陶芬，張饒，廖琦，李芬仙，劉壘成，姜玉莎，苗睿，吳培福

（1.西南林業(yè)大學生命科學學院，昆明，650224；2.云南野生動物園，昆明，650225）

在過去的幾十年里，抗生素廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的疾病預防、治療與促進生長，隨著經(jīng)濟和社會的進步，人們對抗生素的耐藥性也越來越重視。細菌耐藥性的傳播在很大程度上是由水平基因轉(zhuǎn)移引起的，耐藥基因常通過某些遺傳元件（如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子）傳遞。整合子能夠捕獲并表達外源基因，可將耐藥基因整合到移動元件中，在耐藥基因的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，是衡量耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的一項重要指標。抗生素的使用對人和動物腸道微生物群的組成有很大影響，越來越多的學者［1?2］關(guān)注腸道微生物群這一天然的耐藥基因庫、水平基因轉(zhuǎn)移樞紐［3］，為細菌耐藥性的發(fā)展提供了一個良好的平臺，故腸道菌群中整合子及基因盒攜帶情況的分析在水平基因轉(zhuǎn)移中具有重大意義。

藍孔雀（Pavo cristatus）是一種極具觀賞性的鳥類，目前國內(nèi)關(guān)于藍孔雀疾病的研究主要集中在寄生蟲方面，包括球蟲?。??5］、絳蟲病、線蟲病和組織滴蟲?。?］，尚未見關(guān)于藍孔雀整合子、基因盒的相關(guān)分析報道。動物園作為科普宣傳基地，具有物種繁多、人員復雜和流動性大等特點，其細菌耐藥性的防控對公共衛(wèi)生安全具有重大意義。本研究以動物園藍孔雀糞便為材料，提取菌群基因組DNA，檢測臨床分離株中常見整合子、基因盒的流行情況，并對其進行水平轉(zhuǎn)移分析，以期為細菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移研究和藍孔雀疾病防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

以昆明市2 個動物園的藍孔雀糞便為研究樣品，其中1～120 號采集于云南野生動物園（相應(yīng)的基因盒編號為H1～H120），121～139 號采集于圓通山動物園，共計139 份樣品。樣品采集原則：（1）被采樣藍孔雀近期未使用抗生素。（2）在早晨清理藍孔雀糞便前采集新鮮糞便，保證樣品無明顯的雜質(zhì)污染。（3）盡量無菌采集，用高壓滅菌的50 mL 離心管收集樣品，1 個樣品裝1 個離心管。（4）原則上采集不同藍孔雀個體糞便，但動物園藍孔雀為散養(yǎng)模式，無法做到糞便與個體的統(tǒng)一定位，故采用分散樣地采樣法，即在藍孔雀活動的不同區(qū)域內(nèi)采集，在一定程度上避免同一個體重復采樣。（5）采集成形的、代表藍孔雀個體的糞便，不采集混合糞便。（6）樣品采集后即時送回實驗室，?20 ℃保存?zhèn)溆?。在同一時間段采集2 個動物園的藍孔雀糞便樣品，在采樣期間，由于圓通山動物園中游客量較大，導致藍孔雀糞便被反復踩踏，且數(shù)量較少，遵循采樣原則，僅采集到19 份樣品。

1.2 宏基因組提取

參考已有研究方法［7?9］，采用蛋白酶K-CTAB-酚氯仿法提取樣品中菌群宏基因組DNA。提取過程：用丙酮、PBS 緩沖液預處理樣品，采用差速離心法去除樣品中的雜質(zhì)，吸取懸浮液，離心后收集沉淀，用蛋白酶K 和溶菌酶消化細菌，最后采用酚氯仿法純化DNA。

1.3 整合子檢測

引物參考Su等［10］研究，由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）?？偡磻?yīng)體系25.0 μL，其中上 游引物（10 μmol/L）1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，Taq酶1.0 μL，10×TaqBuffer 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，牛血清白蛋白（BSA）0.1 μL，ddH2O 為15.4 μL。3 類整合子（I類、Ⅱ類和Ⅲ類，即intI1、intI2和intI3）反應(yīng)程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸6 min。Ⅰ類整合子基因盒擴增反應(yīng)程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸6 min。配置1%瓊脂糖凝膠，吸取5 μL PCR 產(chǎn)物加入凝膠孔內(nèi)，在電泳儀（120 V）上電泳30 min。觀察PCR 產(chǎn)物大小，統(tǒng)計擴增結(jié)果。

