inflamed):腫瘤組織周圍浸潤了較多的免疫細胞,但其中一部分細胞處于免疫抑制狀態(tài);(2)免疫阻隔型(Immune Excluded):腫瘤相關(guān)成纖維細胞及胞外基質(zhì)所形成的致密的基質(zhì)屏障,阻隔免疫細胞浸潤到腫瘤細胞周圍;(3)免疫沙漠型(Immune Desert):免疫細胞遠離腫瘤細胞,微環(huán)境幾乎沒有免疫細胞浸潤。膽道癌組織中盡管突變負荷和免疫原性較高,但腫瘤微環(huán)境高度免疫抑制。膽道癌免疫微環(huán)境浸潤有大量抑制性固有免疫細胞,包括髓源性抑制細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞、腫瘤相關(guān)中性粒細胞等[19,25-26]。T淋巴細胞一般浸潤在腫瘤組織周圍,難以進入腫瘤組織中心區(qū)域;另外,浸潤T淋巴細胞常常處于功能耗竭狀態(tài)。這些特征導(dǎo)致膽道癌患者的免疫系統(tǒng)難以持續(xù)長期發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。針對膽道癌免疫微環(huán)境特征,建立更加精準的分型方法,細分不同臨床治療方案適應(yīng)人群,對提高膽道癌的整體治療應(yīng)答率尤為重要。

TIL 作為針對惡性實體腫瘤設(shè)計的過繼性免疫細胞治療體系,已在惡性黑色素瘤等免疫細胞富集程度高的“熱腫瘤”治療中獲得優(yōu)異療效,拓展適應(yīng)癌種的臨床實踐也正在探索中。在Rosenberg等創(chuàng)始的“標準”組織TIL的“三件套”療法基礎(chǔ)上嘗試與不同抗腫瘤藥物的聯(lián)合治療和采用新技術(shù)修飾免疫細胞等努力,將有助于克服TIL在細胞作用機制與制備等方面的各種固有限制,擴展TIL治療體系的易用性和適應(yīng)病種,并提高以膽道癌為代表的免疫排斥性惡性實體腫瘤患者應(yīng)用TIL治療的臨床獲益。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：萬雪帥、謝小兵負責撰寫論文;張恒輝負責修改論文;趙海濤、谷為岳負責指導(dǎo)、審閱論文。