李雨薇，張洪昌，胡雙慶，李貞金，沈根祥，趙曉祥

(1.東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 201620;2.上海市環(huán)境科學(xué)研究院 國家環(huán)境保護(hù)新型污染物環(huán)境健康影響評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200233)

長期以來,抗生素被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[1],用于防治病害、提高飼料利用率和促進(jìn)動(dòng)物生長等。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2],2013年我國獸用抗生素的使用量約84 200 t。然而,隨著畜禽疾病的復(fù)雜化,抗生素的濫用率也逐漸提高[3]。濫用抗生素會(huì)使其在動(dòng)物體內(nèi)積累,從而造成動(dòng)物源性食品中抗生素的殘留,甚至通過食物鏈進(jìn)入人體。前人已在豬肉、豬肝、雞蛋和牛奶中檢測(cè)到不同濃度的抗生素殘留[4-9],Wang等[10-11]在江浙滬幼童尿液中檢出獸用抗生素,而動(dòng)物源性食品是最可能的來源。殘留的抗生素通過食物鏈進(jìn)入人體,會(huì)造成人體胃腸菌群失調(diào),引起長期腹瀉等反應(yīng)[12-13],嚴(yán)重的會(huì)造成免疫系統(tǒng)功能受損,甚至致畸、致癌[14-16]。

近幾年來,抗生素藥物殘留的檢測(cè)技術(shù)層出不窮[17-21]。目前,殘留抗生素檢測(cè)的前處理方法主要有液-液萃取、超聲溶劑萃取、固相萃取、加壓液體萃取、微波萃取等,檢測(cè)方法主要有電化學(xué)檢測(cè)法[22]、液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法等[23-25]。這些方法雖能獲得較好的回收率,但仍存在效率低、耗材昂貴等問題。豬肉中抗生素含量極低,且樣品基質(zhì)復(fù)雜,基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重[26-27],這是分析中的一大難點(diǎn)。雖然有學(xué)者采用超聲波溶劑萃取作為前處理方法[28],但是現(xiàn)行國標(biāo)方法中的前處理方式大多為固相萃取,存在耗時(shí)長、成本高、溶劑浪費(fèi)嚴(yán)重等缺點(diǎn)。新興的雙水相萃取技術(shù)已被廣泛用于提取和分配多種分析物,如蛋白質(zhì)、DNA、納米粒子、染料、金屬和新興污染物等[29-33],集富集、凈化于一體,萃取條件溫和,減少了有機(jī)溶劑殘留[31],與傳統(tǒng)的萃取方式相比,雙水相萃取技術(shù)在保證萃取效率的同時(shí)可節(jié)約時(shí)間成本和物質(zhì)成本[34]。目前雙水相方法針對(duì)有機(jī)污染物的提取報(bào)道多應(yīng)用于液體基質(zhì)(水樣),而在肌肉組織中應(yīng)用該方法的報(bào)道較少。

前期調(diào)研了畜禽養(yǎng)殖中的常用抗生素,發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類以及頭孢類用量較大,且這些抗生素不僅在肉類產(chǎn)品中被檢出[8-9,35-36],還在豬糞尿以及其他環(huán)境基質(zhì)中的檢出量大[21,37-38],故選取這5類17種抗生素作為研究對(duì)象。采用雙水相萃取技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀建立一種同時(shí)測(cè)定豬肉中17種典型抗生素的分析方法,對(duì)市售豬肉中抗生素殘留進(jìn)行檢測(cè),以期為未來研究多種類抗生素的聯(lián)合檢測(cè)方法提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

選取上海市市售豬肉作為研究對(duì)象,采集豬肉樣品去皮切塊,按豬肉與超純水的質(zhì)量比為4∶1在玻璃瓶?jī)?nèi)勻漿,勻漿好的豬肉4 ℃冷藏待用。

