李 闊，李 靜

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腫瘤血液病科，四川 瀘州 646000）

近年來，隨著惡性腫瘤發(fā)病率的不斷上升，放射治療（放療）的應(yīng)用頻率也在不斷增加?；颊咴诮邮芊暖熀笠壮霈F(xiàn)一系列的不良反應(yīng)，其中放射性皮炎是主要的不良反應(yīng)之一[1]。若患者出現(xiàn)嚴重的放射性皮炎，不僅會使治療中斷，同時也會大大降低其生活質(zhì)量。有研究顯示，對皮膚進行放射性照射，僅僅5 Gy的劑量就會引起皮膚紅斑，若劑量加大，還可引起皮膚潰瘍、剝脫[2]。目前，針對放射性皮炎尚無有效的治療手段?；谧鎳鴤鹘y(tǒng)醫(yī)學(xué)中“治未病”的觀點，我科根據(jù)《外臺秘要》中的“黃連解毒湯”制成“黃連解毒液”。通過前期的臨床試驗證實，局部預(yù)防性涂擦黃連解毒液可以有效預(yù)防、治療放射性皮炎[3-4]。但黃連解毒液預(yù)防、治療放射性皮炎的作用機制尚不明確。因此，有必要通過嚴謹?shù)目茖W(xué)思維和客觀的科學(xué)實驗，明確黃連解毒液促進放射性皮炎修復(fù)、愈合的機制，加強祖國醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的聯(lián)系，為臨床治療放射性皮炎提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物

8 周齡雌性Wistar 大鼠56 只，先在飼養(yǎng)觀察室內(nèi)觀察3 d 后再進行動物實驗。大鼠體重（200±20）g，由四川省實驗動物飼養(yǎng)中心同批喂養(yǎng)，動物飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為（25±1）℃，濕度為65%。所有大鼠實驗均按照動物保護法進行，并經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要藥品和試劑

藥品：黃連解毒液，由黃連、黃芩、黃柏、紫草、冰片、麻油組成，并由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室按外用油劑生產(chǎn)工藝流程制備，規(guī)格為100 mL/瓶；人表皮生長因子外用溶液（由深圳華生元基因工程發(fā)展有限公司生產(chǎn)）；生理鹽水。試劑：抗大鼠EGF 單克隆抗體、抗大鼠EGFR 單克隆抗體、抗大鼠VEGF單克隆抗體、抗大鼠VEGFR 單克隆抗體、抗大鼠bFGF 單克隆抗體、抗大鼠bFGFR 單克隆抗體、抗大鼠TGF 單克隆抗體、抗大鼠TGFR 單克隆抗體、抗大鼠PGDF 單克隆抗體、抗大鼠PGDFR 單克隆抗體。

1.3 照射儀器

醫(yī)科達Elekta Compact（射線性質(zhì)和能量：6MV X 射線，劑量率為350 MU/min，劑量均勻性為±3.0%）；Q550CW 圖像信號采集與分析系統(tǒng)（德國制造）。

1.4 方法

1.4.1 模型建立：給予Wistar 大鼠Ⅳ度放射性皮炎造模 1% 戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，將Wistar 大鼠固定于特制的照射架上，暴露左下肢，用飽和硫化鈉與等量滑石粉制成的糊劑對大鼠的照射部位進行脫毛，照射面積為2.0 cm×2.0 cm，身體其他部位用鉛板屏蔽，以直線加速器電子線6 MeV 單次照射。照射距離100 cm，照射劑量60 Gy，一次照射即建成大鼠Ⅳ度放射性皮炎模型。放療計劃及放療均由放療醫(yī)師完成。

1.4.2 動物分組和給藥 將Wistar 大鼠按隨機數(shù)表法分為四組：正常組、空白組、對照組和治療組，正常組（不建模）8 只，空白組、對照組和治療組（此三組建模）各16 只，全部單籠飼養(yǎng)。造模成功的當天開始給予治療?？瞻捉M給予生理鹽水外敷創(chuàng)面，對照組給予人表皮生長因子外用溶液外敷創(chuàng)面，治療組給予黃連解毒液外敷創(chuàng)面。各組均每天外敷2 次，給藥量均為1 mL，連續(xù)給藥28 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 創(chuàng)面愈合率和愈合時間 所有大鼠均從給藥第1天起拍攝記錄左后肢放射性皮炎部位的皮損情況。記錄各時間點的創(chuàng)面愈合情況，測出創(chuàng)面面積，計算各時間點的創(chuàng)面愈合率。以創(chuàng)面完全上皮化、無滲出作為創(chuàng)面完全愈合的依據(jù)，記錄創(chuàng)面愈合時間。創(chuàng)面愈合率=（1- 現(xiàn)在的傷口面積）/ 初始傷口面積×100%。

1.5.2 病理染色及免疫組化檢測細胞因子含量 分別于照射后第7 天、第14 天、第21 天、第28 天各取空白組、對照組及治療組大鼠4 只，頸椎脫臼處死后切取左后肢照射野皮膚組織1 cm×l cm，在10% 甲醛溶液中固定，24 h 后常規(guī)石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，儲于-70 ℃的冰箱中備用。常規(guī)行蘇木精- 伊紅（HE）染色，封片，光鏡觀察。按照各細胞生長因子試劑盒說明書對其切片進行染色，黃色表示為陽性，然后通過Q550CW 圖像信號采集系統(tǒng)對其進行處理，進而計算出各生長因子的表達量。本實驗中檢測的生長因子包括表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點創(chuàng)面愈合率的對比

治療1 周、2 周、3 周及4 周后，對照組、治療組大鼠的創(chuàng)面愈合率均高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的創(chuàng)面愈合率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠不同時間點創(chuàng)面愈合率的對比（%，± s）

