呂美，郭怡德，陳耀還，羅文賢，曾曉晨，江海英，陳金平，靖元孝

（1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州，510631；2.廣東省科學(xué)院動物研究所，廣東省動物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州，510260；3.廣西大桂山鱷蜥國家級自然保護(hù)區(qū)管理中心，賀州，542800）

鱷蜥（Shinisaurus crocodilurus）隸屬于爬行綱（Reptilia），有鱗目（Squamata），鱷蜥科（Shinisauri?dae），鱷蜥屬（Shinisaurus），是國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生動物，世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）瀕危（EN）物種［1］，CITES 附錄Ⅰ物種［2］，主要分布在我國廣東、廣西和越南東北部廣寧省安圖自然保護(hù)區(qū)［3］。為了促進(jìn)鱷蜥種群數(shù)量復(fù)壯，人工救護(hù)繁育成為保護(hù)鱷蜥的重要措施，并取得了較好的效果［4］。但有研究表明，由于環(huán)境的限制，人工繁育的鱷蜥常會受到一些疾病的侵襲，導(dǎo)致鱷蜥死亡［5］，這些疾病主要包括因感染龜嗜皮菌（Austwickia chelonae）造成的皮膚肉芽腫?。?］，感染銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）造成的皮膚潰瘍?。?］等。

檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和摩氏摩根菌屬（Morganella）細(xì)菌廣泛存在于水、土壤等自然環(huán)境以及動物的腸道中，為常見的條件致病菌和人獸共患病原菌，易造成動物腹瀉、繼發(fā)感染等疾病。近年來，已有許多關(guān)于檸檬酸桿菌屬感染動物的報道，如弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）可引起加州鱸（Micropterus salmoides）［8］、牛 蛙（Rana catesbeiana）［9］和巴西龜（Trachemys scripta elegans）［10］等水生動物體表局部充血、出血和潰爛等癥狀。布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）可引起菌血癥［11］。葡萄牙檸檬酸桿菌（C.portucalensis）可導(dǎo)致星點(diǎn)水龜（Clem?mys guttata）精神狀態(tài)差、食欲減退和眼睛炎癥等［12］。摩氏摩根菌（Morganella morganii）可感染水生動物，主要癥狀表現(xiàn)為患病動物食欲不振、甚至廢絕，精神狀態(tài)差，體表皮膚潰爛和出血等，如黃喉擬水龜（Mauremys mutica）感染該菌后會行動遲緩、食欲廢絕、爪脫落和頭肢部潰爛等［13］，中國大鯢 （Andrias davidianus）感染后表現(xiàn)為拒食、行動遲緩和體表有出血點(diǎn)等［14］，胡子鯰（Clarias fuscus）感染后表現(xiàn)為體表有大量黏液、腹部腫大和肛門紅腫等［15］。

2021 年7 月，在廣西大桂山鱷蜥國家級自然保護(hù)區(qū)北婁管理站發(fā)現(xiàn)一些鱷蜥發(fā)生嚴(yán)重感染并有零星死亡。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)、分子生物學(xué)方法和藥敏試驗(yàn)，并結(jié)合多位點(diǎn)序列分型（multilo?cus sequence typing，MLST）方法探究鱷蜥感染的病原，旨在為鱷蜥細(xì)菌性疾病的預(yù)防控制提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

廣西大桂山鱷蜥國家級自然保護(hù)區(qū)北婁管理站救護(hù)繁育的鱷蜥于2021年7月發(fā)生細(xì)菌性感染疾病，導(dǎo)致零星死亡。鱷蜥生前的臨床表現(xiàn)為四肢無力，行動遲緩、甚至停滯，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，食欲不振。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病原菌分離與培養(yǎng)

將鱷蜥尸體無菌解剖，取肺和肝組織劃線接種于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上，倒置在恒溫生化培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)18～24 h 后，挑選形狀一致的優(yōu)勢菌落純化，直至獲得形態(tài)大小一致的純菌落。挑取純菌在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中28 ℃培養(yǎng)12～16 h，加終濃度為20%的甘油，置于冰箱中?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)和生理生化鑒定