1.2 儀器與試劑

Waters Xevo TQ-XS型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國 Waters公司;AUTO-EVA型全自動(dòng)氮吹儀,廈門?？朴邢薰?Fotector Plus型全自動(dòng)固相萃取儀,廈門?？朴邢薰?Milli-Q型超純水儀,美國Millipore公司;AUW220 D型電子分析天平,上海島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司;Oasis HLB型固相萃取小柱(500 mg,6 mL),美國Waters公司;F6/10 Tissuelyser型勻漿機(jī),上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

17種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品,包括:4種大環(huán)內(nèi)酯類,即替米考星(Tilmicosin,TIL)、泰樂菌素(Tylosin,TYL)、克拉霉素(Clarithromycin,CLR)、阿奇霉素(Azithromycin,AZI);5種喹諾酮類,即恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)、達(dá)諾沙星(Danofloxacin,DAN)、諾氟沙星(Norfloxacin,NOR);4種四環(huán)素類,即土霉素(Oxytetracycline,OTC)、金霉素(Chlortetracycline,CTC)、強(qiáng)力霉素(Doxycycline,DOX)、四環(huán)素(Tetracycline,TC);3種磺胺類,即磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine,SM2)、磺胺間甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine,SMM)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SD);1種頭孢類,即頭孢噻呋(Ceftiofur,CEF)。所有抗生素的純度均大于95%,購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。用于定量的內(nèi)標(biāo)物:四環(huán)素-D6(Tetracycline-D6,TC-D6)和磺胺甲惡唑-D4(Sulfamethoxazole-D4,SMX-D4)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,氧氟沙星-D3(Ofloxacin-D3,OFL-D3)購自德國Witega公司,頭孢噻呋-D3(Ceftiofur-D3,CEF-D3)購自英國Cambridge Isotope Laboratories公司。甲醇、乙腈、正己烷和甲酸均為色譜級(jí),購自德國Merck公司。乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA)、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸銨、磷酸氫二鉀均為分析純,購自上海睿捷化學(xué)試劑有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。分別準(zhǔn)確稱取10 mg抗生素及其內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品,采用甲醇溶解并定容到100 mL,得到終質(zhì)量濃度為100 mg/L的抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于-20 ℃冰箱中避光冷藏保存。

EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的配制。準(zhǔn)確稱取37.2 g Na2-EDTA、27.5 g磷酸氫二鈉和12.9 g檸檬酸,采用超純水定容至1 L,使用前配制。

Na2-EDTA溶液配制。準(zhǔn)確稱取3.7 gNa2-EDTA,采用超純水定容至100 mL,使用前配制。

1.3 樣品前處理

加標(biāo)樣品配制。精準(zhǔn)稱取1 g脫脂勻漿豬肉于離心管中,添加不同質(zhì)量濃度的抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以及10 μL質(zhì)量濃度為10 mg/L的氧氟沙星-D3、四環(huán)素-D6、磺胺甲惡唑-D4和頭孢噻呋-D3內(nèi)標(biāo)物質(zhì),渦旋30 s,通風(fēng)櫥中放置10 min。

采用的超聲波溶劑提取參照文獻(xiàn)[17],固相萃取參照國家標(biāo)準(zhǔn)[20]。

超聲波溶劑提取。在加標(biāo)樣品中加入10 mL乙腈,超聲10 min,渦旋5 min,以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min,離心半徑為6.5 cm,將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中,向殘?jiān)屑尤?0 mL乙腈重復(fù)提取。合并上清液,加入2 g氯化鈉和20 mL正己烷,渦旋2 min,以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min,離心半徑為6.5 cm,取乙腈層溶液,于40 ℃氮?dú)獯蹈?用1 mL體積比為1∶9的0.1%甲酸/甲醇溶解殘?jiān)?過0.22 μm聚四氟乙烯針式濾器至棕色小瓶中待測(cè)。

固相萃取。在加標(biāo)樣品中加入10 mL濃度為0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液,渦旋3 min,以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,離心半徑為6.5 cm,提取兩次后合并上清液,經(jīng)Oasis HLB固相萃取小柱,用6 mL甲醇、6 mL水活化,再用6 mL水、6 mL 5%甲醇水淋洗,最后用10 mL甲醇洗脫。洗脫液氮?dú)獯蹈?用1 mL體積比為1∶9的0.1%甲酸/甲醇溶解殘?jiān)?過0.22 μm聚四氟乙烯針式濾器至棕色小瓶中待測(cè)。

