高子珩 鄒 譞 周 宜 薛婷婷 陳顯軍** 楊 弋**

（1）華東理工大學(xué)，生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光遺傳學(xué)與合成生物學(xué)交叉學(xué)科研究中心，上海 200237；2）華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海市細(xì)胞代謝光遺傳學(xué)技術(shù)前沿科學(xué)研究基地，上海 200237）

核酸的代謝過程遵循著一系列的規(guī)律，包括自我復(fù)制、修飾、轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和降解。某些病毒中的逆轉(zhuǎn)錄和高等動(dòng)物特有的端粒復(fù)制也是核酸代謝過程的一部分。核酸代謝不僅是生物體正常生長發(fā)育、遺傳變異和細(xì)胞分化的重要因素，而且還與癌癥、輻射損傷、病毒感染、遺傳病和代謝病等疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系［1-4］。因此，與核酸代謝相關(guān)的酶是維持生物代謝和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要角色。

DNA 解旋酶BLM、WRN 和RECQ4 的異?？赡軙?huì)導(dǎo)致許多罕見的疾病，包括布盧姆綜合征（Bloom syndrome，又稱面部紅斑侏儒綜合征）、沃納綜合征（Werner syndrome，又稱成人早老綜合征）和羅斯蒙-湯姆森綜合征（Rothmund-Thomson syndrome），甚至腫瘤［5-6］。拓?fù)洚悩?gòu)酶的異常會(huì)對大腦發(fā)育過程中的遺傳機(jī)制產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，可能導(dǎo)致自閉癥譜系障礙（autistic spectrum disorder，ASD）的發(fā)生［7］；核糖核酸酶RNase H2 則可以激活先天免疫模式，識(shí)別受體，引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而影響大腦的發(fā)育過程；愛卡迪-古蒂綜合征（Aicardi-Goutieres sydrome，AGS）［8-9］是一種兒童炎癥性疾病，它會(huì)導(dǎo)致端粒縮短，這種縮短會(huì)提高患心血管疾病、肝硬化、高血壓癥狀、動(dòng)脈粥樣硬化、骨髓衰竭、高血糖和腫瘤等疾病的風(fēng)險(xiǎn)［10-11］。

因此，酶活性水平的改變已被用作許多病理研究的指標(biāo)和主要的研究靶點(diǎn)。某些常見的靶標(biāo)酶，如DNA 聚合酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶和解旋酶，對于核酸的代謝過程具有重要的調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)細(xì)胞生長與個(gè)體發(fā)育。同時(shí)，核酸代謝相關(guān)酶是DNA 測序、分子克隆、定點(diǎn)誘變、表觀修飾和聚合酶鏈反應(yīng)等生物技術(shù)和生物工程領(lǐng)域不可或缺的工具。本文將參與核酸體內(nèi)代謝過程的相關(guān)酶進(jìn)行了整理與分類（表1）。

1 傳統(tǒng)核酸酶學(xué)分析方法

建立核酸代謝酶的活性檢測方法對于疾病的診斷、臨床治療和病理研究具有重要意義。酶的標(biāo)準(zhǔn)活性檢測方法一般是通過測定合成或降解核酸底物的量來進(jìn)行測定的。傳統(tǒng)的核酸酶學(xué)分析方法包括比色法［12］、高效液相色譜法［13］、電化學(xué)法［14］、凝膠電泳法［15］、放射性標(biāo)記法［16］和酶聯(lián)免疫吸附法［17］等。本文對傳統(tǒng)的核酸代謝酶檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了整理比較（表2）。

Table 2 Comparison of traditional nucleic acid metabolism enzyme detection methods［18-41］表2 傳統(tǒng)的核酸代謝酶檢測方法比較［18-41］

2 基于熒光法的核酸酶學(xué)分析探針

1962 年2 月，日本籍海洋生物學(xué)家下村修［18］在水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種特殊的蛋白質(zhì)，它在紫外光照射下會(huì)產(chǎn)生一種耀眼的綠色熒光，這種蛋白質(zhì)被命名為綠色熒光蛋白（GFP）。Tsien 教授［19］進(jìn)一步改良了它，并開發(fā)出了一系列具有不同顏色的熒光蛋白，以滿足不同的應(yīng)用需求。在此基礎(chǔ)上，越來越多的熒光基團(tuán)陸續(xù)被報(bào)道，這些熒光基團(tuán)被廣泛用作酶活性檢測中的報(bào)告分子。基于熒光的分析方法具備價(jià)格便宜、使用簡便、敏感度高的優(yōu)勢，而且可以通過多種熒光基團(tuán)的組合實(shí)現(xiàn)正交檢測。經(jīng)過多年的發(fā)展，基于熒光法的酶活性分析檢測成為實(shí)現(xiàn)酶活性快速實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、低成本檢測的重要技術(shù)。