將在超低溫冰箱中保存的菌株活化后，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落的形狀、邊緣、隆起形狀和透明度等表型特征。

對分離純化后的菌株分別進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢。取菌株分別接種于腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管（購自杭州微生物試劑有限公司）中，按照說明書操作，并對結(jié)果進(jìn)行初步判定。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

使用16SrRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為25.0 μL：正、反引物各1.0 μL，PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保溫。同時，使用無菌水作為陰性對照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序后分離菌株的16S rRNA 基因序列通過BLAST 程序比對，并通過MEGA 11.0.11 軟件對序列進(jìn)行分析及構(gòu)建進(jìn)化樹。根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，初步判定感染鱷蜥的是檸檬酸桿菌屬和摩氏摩根菌屬細(xì)菌，因此依據(jù)這2 個菌屬開展后續(xù)研究。

recN基因（編碼DNA 修復(fù)蛋白）作為檸檬酸桿菌屬的特異標(biāo)志之一，可以用來準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定檸檬酸桿菌屬的各個菌種［16］。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載檸檬酸桿菌屬的14種recN基因序列，經(jīng)比對后，設(shè)計引物recN-F（5′-ATTGCVATTGATGCKCTCGG-3′ ），recN-R（5′-AAATCCAGACGATCGCAATA-3′）對分離菌株進(jìn)行recN基因的PCR 擴(kuò)增和鑒定。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，通過MEGA 11.0.11軟件對序列進(jìn)行分析及構(gòu)建進(jìn)化樹。

使用HiPure Stool DNA Mini Kit 糞便DNA小提試劑盒（上海邁跟生物科技有限公司）提取鱷蜥 腸道內(nèi)容物的DNA，選取摩氏摩根菌特異性引物Mm208F（5′-CTCGCACCATCAGATGAACCCATAT-3′），Mm1017R（5′-CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG-3′）［17］以及檸檬酸桿菌屬特異引物recN-F和recN-R 對鱷蜥的腸道內(nèi)容物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.3 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散（K-B）法對分離菌株進(jìn)行12種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［18］判定菌株對抗生素的敏感性。

2.4 多位點(diǎn)序列分型（MLST）

為探究分離菌株的變異情況，按照檸檬酸桿菌屬多位點(diǎn)序列分型方案（https：//pubmlst.org/organ?isms/citrobacter-spp），參考Bai等［19］的研究方法，擴(kuò)增7 個管家基因（aspC、clpX、fadD、mdh、arcA、dnaG和lysP）后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

將分離菌株的7 個管家基因序列分別上傳至檸檬酸桿菌屬多位點(diǎn)序列分型數(shù)據(jù)庫，并與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對，分析各等位基因位點(diǎn)的變化情況，形成等位基因譜。選取同源性較高的序列拼接后使用MEGA 11.0.11 軟件中的neighbor-joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

鱷蜥尸體解剖后見肺充血、腫大，肝腫大，腸壁變薄，腸內(nèi)脹氣、腫大，腹部含有腹水（圖1）。

圖1 鱷蜥剖檢結(jié)果Fig.1 Results of necropsy of Shinisaurus crocodilurus

3.2 菌株分離培養(yǎng)與鑒定

從鱷蜥尸體的肺和肝中各分離得到1 株細(xì)菌，分別命名為BL1682F 和BL1682G。兩個分離菌株在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好。BL1682F 呈圓形，中間隆起、表面光滑、半透明、邊緣整齊；BL1682G 呈圓形、中間凸起、表面光滑、濕潤。革蘭氏染色結(jié)果均為陰性，桿狀（圖2）。

圖2 分離菌株的革蘭氏染色形態(tài)Fig.2 Gram staining morphology of isolated strains

分離菌株的氧化酶試驗(yàn)均為陰性，生化鑒定結(jié)果見表1，查閱產(chǎn)品編碼檢索表，參考《簡明第八版伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［20］，初步判斷BL1682F為檸檬酸桿菌屬細(xì)菌，BL1682G為摩氏摩根菌屬細(xì)菌。

表1 分離菌株的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical properties of isolated strains