雙水相萃取。在加標(biāo)樣品中加入0.2%甲酸-乙腈和Na2-EDTA體積比為7∶3的混合溶液10 mL,渦旋混合1 min,通風(fēng)櫥中靜置45 min;加入1.5 g硫酸銨,渦旋混合2 min,通風(fēng)櫥中靜置3 h使溶液分層形成雙水相。取上層以乙腈為主的有機(jī)液5 mL于40 ℃氮?dú)獯蹈?用1 mL 70%甲醇水溶解殘?jiān)?過0.22 μm聚四氟乙烯針式濾器至棕色小瓶中待測(cè)。

以上每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn),且以不添加抗生素的樣品組作為空白樣品組。

1.4 儀器條件的優(yōu)化

1.4.1 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI),掃描方式為正離子掃描,檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM),碰撞氣體為高純氬氣,脫溶劑氣流溫度為500 ℃,脫溶劑氣流速度為1 000 L/h,毛細(xì)管電壓為3.5 kV,掃描時(shí)間為0.1 s。優(yōu)化后的質(zhì)譜分析參數(shù)如表1所示。

表1 17種抗生素的質(zhì)譜檢測(cè)條件

1.4.2 色譜條件

Waters BEH C18型色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),柱溫為35 ℃,進(jìn)樣體積為1.5 μL,流動(dòng)相A為0.5%甲酸-水溶液,流動(dòng)相B為乙腈,流速為0.35 mL/min。梯度洗脫程序:0～1 min時(shí),A相和B相體積比為92∶8;1.0～1.2 min時(shí),A相和B相體積比為92∶8～80∶20;1.2～2.5 min時(shí),A相和B相體積比為80∶20;2.5～2.7 min時(shí),A相和B相體積比為80∶20～3∶97;2.7～4.5 min,A相和B相體積比為3∶97;4.5～4.7 min時(shí),A相和B相體積比為3∶97～92∶8;4.7～7.5 min時(shí),A相和B相體積比為92∶8。17種抗生素和4種內(nèi)標(biāo)物優(yōu)化后的總離子流圖如圖1所示。

1.5 方法評(píng)價(jià)

采用內(nèi)標(biāo)法定量,混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用色譜級(jí)甲醇稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1.37、3.14、12.35、37.04、111.11、333.33、500.00 μg/L的抗生素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,分別加入10 μL質(zhì)量濃度為10 mg/L的氧氟沙星-D3、四環(huán)素-D6、磺胺甲惡唑-D4和頭孢噻呋-D3內(nèi)標(biāo)混合溶液并充分混合,使內(nèi)標(biāo)終質(zhì)量濃度為100 μg/L,得到各目標(biāo)抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用加標(biāo)回收法計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,以驗(yàn)證方法有效性。采用信噪比法(S/N)確定儀器檢測(cè)限(limit of detection,LOD)和儀器定量限(limit of quantification,LOQ)。以3倍信噪比估算出儀器檢測(cè)限,10倍信噪比估算出儀器定量限。方法檢出限(method detection limit,MDL)的計(jì)算式為

DL=T(n-1,α=0.01)×S

式中:DL為方法檢出限;T(n-1,α=0.01)表示自由度為n-1和置信度為99%時(shí)的T分布;n為樣品的平行測(cè)定數(shù),n=7;S為n次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器檢出限、定量限和方法檢出限

將質(zhì)量濃度為1.37～500.00 μg/L的抗生素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在第1.4節(jié)的條件下進(jìn)行檢測(cè),以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、質(zhì)譜定量峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出在試驗(yàn)條件下所有抗生素的質(zhì)量濃度與質(zhì)譜峰面積的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.994 4,儀器檢出限為0.04～5.51 μg/L,儀器定量限為0.14～18.35 μg/L,方法檢出限為2.38～7.85 μg/kg,具體結(jié)果如表2所示。該方法條件下四環(huán)素類抗生素方法檢出限為3.08～6.48 μg/kg,與王飛等[39]報(bào)道的四環(huán)素類檢出限為5.00 μg/kg相比,OTC和CTC的檢出限有所降低。

