史倍寧，趙耀，林子涵，田佳欣，孫嘉，馬雅雯，劉振生，2，滕麗微，2

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.國家林業(yè)和草原局野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱，150040）

腸道菌群廣泛存在于動(dòng)物腸道內(nèi)，與宿主具有良好的共生關(guān)系［1］，在動(dòng)物營養(yǎng)吸收、組織發(fā)育和免疫功能等方面起著許多關(guān)鍵作用。動(dòng)物能在充滿挑戰(zhàn)的自然環(huán)境下存活主要受其體內(nèi)或體表微生物群落（尤其是腸道菌群）的影響［2］。腸道菌群失調(diào)會(huì)影響動(dòng)物的膽汁酸、膽固醇代謝，與膽結(jié)石的形成密切相關(guān)［3］，因此維持動(dòng)物體內(nèi)腸道菌群平衡至關(guān)重要。腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性與多種因素有關(guān)，如環(huán)境［4］、季節(jié)［5］、食性［6］和性別［7?8］等。不同性別的同一物種由于分泌的性激素存在差異，會(huì)對(duì)腸道菌群的構(gòu)成和豐度造成影響［9］，如林麝（Moschus berezovskii）不同性別間腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，與不同生長階段的免疫抵抗力變化有關(guān)［10］；阿拉善馬鹿（Cervus elaphus alashanicus）冬季腸道菌群組成受性別影響，與雌、雄阿拉善馬鹿食性不同有關(guān)［11］；不同性別大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）腸道菌群多樣性及其群落結(jié)構(gòu)組成主要受飲食結(jié)構(gòu)影響［12］；短期高脂飲食對(duì)不同性別小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)存在影響，可能與不同性激素與腸道菌群的相互作用有關(guān)［13］。因此，在相同圈養(yǎng)環(huán)境下，性別對(duì)梅花鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的影響可能與多種因素有關(guān)。

梅花鹿（Cervus nippon）是東北亞季風(fēng)區(qū)特產(chǎn)的一種珍貴藥用動(dòng)物，分布較廣，我國歷史上曾存在 6 個(gè)亞種［14?15］，包括山西亞種（C.n.grassianus）、華北亞種（C.n.mandarinus）、臺(tái)灣亞種（C.n.taiouanus）、東北亞種（C.n.hortulorum）、華東亞種（C.n.kopschi）和四川亞種（C.n.sichuanicus），但對(duì)于其中部分種群是否存在還有爭議。目前，國內(nèi)對(duì)梅花鹿的研究范圍較廣，包括食性［16］、行為［17］、棲息地選擇［18］和遺傳多樣性［19］等，但關(guān)于性別對(duì)圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群影響的研究尚未見報(bào)道。本研究利用16S rRNA 高通量測序技術(shù)，探究不同性別間圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群的結(jié)構(gòu)、多樣性以及差異，旨在為圈養(yǎng)梅花鹿的營養(yǎng)代謝和免疫機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，提高其遷地保護(hù)的存活率。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020 年7 月，在銀川市中山公園采集常規(guī)飼養(yǎng)、飼料日糧（玉米、苜蓿草等）組成相同和無抗生素等藥物治療的10 只（6、4♀）健康梅花鹿個(gè)體糞便（表1）。在采樣前1 d晚上清理籠舍，于次日早晨投喂飼料前收集粒狀、新鮮且相對(duì)完整的糞便。采集過程中為防止交叉污染，每采集1 個(gè)糞便樣本換1 副PE手套。采樣后立刻將糞便冷凍，或提前準(zhǔn)備冰袋暫時(shí)保存，到實(shí)驗(yàn)室后再冷凍保存。

表1 梅花鹿糞便樣品信息Tab.1 Information on fecal samples of sika deer

1.2 樣品處理

按照E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒（Omega，USA）說明書提取雄、雌樣品的總DNA，然后用Qubit 3.0 DNA 檢測試劑盒（Life，USA）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 濃度和質(zhì)量。依據(jù)16S rRNA V3—V4 區(qū)通用引物（341F：5′-ATGCGTAGCCGACCTGAGA-3′；805R：5′-CGTCAGACTTTCGTCCATTGC-3′）對(duì)樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系和參數(shù)按照Du等［20］方法。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，選用0.6 倍的磁珠對(duì)其純化吸收。使用Qubit 3.0 DNA 檢測試劑盒測定回收的DNA 濃度，將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物按1∶1 等量混合。處理后的樣品在Illumina MiSeq PE300 平臺(tái)上測序。