3.3 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

BL1682F的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中葡萄牙檸檬酸桿菌P10159（CP012554）和弗氏檸檬酸桿菌EnZ-4（MN220573）的一致性均為100.00%，與楊氏檸檬酸桿菌（Citrobacter youngae）L6（CP021963）和布氏檸檬酸桿菌PS 70（KP969055）的一致性均為99.93%；BL1682G 的16S rRNA 基因序列與摩氏摩根菌DG56-16（CP032295）的一致性為99.86%（圖3）。結(jié)合16S rRNA 系統(tǒng)進(jìn)化分析進(jìn)一步判定BL1682F 為檸檬酸桿菌屬，BL1682G 為摩氏摩根菌屬。

圖3 基于16S rRNA基因序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Neighbor-joining（NJ）tree based on 16S rRNA gene sequences

為進(jìn)一步確定BL1682F 在檸檬酸桿菌屬中的分類，將BL1682F的recN基因序列與檸檬酸桿菌屬其他的recN基因序列進(jìn)行比較（表2），發(fā)現(xiàn)該菌與葡萄牙檸檬酸桿菌之間的相似性最高，為99.6%，其次是弗氏檸檬酸桿菌，為93.0%。利用recN基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），發(fā)現(xiàn)BL1682F 與葡萄牙檸檬酸桿菌最接近，這與表2 的結(jié)果類似。以上結(jié)果說明，分離得到的BL1682F 為葡萄牙檸檬酸桿菌。

表2 檸檬酸桿菌屬不同細(xì)菌菌種中的recN相似性比較Tab.2 The comparison of recN gene similarity in different species of bacteria of the genus Citrobacter spp.

圖4 基于recN基因序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Neighbor-joining（NJ）tree based on recN gene sequences

腸道內(nèi)容物PCR 擴(kuò)增后的電泳結(jié)果表明，2種細(xì)菌的條帶大小正確，與陽性樣本一致（圖5），結(jié)果證實(shí)了死亡鱷蜥腸道內(nèi)容物中也存在葡萄牙檸檬酸桿菌和摩氏摩根菌。

圖5 患病鱷蜥腸道內(nèi)容物中摩氏摩根菌和葡萄牙檸檬酸桿菌的檢測結(jié)果Fig.5 Detection of Morganella morganii and Citrobacter portucalensis in the intestinal contents of Shinisaurus crocodilurus

3.4 分離菌株的藥敏分析

依據(jù)CLSI 藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)鑒定手冊［18］，對2 個分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明：分離菌株BL1682F 對慶大霉素、阿米卡星、頭孢呋辛、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、磺胺甲唑、氨曲南和四環(huán)素敏感，對氨芐西林耐藥；分離菌株BL1682G對慶大霉素、哌拉西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、磺胺甲唑和氨曲南敏感，對頭孢呋辛和四環(huán)素耐藥（表3）。

表3 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of drug sensitivity tests of isolated strains

3.5 分離菌株BL1682F 的MLST 分型結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

將分離菌株BL1682F 的7 個管家基因序列上傳至檸檬酸桿菌多位點(diǎn)序列分型數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示分離菌株未完全匹配數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)菌株。根據(jù)比對結(jié)果，選取同源性較高的11 株檸檬酸桿菌構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，與BL1682F 親緣關(guān)系最近的是ST-4 和ST-267，其次是ST-260（圖6），均有3個等位基因數(shù)值匹配，而BL1682F 與其他8 株ST 型僅有2個等位基因數(shù)值匹配（表4）。

表4 BL1682F與標(biāo)準(zhǔn)菌株的多位點(diǎn)序列分型Tab.4 Multi-site sequence typing of BL1682F and standard strains

圖6 BL1682F與標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸桿菌菌株序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of sequences of BL1682F and Citrobacter strains