表1 用于擴增3類整合子的引物Tab.1 The primers used in amplifying three types of integrons

1.4 PCR產(chǎn)物測序分析

根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小，分別選取整合子及基因盒的PCR 產(chǎn)物，送往上海捷瑞生物工程有限公司測序，每類整合子各選取2 個樣本PCR 產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ類和Ⅲ類攜帶的基因盒較少，且有的基因盒較大，普通實驗條件無法擴增，Ⅰ類整合子基因盒有多種不同大小的PCR 擴增片段，最小片段約為400 bp，最大片段約為2 900 bp，考慮到蛋白編碼基因和耐藥基因的平均大小，僅研究750 bp及以上的擴增片段，并對電泳中較亮的片段進行測序。小片段可能為空整合子，空整合子一般不攜帶耐藥基因，但存在再次整合可移動耐藥基因的可能性。

下載NCBI 數(shù)據(jù)庫中的細菌基因組數(shù)據(jù)及其注釋，比對所測序列和數(shù)據(jù)庫細菌基因組，找出含95%以上相似性片段的細菌基因組，查看相似片段上、下游5 kb側(cè)翼區(qū)序列，如有整合酶/重組酶、轉(zhuǎn)座子等關(guān)鍵基因，則可認為該基因盒具有水平轉(zhuǎn)移的可能性。

1.5 統(tǒng)計與分析

用Excel 2016 整理和統(tǒng)計數(shù)據(jù)，Chromas 軟件查看測序結(jié)果。仔細比對上、下游引物，選取測序結(jié)果一致的序列片段，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST程序搜索分析測序片段的同源性，并用Excel 2016、AI 軟件和R軟件包進行相應(yīng)的繪圖分析。

2 結(jié)果

2.1 整合子流行特征

所有樣品中，intI1、intI2和intI3檢出率分別為86.33%、69.78%和11.51%。圖1 展示了云南野生動物園和圓通山動物園樣品中整合子流行分布特征，intI1和intI2具有相似的分布特征，而intI3在2個動物園間存在差異（圓通山動物園樣品中未發(fā)現(xiàn)intI3）。

圖1 3類整合子的分布特征Fig.1 The distribution patterns of three types of integrons

2.2 樣品基因盒擴增特征

從樣品中擴增出不同大小或類別的Ⅰ類整合子基因盒條帶，考慮到基因平均大小，只統(tǒng)計750 bp以上的條帶類型（其余小片段見表2）。擴增的條帶共有18種，片段大小為750～2 900 bp。每個樣品的擴增條帶數(shù)共有7種類型（圖2 左上角），共發(fā)現(xiàn)51種不同大小條帶的組合模式（圖2）。從樣品來源看，云南野生動物園與圓通山動物園樣品基因盒擴增模式無明顯區(qū)別，即圓通山動物園樣品組合模式分散于云南野生動物園的樣品中，但2 條最大擴增條帶 2 900 bp均來自圓通山動物園的樣品中。

表2 Ⅰ類整合子小片段基因盒統(tǒng)計Tab.2 Statistics of integron Ⅰ small fragment gene cassettes

圖2 樣品基因盒的擴增模式Fig.2 The PCR patterns of sample integrons

2.3 Ⅰ類整合子基因盒測序結(jié)果

從Ⅰ類整合子基因盒的擴增結(jié)果中隨機選取條帶較亮且引物二聚體較少的樣品（均為云南野生動物園），即7 個基因盒樣品（H12、H16、H22、H26、H27、H56、H78）進行測序，其中H12和H22樣品基因盒為aadA2基因，H16 和H56 樣品基因盒為aadA1基因，H26 和H27 樣品基因盒為dfrA27基因，H78 樣品基因盒結(jié)構(gòu)分析表明，該基因盒包含aadA2閱讀框、移碼突變的截短基因aac（6'）-Ib片段和arr閱讀框，其中aadA2閱讀框具有與H22一致結(jié)構(gòu)。

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中，序列對比發(fā)現(xiàn)，各基因盒序列與腸桿菌科（Enterobacteraceae）的多種細菌質(zhì)粒和染色體上序列片段有很高的同源性，如大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）等，這些菌株來自不同的動物宿主、國家與分離樣品。部分基因盒相似序列具有共同的菌株來源，H12、H16 和H56 樣品基因盒具有相似序列，H22 和H78、H26和H27具有相似序列（表3）。

表3 各基因盒的共同相似序列（NCBI比對）Tab.3 The common similarity sequence of each gene cassette（NCBI alignment）