1.3 高通量測序

通過堿基識(shí)別分析，將得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)化為原始測序序列，以FASTQ 文件格式存 儲(chǔ)，結(jié)果包括測序序列的序列信息以及對(duì)應(yīng)的測序質(zhì)量信息。使用Cutadapt（v 1.18）去除引物接頭序列，再根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，使用PEAR（v 0.9.8）將成對(duì)的reads 拼接成一條序列。利用Usearch（v 11.0.667）軟件，提取各樣本優(yōu)化序列 中的非重復(fù)序列（不含單序列），聚類分配成操作 分類單元（OTU）。使用RDP classifier（v 2.12）并比對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫（http：//rdp.cme.msu.edu/misc/ resources.jsp），得到每個(gè)OTU 在不同分類水上的 物種信息?；诰垲惤Y(jié)果，使用R（v3.6.0）中的VennDiagram（v1.6.20）包計(jì)算繪制物種分布Venn圖，以此統(tǒng)計(jì)雄、雌樣本中共有和獨(dú)有的OTU 數(shù)目；同時(shí)，利用ggplot2 包繪制相對(duì)豐度柱狀圖，直 觀掌握圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群構(gòu)成及相對(duì)豐度含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Mothur（v 3.8.31）計(jì)算樣本組內(nèi)α多樣性指數(shù)，包括Simpson、Chao1、Ace、Shannon 和Coverage指數(shù)，運(yùn)用t檢驗(yàn)檢測2 組樣品在α多樣性上的差異性。利用Mothur做rarefaction 分析，通過R 軟件繪制稀釋性曲線，判斷本次測序結(jié)果能否代表樣品真實(shí)情況。使用R 軟件中的vegan 包，在門、屬水平上對(duì)雄、雌梅花鹿樣品組間進(jìn)行β多樣性分析，基于Bray-Curtis 距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）以及Adonis 分析，檢驗(yàn)不同性別梅花鹿腸道菌群組間的差異性。為了揭示受宿主性別影響較大的菌群，通過STAMP（v 2.1.3）確定不同性別梅花鹿腸道菌群間是否存在差異物種［21］，利用LEfSe（v 1.1.0）獲得雄、雌樣品中起重要作用的菌群。

2 結(jié)果

2.1 樣品測序

從10 只圈養(yǎng)健康梅花鹿糞便樣本中共得到有效序列853 271 條，樣本長度為352～475 bp，平均長度412 bp，以97% 相似水平聚類分析得到2421個(gè)OTUs，其中雄、雌性樣品共有1983個(gè)OTUs，雄性和雌性分別獨(dú)有298、140 個(gè)OTUs（圖1），表明圈養(yǎng)梅花鹿腸道中共有菌群普遍分布，但各性別也具有獨(dú)特的菌群。稀釋性曲線（圖2）和所有樣品的Coverage 指數(shù)均大于99.20%，說明本次測序結(jié)果能有效反映雄、雌樣品腸道菌群真實(shí)情況。

圖1 雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿OTUs韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTUs of male and female captive sika deer

圖2 雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿OTU數(shù)值（A）和Shannon指數(shù)（B）的稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curves of OTU number（A）and Shannon index（B）of male and female captive sika deer

2.2 腸道菌群構(gòu)成及相對(duì)豐度含量

基于OTUs 分類結(jié)果，共注釋到細(xì)菌27 門52綱79目154科282屬。2組樣品中相對(duì)豐度含量最高的3 個(gè)菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）（圖3A），其中，厚壁菌門（61.69%，♀58.23%）和擬桿菌門（27.40%，♀31.19%）相對(duì)豐度含量較高，兩者相對(duì)豐度含量之和超過85.00%，是10 只圈養(yǎng)梅花鹿樣品中的優(yōu)勢菌門，疣微菌門為第3 豐度菌門，在雄、雌樣品中分布比例相似（3.86%，♀3.75%）。雄性樣品中相對(duì)豐度含量較多的廣古菌門（Euryar?chaeota）在雌性樣品中略少（1.01%，♀0.58%），在相對(duì)豐度含量≤0.01%的candidate_division_WPS-1、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、脫鐵桿菌門（De?ferribacteres）和恐球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）4種菌門中，僅candidate_division_WPS-1是雌性圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群的獨(dú)有菌門，其余3種菌門為雄性獨(dú)有菌門。

