張?jiān)?劉鋼 吳飛虎

突發(fā)性聾（sudden deafness,SD）是指突然發(fā)生、原因不明的感音神經(jīng)性耳聾，相鄰的兩個(gè)頻率聽力下降≥20dBHL，臨床上多伴有耳鳴（約90%）、眩暈（30%～50%）、耳悶脹感（50%），給患者的身心健康帶來巨大損害，是耳鼻喉科常見病、多發(fā)病及急病[1]。該病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與病毒感染、內(nèi)耳的微循環(huán)障礙、膜迷路水腫破裂、自身免疫性疾病等有關(guān)[2]，不及時(shí)診治可能會導(dǎo)致患者永久性聽力下降。臨床上對該疾病多采取藥物治療，故有效藥物的選擇至關(guān)重要。目前臨床上西醫(yī)主要予以激素、營養(yǎng)神經(jīng)、改善循環(huán)、抗病毒等藥物作為常規(guī)治療手段，但往往治療效果并不理想。對此，越來越多的醫(yī)家開始重視中醫(yī)治療突發(fā)性聾理念，并在臨床上積極采取中西醫(yī)結(jié)合的治療方式。耳聾膠囊（景忠山國藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z20030026，產(chǎn)品批號190201）具有清肝瀉火，利濕通竅的作用，是臨床上治療突發(fā)性聾的常用中成藥。本研究將耳聾膠囊治療突發(fā)性聾作為研究對象，采用Meta 分析聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對耳聾膠囊治療突發(fā)性聾進(jìn)行療效評價(jià)及并探討其潛在的作用機(jī)制。

資料與方法

1 Meta 分析

1.1 文獻(xiàn)檢索

檢索Web of Science、pubmed、維普、萬方和中國期刊全文數(shù)據(jù)庫文獻(xiàn)（建庫～2022 年1 月）等中英文數(shù)據(jù)庫，采用主題詞和自由詞結(jié)合的檢索方式，中文檢索式為“耳聾膠囊”AND“突發(fā)性聾”；英文檢索式為“Erlong Capsule”AND“sudden deafness”。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)

①研究類型：已公開發(fā)表或報(bào)道的關(guān)于耳聾膠囊治療突發(fā)性聾的隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)；②研究對象：納入研究對象符合《突發(fā)性聾診斷和治療指南》(2015)中的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及《中醫(yī)耳鼻咽喉科學(xué)》[3]中關(guān)于“暴聾”的中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；③干預(yù)措施：試驗(yàn)組采用耳聾膠囊聯(lián)合常規(guī)西藥治療；對照組選擇常規(guī)西藥治療，療程不限。

1.3 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)

①重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)；②非隨機(jī)對照試驗(yàn)；③綜述類文獻(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)提取與質(zhì)量評價(jià)

將檢索后的文獻(xiàn)進(jìn)行篩選，并提取文獻(xiàn)的基本信息，包括年份、作者、干預(yù)措施、療程、結(jié)局指標(biāo)等。再利用Cochrane 偏倚風(fēng)險(xiǎn)評估工具進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，評價(jià)結(jié)果共有3 個(gè)等級，分別為低風(fēng)險(xiǎn)、高風(fēng)險(xiǎn)和不清楚風(fēng)險(xiǎn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Review Manager 5.4 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。二分類變量選擇相對危險(xiǎn)度（RR）和95%置信區(qū)間（CI）表示；連續(xù)性變量選擇均數(shù)差（MD）和95%置信區(qū)間（CI）表示。根據(jù)χ2檢驗(yàn)并結(jié)合I2值判斷每個(gè)研究結(jié)果間的異質(zhì)性：當(dāng)P≥0.10，I2<50，則采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析，反之采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析。

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1 耳聾膠囊活性成分篩選及潛在靶點(diǎn)收集

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索耳聾膠囊的中藥成分，并將OB≥30%和DL≥0.18 作為篩選藥物主要活性成分的條件，篩選完成后，再利用Uniport 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫將所篩選出的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為相對應(yīng)的基因名并進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化。將得到的耳聾膠囊活性成分及潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytacape 3.9.1，并構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

2.2 突發(fā)性聾靶點(diǎn)篩選

利用Genecards 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫，以“sudden deafness”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，并將Relevance score≥10 點(diǎn)作為篩選條件。

2.3 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將耳聾膠囊潛在靶點(diǎn)與突發(fā)性聾相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得兩者交集靶點(diǎn)，并用韋恩圖展現(xiàn)。并將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫中，物種限定為人，利用Multiple proteins 工具，獲取蛋白相互作用相關(guān)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、可視化分析、關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選等。

2.4 耳聾膠囊與突發(fā)性聾交集靶點(diǎn)的GO/KEGG 分析

基于DAVID 數(shù)據(jù)庫對耳聾膠囊與突發(fā)性聾的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析以及KEGG 通路富集分析，并對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