到目前為止，基于熒光的核酸酶學(xué)分析探針可以大致分為3 類：非特異性結(jié)合核酸的熒光探針，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）原理的特異性探針，以及遺傳編碼的熒光DNA 適配體/熒光RNA 適配體的特異性探針。按照時(shí)間的發(fā)展順序，分別稱其為第一代、第二代和第三代。

2.1 第一代熒光探針：非特異性結(jié)合核酸的熒光探針

核酸染料是一類在結(jié)合核酸之后熒光顯著增強(qiáng)的小分子化合物，通常具有苯環(huán)或共軛雙鍵等離域π鍵體系提供用于接收激發(fā)光的核外電子，同時(shí)還要有與DNA特異性相互作用的基團(tuán)。如圖1所示，這種相互作用力主要可分為插入DNA 的堿基之間以及與DNA 雙螺旋的小溝相互作用，依賴于前者的代表性核酸染色染料為溴化乙錠（ethidium bromide，EB），依賴于后者的代表性核酸染色染料為Hoechst系列染料。

Fig. 1 Schematic diagram of non-specific nucleic acid dyes圖1 非特異性核酸染料與雙鏈DNA結(jié)合示意圖

EB與核酸結(jié)合時(shí)熒光增強(qiáng)［20］并可用于電泳凝膠中的DNA檢測［21］，是分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。但是，使用EB 染色的背景熒光高，而且易導(dǎo)致DNA 突變，具有核酸毒性，不利于實(shí)驗(yàn)人員的健康。碘化丙錠（propidium iodide，PI）是一種溴化乙錠的衍生物，它能夠吸收紫外光，產(chǎn)生明亮的熒光，通過PI與吖啶橙（acridine orange，AO）聯(lián)用可以鑒別死/活細(xì)胞，活細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生明亮的綠色熒光，而死細(xì)菌則會(huì)產(chǎn)生鮮艷的紅色熒光［22］。7-氨基-放線菌素D（7-amino-actinomycin D，7-AAD）是1974 年合成的染色劑，它可以用來檢測染色體的結(jié)構(gòu)和功能。7-AAD 對于染色質(zhì)的結(jié)合不受染色質(zhì)凝聚程度的影響［23］，可以區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞［24］，其發(fā)射波譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI 的最佳替代品。此外，熒光素二乙酸酯和PI 也可以用于細(xì)胞染色，以更準(zhǔn)確地鑒定死亡細(xì)胞。SYBR Green I 由Molecule Probes 公司開發(fā)，并于1997 年被首次應(yīng)用和報(bào)道用于細(xì)胞計(jì)數(shù)［25］。SYBR Green I 已被廣泛應(yīng)用于多種DNA 檢測和分析技術(shù)，其中包括流式細(xì)胞術(shù)［25］、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR） 以及其他多種應(yīng)用中［26］。SYBR Green I與雙鏈DNA相互作用后可顯著增加亮度［27］。然而溶液的酸堿度會(huì)明顯影響SYBR系列的染色效果，如果溶液pH高于8.3或低于7.5，它的檢測靈敏度將會(huì)顯著下降［28］。Pico Green 染料和SYBR Green I 具有相似的結(jié)構(gòu)和光譜，由Molecule Probes 公司開發(fā)，熒光關(guān)于雙鏈DNA濃度的線性關(guān)系范圍從雙鏈DNA濃度25 ng/L至1 mg/L。即使在鹽、蛋白質(zhì)、聚乙二醇、尿素、氯仿、酒精和瓊脂糖等存在的情況下，該染料測定的結(jié)果也能保持穩(wěn)定［29］。Gel Red、Gel Green 是EB的結(jié)構(gòu)類似物，通過插層作用結(jié)合DNA［30］，但是由于是兩分子橋聯(lián)的產(chǎn)物，因此該染料分子質(zhì)量大，難以透過細(xì)胞膜，對DNA和RNA的遷移影響小。Super Gel Blue（US EVERBRIGHT INC）無致突變性，可用藍(lán)光成像避免紫外傷害，熱穩(wěn)定且無需避光儲(chǔ)存，可用于瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠電泳中DNA或RNA染色。