在屬水平上，雄性圈養(yǎng)梅花鹿相對(duì)豐度最高的 5 個(gè)菌屬依次是擬桿菌屬（Bacteroides，4.60%）、梭菌屬（Clostridium_IV，3.42%）、Akkermansia（2.78%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus，1.78%）和普雷沃菌屬（Pre?votella，1.70%）；雌性圈養(yǎng)梅花鹿相對(duì)豐度含量最高的5 個(gè)菌屬依次是擬桿菌屬（6.13%）、梭菌屬（3.25%）、Akkermansia（3.18%）、普雷沃菌屬（2.18%）和瘤胃球菌屬（1.92%）（圖3B）。其他菌屬在不同性別中的相對(duì)豐度含量也有所差異。

圖3 圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群在門水平（A）和屬水平（B）的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of intestinal microbiota of captive sika deer at the phylum（A）and genus（B）levels

2.3 腸道菌群多樣性

通過α多樣性分析表明，雄性圈養(yǎng)梅花鹿的Simpson、Chao1 和Ace 值均高于雌性，Shannon 值低于雌性，說明雄性圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群豐富度高于雌性，但菌群多樣性低于雌性。通過分析雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿組內(nèi)多樣性指數(shù)，結(jié)果表明2 組樣品的Simp?son、Chao1、Ace 和Shannon值差異均不顯著（p>0.05）（表2），說明雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿樣品組內(nèi)不存在顯著性差異。

表2 雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群平均多樣性指數(shù)Tab.2 Mean diversity index of intestinal microbiota of male and female captive sika deer

圖4 顯示，雄、雌樣品間不具有明顯的分離現(xiàn)象，所有樣品間距離較近，表明不同性別的圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群組成相似度較高。Adonis 分析發(fā)現(xiàn)，不同性別的圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群組間無顯著性差異（門水平：F=1.49，R2=0.16，p=0.21；屬水平：F=0.51，R2=0.06，p=0.79）。

圖4 雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿在門水平（A）和屬水平（B）的PCoA分析Fig.4 PCoA analysis of male and female captive sika deer at the phylum（A）and genus（B）levels

2.4 腸道菌群差異物種

STAMP 分析表明，雄、雌樣品在門、屬水平上存在顯著差異物種（圖5）。在門水平上，雄、雌樣品的擬桿菌門（p=0.033）和芽單胞菌門（p=0.027）豐度比例差異顯著；在屬水平上，雄、雌樣品的Acetanaero?bacterium（p=0.044）、unclassified_Erythrobacteraceae（p=0.028）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas；p=0.027）、Demequina（p=0.026）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides；p=0.020）和unclassified_Sinobacteraceae（p=0.016）豐度比例差異顯著。根據(jù)LEfSe 分析（LDA 值>4）結(jié)果，雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿組間顯著差異的物種主要為擬桿菌門，在雌性圈養(yǎng)梅花鹿中對(duì)組間差異效果影響較大（圖6）。

圖5 雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿在門水平（A）和屬水平（B）的不同物種豐度比例差異Fig.5 Differences in the proportion of abundance of different species of male and female captive sika deer at the phylum（A）and genus（B）levels

圖6 圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群的LEfSe分析結(jié)果Fig.6 LEfSe analysis diagram of intestinal microbiota of captive sika deer

3 討論

長期相同的高纖維飲食以及進(jìn)化適應(yīng)會(huì)導(dǎo)致圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性發(fā)生變化，但在眾多影響因素中，性別因素總是被忽略，因此本研究以性別為分組因素，采集10 只圈養(yǎng)健康梅花鹿糞便，利用16S rRNA 高通量測序技術(shù)，探究不同性別圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群的結(jié)構(gòu)及多樣性。研究發(fā)現(xiàn)性別對(duì)圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性無顯著影響，且