表1 各組大鼠不同時間點創(chuàng)面愈合率的對比（%，± s）

注：b 與空白組對比，P ＜0.05；c 與對照組對比，P ＜0.05。

組別 治療1 周后 治療2 周后 治療3 周后 治療4 周后正常組（n=8）- - - -空白組（n=16）15.48±4.32 18.47±4.28 21.75±4.48 31.08±3.54對照組（n=16）19.67±4.21b 27.39±2.99b 49.67±2.85b 69.51±3.82b治療組（n=16）24.36±1.89bc 41.62±4.62bc 69.57±1.59bc 85.62±7.45bc

2.2 各組創(chuàng)面組織愈合情況的對比

空白組經(jīng)HE 染色見創(chuàng)面表皮角化，部分表皮內(nèi)水泡形成，真皮充血水腫，大量炎癥細胞浸潤。第4周時，對照組、治療組的創(chuàng)面損傷程度均明顯改善，且創(chuàng)面組織修復(fù)程度均優(yōu)于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 第4 周時各組大鼠創(chuàng)面的病理組織學(xué)變化（HE，×200）

2.3 治療后各組大鼠創(chuàng)面組織中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF 表達情況的對比

治療后，與空白組相比，對照組和治療組創(chuàng)面組織 中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、FDGF 的 表 達水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組相比，治療組創(chuàng)面組織中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、FDGF 的表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 治療后各組大鼠創(chuàng)面組織中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF 表達情況的對比（± s）

表2 治療后各組大鼠創(chuàng)面組織中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF 表達情況的對比（± s）

注：a 與正常組對比，P ＜0.05；b 與空白組對比，P ＜0.05；c 與對照組對比，P ＜0.05。

組別 EGF（μg/mL）VEGF（pg/mL）bFGF（pg/mL）TGF-β（pg/mL）PDGF（pg/mL）正常組（n=8）54.25±5.24 58.65±6.08 52.38±4.92 51.65±3.78 57.38±5.45空白組（n=16）139.48±12.36a 167.25±13.02a 148.76±12.54a 152.37±11.35a 144.76±10.26a對照組（n=16）110.31±10.78ab 125.54±14.36ab 109.62±10.35ab 121.05±10.76ab 115.38±10.41ab治療組（n=16）85.69±8.62abc 100.05±9.87abc 88.76±6.53abc 101.38±9.48abc 98.76±9.59abc

3 討論

中醫(yī)學(xué)認為，放射線是“火熱毒邪”，放射性皮炎是由于熱毒過盛、熱邪傷陰引起皮膚脫屑、紅斑、瘙癢、潰瘍等，故治療上應(yīng)以清熱涼血、瀉火解毒、去腐生肌、活血化瘀為主，且后期應(yīng)輔以滋陰治療[5]。早在《金匱要略》中，醫(yī)圣張仲景就提到“浸淫瘡，黃連粉主之”。中醫(yī)藥治療放射性皮炎常以紫草、黃連、黃芩、黃柏等為主藥，這些都是清熱解毒的要藥[6]。其中紫草味苦、性寒，有研究人員應(yīng)用紫草液噴霧劑預(yù)防鼻咽癌患者放療后并發(fā)Ⅲ級及以上放射性皮炎，結(jié)果顯示患者Ⅲ級及以上放射性皮炎的發(fā)生率僅為3%[7]。以黃芩、黃柏、黃連等為主要成分的濕潤燒傷膏具有清熱解毒、滲濕斂瘡的作用。有學(xué)者臨床觀察76 例腫瘤放療患者外用美寶濕潤澆傷膏的效果，結(jié)果顯示較應(yīng)用凡士林乳膏的患者急性皮膚反應(yīng)程度明顯減輕，美寶濕潤燒傷膏可提高放射區(qū)皮膚對放射線的耐受性[8]。

bFGF 是一種肝素結(jié)合生長因子，能夠?qū)C體的血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)外胚層以及間葉細胞等細胞的增殖起到很好的促進作用，同時還具有一定的促血管生成活性，當機體的皮膚受到放射性損傷時，其表達會升高[9]。VEGF 能夠促進血管生成，增加血管的通透性，當機體皮膚受到放射性損傷時，VEGF 就會大量表達，以促進皮膚的修復(fù)[10]。EGF 是一種能夠促進表皮生長的細胞生長因子，可很好地改善皮膚損傷，加速傷口的愈合[11]。TGF-β 既能促進膠原蛋白的生成，又能將傷口中相關(guān)酶的作用減弱，進而可使得創(chuàng)口的愈合速度加快[12]。PDGF 對于維持正常血管形成的穩(wěn)定性至關(guān)重要[13]。對于放射性皮炎大鼠，在利用黃連解毒液進行治療時，檢測其生長因子的表達水平能夠很好地反映藥效及治療效果。

本研究結(jié)果顯示，治療1 周、2 周、3 周及4 周后，對照組、治療組大鼠的創(chuàng)面愈合率均高于空白組（P＜0.05）；治療組的創(chuàng)面愈合率均高于對照組（P＜0.05）；第4 周時，對照組、治療組的創(chuàng)面損傷程度均明顯改善，且創(chuàng)面組織修復(fù)程度均優(yōu)于空白組（P＜0.05）；治療后，與空白組相比，對照組和治療組創(chuàng)面組織中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、FDGF的表達水平均降低（P＜0.05）；與對照組相比，治療組創(chuàng)面組織中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、FDGF的表達水平均降低（P＜0.05）。可見，黃連解毒液能改善皮膚組織中的炎癥細胞浸潤，降低大鼠皮膚組織中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF 的表達，提高放射性皮炎創(chuàng)面的愈合率。