2.4 基因盒水平轉(zhuǎn)移相關(guān)性

雖然在基因盒測序結(jié)果中對序列相似性進行了BLAST 比對分析，并在一定程度上反映了樣品基因盒在不同環(huán)境、菌種、宿主和國家的分布廣泛性，即整合子基因盒會在不同環(huán)境、菌種、宿主和國家間發(fā)生傳播，但上述分析結(jié)果只展示了部分情況，不能在所有菌門、屬或種的水平上反映基因盒分布偏向性或水平轉(zhuǎn)移宿主偏向性，也不能反映基因盒在不同宿主、環(huán)境和國家分布偏向性。耐藥基因傳播有垂直傳播和水平傳播，水平傳播對人和動物的健康會造成巨大危害，故本研究從染色體基因組、質(zhì)粒、噬菌體和微生物組角度來分析樣品基因盒與水平轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

2.4.1 基于染色體、質(zhì)?；蚪M的相關(guān)性

利用染色體、質(zhì)?；蚪M數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)分析，其中染色體基因組有95 175 個，質(zhì)?；蚪M有 34 678 個，經(jīng)比對分析發(fā)現(xiàn)，與H16 和H56 基因盒（aadA1）、H12 和H22 基因盒（aadA2）相似性較高的序列片段主要源自變形菌門（Proteobacteria）（占絕大多數(shù)）、藍細菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Acti?nobacteria），但aadA1、aadA2水平轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在變形菌 門中；與H26 和H27基因盒（dfrA27）、H78（aadA2、aac（6'）-Ib、arr）相似性較高的序列片段主要源自變形菌門和放線菌門，且該基因水平轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在變形菌門的細菌間，也見于放線菌門的細菌間。由此可見，7個基因盒的水平轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在變形菌門的細菌中，且具有共同的菌株來源（圖3），其中銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏桿菌、腸沙門氏菌（Salmonella enterica）與所有基因盒間均存在水平轉(zhuǎn)移相關(guān)性，說明了藍孔雀腸道菌群中耐藥基因主要由這幾類細菌傳播。

圖3 基因盒與染色體、質(zhì)?；蚪M的水平轉(zhuǎn)移相關(guān)性Fig.3 Correlation analysis of horizontal transfer of gene cassette in chromosome and plasmid genome

2.4.2 基于微生物、臨床基因組的相關(guān)性

在整合微生物基因組數(shù)據(jù)庫中記錄有154 974個宏基因組數(shù)據(jù)，經(jīng)比對分析發(fā)現(xiàn)，與環(huán)境和工程相關(guān)的環(huán)境中，共篩選到120 個宏基因組數(shù)據(jù)；臨床基因組中，共篩選到192 株具有明顯臨床分離株標注特征的基因組數(shù)據(jù)。由表4 可知，即使是不同來源（環(huán)境、臨床）的樣品（基于NCBI 比對）均可進行耐藥基因的傳遞，說明耐藥基因的跨界傳播；在不同宿主細菌中肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏桿菌、腸沙門氏菌和銅綠假單胞菌是各基因組中傳遞耐藥性的主要細菌，充分說明了這些細菌在水平基因轉(zhuǎn)移中的重要性。

表4 基于環(huán)境基因組與臨床基因組的水平轉(zhuǎn)移相關(guān)性Tab.4 Horizontal transfer correlation analysis based on environmental genome and clinical genome

2.4.3 基于噬菌體基因組的相關(guān)性

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中，病毒基因組共有11 545 個，其中涉及細菌的噬菌體基因組有4 183個。同上，下載病毒基因組數(shù)據(jù)，并與測序序列比對，但噬菌體基因組中沒有與本研究序列相似的片段，說明基因盒基因的水平傳播主要借助質(zhì)粒、整合子和插入元件等可移動元件。

3 討論

3.1 整合子及基因盒流行特征

本研 究中，intI1、intI2和intI3檢出率 分別為86.33%、69.78% 和11.51%，均與各基因流行情況［11］保持一致，但又有所不同。馮濤［12］在狐源大腸桿菌分離株中得到的intI1和intI2檢出率分別為62.77%和13.56%，intI3未檢出；王東陽等［13］對貉源大腸桿菌整合子進行檢測，發(fā)現(xiàn)intI1檢出率為72.00%，intI2為9.33%，未檢出intI3，而本研究中3類整合子基因檢出率都較高。在大部分研究中，Ⅱ類整合子常攜帶dfrA1、sat2和aadA1，與Ⅰ類整合子相似；Ⅲ類整合子常攜帶β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類耐藥基因，但該型整合子較為少見［14］。本試驗中Ⅱ、Ⅲ類整合子都存在較高的檢出率，一方面說明宏基因組DNA 中檢出率高于單菌株，另一方面說明動物園中藍孔雀種群存在較高耐藥性及耐藥基因轉(zhuǎn)移可能性。