結(jié)果

1 Meta 分析結(jié)果

1.1 納入文獻(xiàn)基本情況通過計(jì)算機(jī)檢索中英文數(shù)據(jù)庫，共5 篇文獻(xiàn)納入研究，排除文獻(xiàn)93 篇。文獻(xiàn)納入篩選流程，見圖1。治療組353 例患者，對照組351 例患者；男性患者401 例，女性患者303 例，共納入了704 例患者。納入研究的文獻(xiàn)基本信息，見表1。

1.2 偏倚風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)

使用Review Manager 5.4 軟件對納入文獻(xiàn)進(jìn)行偏倚風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)，見圖2。

圖2 偏倚風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)

1.3 臨床有效率

5 項(xiàng)研究均報(bào)道了治療組與對照組之間的臨床有效率，Meta 分析的結(jié)果（見圖3），異質(zhì)性檢驗(yàn)I2=0%＜50%，P=0.88，提示無異質(zhì)性，選擇固定效應(yīng)模型；治療組為耳聾膠囊聯(lián)合西藥[RR=1.17，95%CI（1.10，1.24），Z=5.33，P<0.00001]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在治療突發(fā)性聾方面，耳聾膠囊聯(lián)合西藥比單用西藥療效更好。

圖3 耳聾膠囊聯(lián)合西藥與單用西藥治療突發(fā)性聾的有效率評價(jià)

1.4 血流變分析

共有2 文獻(xiàn)對患者血流變中高切粘度、低切粘度、血漿粘度進(jìn)行了比較，結(jié)果見圖4。異質(zhì)性檢驗(yàn)I2 分別為91%，78%，89%，均＞50%，選擇隨機(jī)效應(yīng)模型；Meta 分析結(jié)果 [MD=-0.8，95%CI（-1.08，-0.52），Z=2.68，P <0.00001]；[MD=-2.65，95% CI（-3.37，-1.94），Z=7.30，P<0.00001]；[MD=-0.36，95%CI（-0.55，-0.17），Z=3.79，P=0.0001] 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示耳聾膠囊聯(lián)合西藥比單用西藥治療突發(fā)性聾可以更好地降低血液高切黏度、低切黏度、血漿黏度，從而更好地改善血液流變學(xué)。

圖4 治療組與對照組的血流變分析

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.1 耳聾膠囊活性成分及靶點(diǎn)

TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到藥物成分440 個(gè)，靶點(diǎn)3169個(gè)，并構(gòu)建藥物成分靶點(diǎn)圖。見圖5。

圖5 藥物-有效成分-靶點(diǎn)交互網(wǎng)絡(luò)

2.2 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

通過Genecards 數(shù)據(jù)庫獲得突發(fā)性聾靶點(diǎn)共214 個(gè)，取交集后獲得14 個(gè)耳聾膠囊-突發(fā)性聾共同靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，見圖6；并運(yùn)用Cytoscape 軟件作圖，其中耳聾膠囊與突發(fā)性聾相關(guān)前5 個(gè)靶點(diǎn)分別為TNF、PPARG、GJA1、IL-1β、IL-6，并將其作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖7。

圖6 藥物-疾病交集靶點(diǎn)圖

圖7 PPT 網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對獲得的14 個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析。耳聾膠囊治療突發(fā)性聾的交集靶點(diǎn)參與的生物過程共有109 條，對P 值進(jìn)行校正，符合FDR≤0.05 的生物過程有11 條，見圖8。主要包括血管內(nèi)皮生長因子生成、基因表達(dá)的陽性調(diào)控、脂質(zhì)儲存的負(fù)調(diào)節(jié)、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的陽性調(diào)節(jié)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖的積極調(diào)節(jié)、神經(jīng)發(fā)生的負(fù)調(diào)節(jié)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)等。參與的分子功能共有14 種，符合P≤0.01 的有7 種，見圖9。主要富集于一氧化氮合酶結(jié)合、腺苷酸環(huán)化酶激活劑活性、谷胱甘肽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合等。參與的細(xì)胞組成有11 個(gè)，其中符合P≤0.05 的有7 個(gè)，見圖10。主要有線粒體外膜、線粒體、膜筏、質(zhì)膜的組成部分、質(zhì)膜等。

圖8 GO 生物過程富集分析

圖9 GO 分子功能富集分析

圖10 GO 細(xì)胞組成富集分析

2.4 KEGG 通路富集分析

DAVID 數(shù)據(jù)庫獲得的KEGG 信號通路共50條，其中符合P≤0.05 的有39 條信號通路，涉及的主要信號通路包括C 型凝集素受體信號通路、IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路等。詳見圖11。其中X 軸為P 值大小，Y 軸代表名稱，氣泡面積的大小代表目標(biāo)基因集中屬于該分支的基因數(shù)量。