4 討論

在細(xì)菌基因組中，16S rRNA 基因普遍存在，其功能穩(wěn)定，且高度保守，不易發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移，已成為細(xì)菌分類鑒定的重要分子標(biāo)記［21］。毛爍君等［22］在患病中華鱉（Pelodiscus sinensis）的肝和腹水中分離到1 株細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA 測序鑒定為弗氏檸檬酸桿菌。楊星等［23］通過16S rRNA 基因測序，在患病瀕死大鯢肝中分離到1 株細(xì)菌，最終鑒定為類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）。本研究中，從死亡鱷蜥肝中分離得到的菌株BL1682G，經(jīng)16S rRNA 測序鑒定為摩氏摩根菌。然而，16S rRNA 測序方法在區(qū)分多態(tài)性和相似性較高的菌種時具有一定的局限性。檸檬酸桿菌屬細(xì)菌的16S rRNA 基因序列具有很強(qiáng)的多態(tài)性，因此僅用16S rRNA 基因來鑒定檸檬酸桿菌屬具體菌種的目標(biāo)是不準(zhǔn)確的。在本研究中，使用16S rRNA 對鱷蜥肺中分離的BL1682F 菌株擴(kuò)增，經(jīng)BLAST比對，發(fā)現(xiàn)與GenBank數(shù)據(jù)庫中檸檬酸桿菌屬中的弗氏檸檬酸桿菌、布氏檸檬酸桿菌和葡萄牙檸檬酸桿菌等均具有很高的相似性。有研究表明，檸檬酸桿菌屬的各個菌種可由recN基因準(zhǔn)確區(qū)分［16］。因此，本研究采用16S rRNA和recN基因來共同鑒定分離菌株，結(jié)果表明，從鱷蜥肺中分離的BL1682F菌株為葡萄牙檸檬酸桿菌。

為了確定有效的抗生素，對鱷蜥肺中分離的葡萄牙檸檬酸桿菌進(jìn)行藥物敏感性測試，結(jié)果顯示葡萄牙檸檬酸桿菌對慶大霉素、阿米卡星、頭孢呋辛、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、磺胺甲唑、氨曲南和四環(huán)素敏感，對氨芐西林耐藥。而在星點(diǎn)水龜體內(nèi)分離出的葡萄牙檸檬酸桿菌具有廣泛的耐藥型，其對慶大霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、卡那霉素、鏈霉素、妥布霉素、新生霉素、紅霉素和青霉素表現(xiàn)出耐藥，對新霉素表現(xiàn)為敏感［12］。此外，鱷蜥肝中分離的摩氏摩根菌對慶大霉素、哌拉西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、磺胺甲唑和氨曲南敏感，對頭孢呋辛和四環(huán)素耐藥。李瑞偉等［14］研究發(fā)現(xiàn)，從患病大鯢肝中分離到的摩氏摩根菌對哌拉西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南和四環(huán)素敏感，對頭孢呋辛和氨芐西林耐藥。尹夢雅［24］從患病中華鱉體內(nèi)分離到的摩氏摩根菌對頭孢曲松敏感，對慶大霉素、四環(huán)素、亞胺培南、環(huán)丙沙星和氨芐西林耐藥。以上結(jié)果表明，對于同一種細(xì)菌，不同來源菌株的藥物敏感性結(jié)果產(chǎn)生的差異，可能與環(huán)境因素和菌株本身有關(guān)。從鱷蜥肺和肝中分別分離的葡萄牙檸檬酸桿菌和摩氏摩根菌對抗生素不存在較強(qiáng)的耐藥性，表明鱷蜥目前的生存環(huán)境受抗生素污染的可能性較小。

多位點(diǎn)序列分型是一種基于比較分離菌株與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株管家基因的核酸序列來測定分離菌株基因型的方法，該方法已廣泛用于細(xì)菌的分子流行病學(xué)研究［25］。本研究結(jié)果表明，從鱷蜥肺中分離的葡萄牙檸檬酸桿菌BL1682F 為新的序列型（ST），管家基因發(fā)生了變異，此管家基因序列與MLST 數(shù)據(jù)庫中不存在相應(yīng)的等位基因編號。因此，證明BL1682F 為新型菌株，目前無法從現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中找到其流行病學(xué)規(guī)律。為了深入探究葡萄牙檸檬酸桿菌的遺傳進(jìn)化規(guī)律和跨物種間的致病機(jī)理，后續(xù)研究應(yīng)對不同來源動物的葡萄牙檸檬酸桿菌進(jìn)行耐藥及毒力等相關(guān)特殊基因型匯總分析。