注:縱坐標(biāo)標(biāo)目為相對(duì)豐度/%。圖1 17種抗生素及4種內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 17 antibiotics and 4 internal standards

表2 17種抗生素的保留時(shí)間、回歸曲線方程、相關(guān)系數(shù)、儀器檢出限、定量限和方法檢出限

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取方法的選擇

以回收率考察3種前處理方法的提取效果,不同提取方式對(duì)17種抗生素的加標(biāo)回收率如圖2所示。

圖2 不同提取方式對(duì)17種抗生素的加標(biāo)回收率Fig.2 The spiked recoveries of 17 antibiotics by different extraction methods

超聲波溶劑提取法:4種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率均在56.2%以下,可能該類物質(zhì)提取過程中損失較多;5種喹諾酮類抗生素的回收率為66.6%～165.4%,其中環(huán)丙沙星(162.0%)和諾氟沙星(165.4%)回收率較高,可能是基質(zhì)干擾的原因;其余8種抗生素的回收率為77.7%～131.4%,回收率在正常范圍內(nèi)。固相萃取法:4種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率均低于35.0%,這可能由于該類固相萃取條件沒有優(yōu)化完善或繁瑣的過程造成了該抗生素的損失;5種喹諾酮類抗生素中沙拉沙星的回收率為119.3%,其余抗生素回收率為140.9%～292.3%,具體原因需要做進(jìn)一步探究;其余8種抗生素的回收率為65.3%～129.7%。以上兩種提取方式對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的提取效果較差,且難以消除基質(zhì)對(duì)喹諾酮類抗生素的影響(回收率大多為150.0%～300.0%)。雙水相萃取的原理主要是利用物質(zhì)在兩相間的選擇性分配差異而進(jìn)行的分離提純,使得大部分溶于水的雜質(zhì)保留在下層水相,而對(duì)乙腈親和度較高的抗生素被保留在上層有機(jī)相。采用雙水相提取不僅提高了大環(huán)內(nèi)酯的回收率(66.3%～89.4%),還有效降低了基質(zhì)對(duì)喹諾酮類抗生素(回收率為72.4%～106.1%)的干擾。綜合考慮各抗生素的回收率水平,選擇雙水相萃取作為前處理方法。

2.2.2 雙水相萃取條件的優(yōu)化

乙腈能促進(jìn)蛋白質(zhì)沉淀,其比甲醇和乙酸乙酯更易去除基質(zhì)干擾。文獻(xiàn)[28]研究顯示,乙腈體積分?jǐn)?shù)小于60%不能引起蛋白質(zhì)完全變性,而純乙腈易使蛋白質(zhì)快速變性凝聚后包裹藥物,導(dǎo)致藥物回收率偏低。故選擇體積分?jǐn)?shù)為70%～90%的乙腈水溶液進(jìn)行試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為70%的乙腈水溶液的萃取效果最佳。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)在乙腈水溶液中添加體積分?jǐn)?shù)為0.2%甲酸能顯著提高抗生素回收率,這與Song等[24]研究結(jié)果一致。文獻(xiàn)[40-43]的研究表明,EDTA可以提高四環(huán)素類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的萃取效率,Na2-EDTA具有相同作用,且更易配制,故采用Na2-EDTA作為螯合劑。選擇2種不同組成的提取液分別為體積比為7∶3的0.2%甲酸-乙腈/水和體積比為7∶3的0.2%甲酸-乙腈/Na2-EDTA,不同提取溶液對(duì)17種抗生素的加標(biāo)回收率如圖3所示。

圖3 不同提取溶液對(duì)17種抗生素的加標(biāo)回收率Fig.3 The spiked recoveries of 17 antibiotics by different extraction solutions