Ⅰ類整合子是廣泛分布于臨床和環(huán)境中的細菌遺傳元件，尤其在革蘭氏陰性菌中［15］，細菌的耐藥譜主要受其影響［16?17］，故研究檢測了其攜帶的基因盒。結(jié)果顯示基因盒主要為氨基糖苷類和甲氧芐啶類耐藥基因，這2 類基因盒常在分離株中被檢測到［18］。Ⅰ類整合子基因盒組合形式有較高的多樣性［19?20］，在本研究中主要表現(xiàn)為不同長度條帶組合的多種譜型，組合形式共計51種，反應(yīng)了藍孔雀種群潛在多重耐藥的復雜性。

3.2 樣品基因盒結(jié)構(gòu)特征及水平轉(zhuǎn)移特性

本研究中，基因盒的測序分析發(fā)現(xiàn)7 個樣品均攜帶與水平轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，且具有完整的基因結(jié)構(gòu)（兩端保守區(qū)域及中間可變區(qū)），因此，這些基因盒具有水平轉(zhuǎn)移的可能性。目前，有研究表征細菌中Ⅰ類整合子攜帶基因盒進行水平轉(zhuǎn)移的過程，如陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、沙門氏菌和大腸埃希氏桿菌［11，21?22］，Yu等［11］研究中表征了Ⅰ類整合子攜帶不同類別的基因盒，并驗證了其接合轉(zhuǎn)移的能力，進一步說明了本研究中基因盒水平轉(zhuǎn)移特性，且這些基因水平轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在變形菌門中，這與大多數(shù)研究結(jié)果保持一致，如Zhao等［23］研究顯示CTX-M等位基因通過水平轉(zhuǎn)移在臨床大腸埃希氏桿菌和克雷伯氏菌中廣泛傳播，Zheng等［24］將臨床分離株中具ESBL基因（blaOXA-48、blaNDM-1、blaKPC-2和blaSHV-1）的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)移到實驗室大腸埃希氏桿菌中。

在不同基因組數(shù)據(jù)中，7個樣品基因盒具有相似（>95%）的來源，包括宿主、菌種、分離株和國家，說明耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的普遍性及全球性，這些片段均具備水平基因轉(zhuǎn)移特征（具整合酶、完整的基因結(jié)構(gòu)等），基因盒可在動物、人與環(huán)境之間傳播，與霍瑋［25］的研究結(jié)果保持一致，霍瑋在動物園靈長類（Primates）動物活動區(qū)域與飼養(yǎng)員體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了攜帶mcr-1基因的大腸埃希氏桿菌分離株（但未證實來源是飼養(yǎng)員還是環(huán)境）。另外，基因盒相似片段的來源覆蓋世界各地，耐藥基因水平轉(zhuǎn)移具全球性［26］，基因盒主要通過質(zhì)粒傳播，耐藥性轉(zhuǎn)移具廣泛性，其宿主細菌主要有肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏桿菌、腸沙門氏菌和銅綠假單胞菌等，這些細菌也是臨床檢測中出現(xiàn)最多的病原菌，表明這些細菌是耐藥基因的重要來源。

3.3 腸道菌群中宏基因組DNA研究

試驗通常通過培養(yǎng)的方法擴增單菌株中的耐藥基因，然而約有80%腸道微生物是無法培養(yǎng)的。本研究方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，具有更高的檢測靈敏度，可檢測到更多非活菌中的耐藥基因，故直接采用PCR 檢測，結(jié)果會比培養(yǎng)之后的檢出率更高，這在本研究Ⅱ類、Ⅲ類整合子檢出率上得到體現(xiàn)。

綜上，Ⅰ類整合子流行性較高，攜帶有不同大小條帶的基因盒，并具水平轉(zhuǎn)移能力，動物腸道中有密集的微生物群，發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移的可能性比預期還會更高，說明耐藥基因傳播的高風險性。此外，外界環(huán)境在耐藥基因的發(fā)展和傳播中起很大作用［27］，本研究中，與樣品序列相似性高的來源也包括環(huán)境，環(huán)境是耐藥基因的一個重要儲存場所。