圖11 KEGG 富集分析

討論

本研究對納入的5 篇文獻(xiàn)通過Meta 分析評價(jià)臨床療效，耳聾膠囊聯(lián)合常規(guī)西藥治療突發(fā)性聾與單用常規(guī)西藥相比能夠提高臨床療效，降低血液高切黏度、低切黏度、血漿黏度，改善血液流變學(xué)，改善微循環(huán)效果更好。但目前對耳聾膠囊治療突發(fā)性聾的研究文獻(xiàn)較少，英文文獻(xiàn)幾乎空白，質(zhì)量較低，仍需高質(zhì)量的原始研究支持本次Meta 分析結(jié)論。

對耳聾膠囊治療突發(fā)性聾的5 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行討論。其中TNF、IL-1β、IL-6 是人體重要的促炎因子，可以引起耳蝸內(nèi)免疫細(xì)胞的聚集和炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生，是在耳蝸及聽覺中樞病變中發(fā)揮最為重要作用的炎癥因子[9]。炎性反應(yīng)的刺激會造成內(nèi)耳血管內(nèi)皮功能的損傷，致使內(nèi)耳毛細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致內(nèi)耳循環(huán)障礙的發(fā)生及進(jìn)展[10]，并有臨床研究[11]及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[12]表明TNF、IL-1β、IL-6 在突發(fā)性聾疾病發(fā)展過程中處于異常表達(dá)狀態(tài)，可能是與內(nèi)耳疾病關(guān)系最為密切的炎癥因子。TNF 可以激活JNKs、Bax 和Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)聽覺毛細(xì)胞進(jìn)行凋亡，在各種聽覺中樞和耳蝸損傷引起的感音神經(jīng)性耳聾起著至關(guān)重要的作用[13，14]。IL-1β 可以與TNF 協(xié)同激活NFkB 及MAPK 等下游信號通路，誘導(dǎo)毛細(xì)胞死亡及炎癥因子表達(dá)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，造成聽力的損失[15，16]。IL-6 可以通過上調(diào)凋亡基因從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，在內(nèi)耳中發(fā)揮著重要作用[17]，且有研究[18]證實(shí)抑制耳蝸內(nèi)IL-6 信號，可以減少免疫細(xì)胞的募集和炎癥細(xì)胞的浸潤，減輕耳蝸及聽覺神經(jīng)的損傷，對感音神經(jīng)性耳聾有著保護(hù)的作用。GJA1 基因編碼的間隙連接蛋白43，是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)與耳聾有關(guān)的α 連接蛋白基因，致聾的原因可能與參與耳蝸內(nèi)淋巴鉀的再循環(huán)有關(guān)[19]。PPARG 基因編碼蛋白存在于耳蝸的聽覺毛細(xì)胞中，可以影響葡萄糖和脂質(zhì)的代謝，炎癥和器官保護(hù)，在耳蝸中發(fā)揮著重要作用[20]。對耳聾膠囊治療突發(fā)性聾過程中的信號通路進(jìn)行討論。C 型凝集素受體（CLRs）可以刺激細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，從而觸發(fā)機(jī)體對病原體的先天性和適應(yīng)性免疫。Hunt 等[21]研究表明較高水平的CLR mRNA，可能會引起嚴(yán)重的炎癥，從而造成鼓膜穿孔、耳蝸損害等病變。Toll 樣受體（TLR）是膜結(jié)合受體，在先天免疫細(xì)胞上表達(dá)，并對革蘭氏細(xì)菌的膜成分作出反應(yīng)。TLR 信號通路通過NF-kB 和MAPK 的快速激活導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。有研究表明TLR4 可以誘導(dǎo)促炎因子的釋放，促進(jìn)耳蝸炎性反應(yīng)，損傷毛細(xì)胞[22]。IL-17 在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可以通過其對應(yīng)受體發(fā)出信號，并激活下游途徑，包括NF-kB，MAPKs 和C/EBPs，以誘導(dǎo)抗菌肽，細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)[23]。NOD 樣受體(NLR)在細(xì)胞內(nèi)配體的識別中起著關(guān)鍵作用，可以驅(qū)動(dòng)NF-kB 和MAPK 的激活，細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。楊倩倩[24]研究表明NLRX1 可能通過激活JNK 凋亡通路促進(jìn)毛細(xì)胞凋亡，加速聽力的受損程度。TNF 誘導(dǎo)聽覺毛細(xì)胞凋亡，在各種耳蝸及聽覺中樞損傷后導(dǎo)致的感音神經(jīng)性耳聾中起到重要作用[25]。AGE-RAGE 信號通路可以激活NF-kB 活性并使其轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞損傷因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抑制蛋白，致使耳蝸神經(jīng)細(xì)胞的壞死及血管縮窄，最終導(dǎo)致聽力的下降[26]。

綜上所述，耳聾膠囊可能作用于TNF、PPARG、GJA1、IL-1β、IL-6 等多個(gè)靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)C 型凝集素受體信號通路、IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路等多條信號通路，通過抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、改善循環(huán)等方面治療突發(fā)性聾。