選用體積比為7∶3的0.2%甲酸-乙腈/水時(shí):大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率為127.0%～164.4%,頭孢噻呋的回收率為160.3%,兩者回收率偏高的原因可能是基質(zhì)效應(yīng);喹諾酮類抗生素回收率為79.2%～108.5%;磺胺類抗生素的回收率為92.3%～101.7%;而四環(huán)素類抗生素回收率偏低為49.6%～55.6%,這可能是由于試驗(yàn)中接觸到的金屬離子與四環(huán)素類藥物相互作用所致的[39]。選用體積比為7∶3的0.2%甲酸-乙腈/Na2-EDTA時(shí):磺胺類抗生素的回收率為94.9%～100.0%;頭孢噻呋的回收率降低為129.7%;四環(huán)素類抗生素的回收率為65.3%～106.1%,有顯著提高,與王飛等[39]報(bào)道的四環(huán)素類回收率為53.4%～89.4%相比也有所提高;大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗生素的回收率有所降低,分別為114.4%～124.7%和72.4%～106.1%,這與Freitas等[40]報(bào)道的EDTA能提高喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類萃取效果不一致,造成這種結(jié)果的原因可能是樣品基質(zhì)不同,具體原因需進(jìn)一步探究。

在選擇分相鹽時(shí)發(fā)現(xiàn)K2HPO4和(NH4)2SO4的回收率不存在顯著性差異,但選用(NH4)2SO4時(shí),雙水相成相時(shí)間短且上層提取液較為澄清。多次篩選重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)樣品質(zhì)量為1.0 g、提取液為10 mL時(shí),加入1.5 g (NH4)2SO4,雙水相成相速度快且萃取效果佳。綜上所述,考慮全部目標(biāo)抗生素的回收率,最終確定體積比為7∶3的0.2%甲酸-乙腈/Na2-EDTA為最佳提取溶液,(NH4)2SO4為最佳分相鹽。

2.3 萃取方法評(píng)價(jià)

采用優(yōu)化后的檢測(cè)方法,在不同的加標(biāo)水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),最終計(jì)算得到各抗生素的平均回收率結(jié)果如表3所示。各目標(biāo)抗生素在4個(gè)加標(biāo)水平(10.0、50.0、100.0、200.0 μg/kg)下的回收率良好,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均小于12.6%。

表3 不同加標(biāo)水平的17種抗生素加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 The spiked recoveries and relative standard deviations of 17 antibiotics at different spiked levels

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用本文方法對(duì)上海地區(qū)市售豬肉樣品進(jìn)行檢測(cè),17種抗生素均未檢出,與Chen等[9]報(bào)道在25個(gè)豬肉、豬肝、牛奶樣品中檢出SAR、ENR和TC的質(zhì)量濃度為5.10～22.30 μg/kg,兩者的檢出結(jié)果稍有差異,這種不一致可能與研究區(qū)域生產(chǎn)和使用抗生素的種類不同有關(guān)。這表明不同地區(qū)、不同來源的豬肉樣品所檢出抗生素的種類和檢出水平有所差異,其主要受養(yǎng)殖末期抗生素使用情況的影響。本文試驗(yàn)豬肉樣品所有檢測(cè)結(jié)果均符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[43]規(guī)定,沒有檢出抗生素含量超標(biāo)的豬肉。

3 結(jié) 論

(1)雙水相萃取結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法能有效提取豬肉中的17種目標(biāo)抗生素,選用體積比為7∶3的0.2%甲酸-乙腈/Na2-EDTA作為萃取溶劑,(NH4)2SO4作為分相鹽時(shí),17種目標(biāo)抗生素的回收率最佳。

(2)通過與其他傳統(tǒng)前處理方法對(duì)比,本文方法集富集、凈化于一體,耗時(shí)短、效率高,17種抗生素的回收率為65.3%～129.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.6%,符合殘留檢測(cè)要求。

(3)實(shí)際豬肉樣品均未檢出17種抗生素,但鑒于畜禽養(yǎng)殖過程中存在抗生素違規(guī)使用的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)抗生素使用的監(jiān)管。