有多種因素導(dǎo)致該結(jié)果產(chǎn)生，同時(shí)揭示了圈養(yǎng)梅花鹿腸道中受性別因素影響較大的菌群。

本研究雄、雌樣品腸道菌群共同擁有1 983 個(gè)OTUs，分別占二者OTUs 總數(shù)的86.94%和93.41%，說明雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿體內(nèi)均有較多的共有菌群。在相同飼料及圈養(yǎng)環(huán)境下，不同性別梅花鹿腸道菌群與宿主之間共同進(jìn)化，增加了二者腸道內(nèi)共有菌群的比例。從菌群構(gòu)成來看，無論雄性、雌性，厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度含量總和在圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群中均超過85%，是圈養(yǎng)梅花鹿的優(yōu)勢菌門，與野生條件下梅花鹿腸道菌群的研究結(jié)果［22］一致，表明這2種菌門在梅花鹿生理功能上起著重要作用。厚壁菌門能分解食物中的纖維素并將其降解為揮發(fā)性脂肪酸，而擬桿菌門可以幫助宿主消化復(fù)雜的粗纖維，參與分解代謝有毒物質(zhì)［23］，因此梅花鹿通過體內(nèi)腸道菌群能夠消化吸收植物細(xì)胞壁類的成分并攝取機(jī)體所需的能量，梅花鹿腸道菌群的構(gòu)成在一定程度上有利于分解代謝食物。在屬水平上，雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群相對(duì)豐度含量最高的2 個(gè)菌屬均為擬桿菌屬和梭菌屬，而海南坡鹿（Cervus eldii hainanus）腸道菌群的核心菌屬為普雷沃菌屬［24］，造成此差異的原因可能是物種、飲食和生活環(huán)境的不同。在梅花鹿體內(nèi)，擬桿菌屬作為一種重要的糖化菌，能產(chǎn)生大量的糖苷水解酶將三萜糖苷等轉(zhuǎn)化為極性小、親脂性高的小分子，從而有利于動(dòng)物腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；同時(shí)定植于腸道的梭菌屬細(xì)菌可通過刺激機(jī)體腸嗜鉻細(xì)胞（enterochromaffin cell，ECs）分泌5-羥色胺（5-HT）來顯著促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)［25］。2種菌屬共同合作能夠有效保障梅花鹿腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)順利排泄。在門、屬水平上，雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群組成物種相似，但相對(duì)豐度含量存在差異，與雄、雌大林姬鼠（Apodemus peninsu?lae）腸道菌群的研究結(jié)果［26］一致。不同性別梅花鹿腸道菌群組成具有一定的保守性，但年齡會(huì)影響個(gè)體的菌群分布，腸道菌群結(jié)構(gòu)會(huì)隨著年齡增加而更為復(fù)雜，個(gè)體之間差異也更明顯。

從菌群多樣性來看，雄性圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群豐富度高于雌性，但菌群多樣性低于雌性，這可能與雄、雌梅花鹿的性類固醇水平不同有關(guān)。性類固醇可通過調(diào)節(jié)腸屏障的完整性和通透性、性激素受體、β-葡萄糖醛酸酶、膽汁酸以及免疫系統(tǒng)等機(jī)制影響梅花鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)［27］，使不同性別梅花鹿腸道菌群的豐富度及多樣性存在差異。但本研究發(fā)現(xiàn)這種差異不具有顯著性，與雄、雌塔爾羊（Hemitragus jem?lahicus）得出的研究結(jié)論［28］一致。由于食物、生活環(huán)境長期相同，雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿為了盡可能獲得更多的食物來滿足營養(yǎng)需求，導(dǎo)致腸道菌群組內(nèi)進(jìn)化結(jié)果具有較高的一致性。β多樣性分析表明，雄、雌圈養(yǎng)梅花鹿腸道菌群組間無顯著性差異，與不同性別的獵豹（Acinonyx jubatus）［29］、狍（Capreolus pygar?gus）［30］和貉（Nyctereutes procyonoides）［31］的研究結(jié)果一致，表明性別對(duì)圈養(yǎng)梅花鹿組間腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性影響并不顯著，仍存在其他未知因素與之密切相關(guān)，如不同的腸段、生長階段等。不同性別的野豬（Sus scrofa）腸道菌群多樣性總體上無顯著差異，但不同腸段中表現(xiàn)出一定的雄、雌差異［32］。克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）腸道菌群在群落多樣性和物種豐度上均未體現(xiàn)出性別間差異，但在不同生長階段中存在顯著差異［33］。

在雌性梅花鹿中起重要作用的菌群為擬桿菌門，雌性擬桿菌門的相對(duì)豐度含量大于雄性。一方面，擬桿菌門能參與動(dòng)物體內(nèi)糖、膽汁酸和類固醇代謝，幫助宿主分解多糖提高營養(yǎng)利用率，為機(jī)體提供能量；另一方面，能將難消化的大分子碳水化合物轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸，減少促炎因子的生成，降低結(jié)腸炎癥的發(fā)生［34］。因此，與雄性圈養(yǎng)梅花鹿相比，雌性圈養(yǎng)梅花鹿腸道中的營養(yǎng)、能量代謝率較高，環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，腸道疾病發(fā)病率較低，具有更好的腸道微生態(tài)系統(tǒng)。

本研究通過采集圈養(yǎng)條件下不同性別梅花鹿的糞便，探究性別因素對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，為后續(xù)梅花鹿腸道菌群研究提供合理的依據(jù)，但本研究仍存在一定局限性，在未來應(yīng)集中研究野生條件下不同性別梅花鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，以及圈養(yǎng)、野生條件下二者腸道菌群的差異，這對(duì)保護(hù)梅花鹿具有重要意義。