Hoechst 33258 和Hoechst 33342 長時(shí) 間 暴露 在紫外光下不僅會(huì)導(dǎo)致光漂白，還會(huì)導(dǎo)致其在藍(lán)光的激發(fā)下發(fā)射出以綠色為主同時(shí)帶有黃色和橙色的熒光，可能會(huì)對同時(shí)使用Hoechst染料與GFP 的實(shí)驗(yàn)帶來干擾和影響［31］。SiR-Hoechst 是一種使用遠(yuǎn)紅外光激發(fā)的核酸染料，由基于硅羅丹明的熒光團(tuán)（SiR）和能與DNA 小溝結(jié)合的基團(tuán)雙苯甲酰亞胺組合而成。結(jié)合雙鏈DNA后在670 nm處的熒光增強(qiáng)了50 倍，并且與雙鏈RNA 集合幾乎沒有熒光，除此之外，應(yīng)用于活細(xì)胞染色時(shí)，使用SiRHoechst 對細(xì)胞的影響相比于SYTO 61、Vibrant Dye cycle Ruby 和DRAQ5 等DNA染料更?。?2］。DAPI是一種DNA序列特異性的染料，其通過附著在富含腺嘌呤-胸腺嘧啶的DNA序列的小溝中形成熒光復(fù)合物，此外還可以與僅含有鳥嘌呤-胞嘧啶堿基組成的DNA結(jié)合形成無熒光復(fù)合物［33］。DIPI是DAPI的結(jié)構(gòu)類似物，但是DIPI對于紫外光照射有更好的抗性，在30 min 內(nèi)幾乎不會(huì)褪色［34］。Hoechst系列染料可以方便地與其他常用的紅色/綠色熒光基團(tuán)聯(lián)用，對活細(xì)胞進(jìn)行正交染色。AO早在1967 年之前就被應(yīng)用于核酸染色［35］，其可以通過染色后的顏色區(qū)分DNA和RNA。該染料對DNA染色呈綠色而對RNA 染色則呈現(xiàn)紅色熒光［36］。AO能透過細(xì)胞膜，可以對活細(xì)胞及死細(xì)胞內(nèi)的核酸進(jìn)行染色［37］。普卡霉素（mithramycin）可以與DNA中富含鳥嘌呤-胞嘧啶的區(qū)域結(jié)合，并且這種結(jié)合主要是這兩種化合物從溶液中疏水轉(zhuǎn)移到DNA 的小溝中，吸收470 nm 波長的青光并發(fā)射554 nm 的黃光，褶皺霉素和色霉素與普卡霉素?fù)碛邢嗤暮诵娜h(huán)結(jié)構(gòu)，而連有不同的寡糖鏈，因此其一樣可以與DNA的小溝結(jié)合，而吸收/發(fā)射光譜略有不同［38］。

還有一類專門用作溶液中DNA 定量的核酸染料 如 Quant Fluor （Promega）、 Accu Clear（Biotium）、Qubit（Life Technologies）等核酸定量試劑盒。這些商業(yè)試劑盒除了實(shí)現(xiàn)DNA及RNA的高靈敏定量進(jìn)而分析核酸代謝的相關(guān)酶的酶活性［39］之外，還在輔助RNA 樣品提取［40］、生物氣溶膠分析［41］、藥物篩選［39］、高通量測序文庫構(gòu)建［42］、類器官培養(yǎng)［43］等方面提供了基礎(chǔ)平臺(tái)。To-Pro-3 是一種噻唑橙的衍生物，是一種可以由642 nm 激光激發(fā)的紅色熒光團(tuán)［44］。它無法穿過細(xì)胞膜，可以在流式細(xì)胞術(shù)中染色死亡細(xì)胞［45］。To-Pro-3及其二聚體TOTO-3與雙鏈和單鏈DNA間存在多種相互作用力，有很強(qiáng)的結(jié)合能力［46］。DRAQ5 是一種紅外熒光雙烷基氨基蒽醌染料，對DNA具有高親和力且可以進(jìn)入活細(xì)胞［47］。它的最大吸收峰在646 nm，最大發(fā)射峰在681 nm。但是DRAQ5濃度高至1 μmol/L時(shí)會(huì)引起核結(jié)構(gòu)的變化，造成染色質(zhì)的異常聚集問題［48］。SYTO 是一組跨越廣域光譜范圍的染料，涵蓋廣泛的可見光激發(fā)和發(fā)射光譜。所有SYTO染料在無細(xì)胞系統(tǒng)中均顯示出低本底熒光，與DNA或RNA結(jié)合后熒光顯著增加［49］，量子產(chǎn)率增加了近40 倍［50］。Vibrant Dye cycle Ruby 是由Molecule Probe 公司開發(fā)的Vibrant Dye cycle Ruby 染料家族的新型低細(xì)胞毒性紅色熒光染料，主要用于流式細(xì)胞術(shù)中的細(xì)胞染色［51-52］。

綜上，我們對常見核酸染料的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較（表3）。相比放射性同位素標(biāo)記，使用核酸染料不僅同樣可以在染色后的電泳凝膠上直觀地展示核酸的濃度和分布，而且無需繁瑣的預(yù)處理和針對放射性元素的防護(hù)。當(dāng)核酸染料用于液體樣品的檢測時(shí)，使用酶標(biāo)儀即可代替昂貴的液體閃爍計(jì)數(shù)儀。正因如此，在如今的研究中核酸染料已經(jīng)幾乎完全取代了放射性同位素標(biāo)記法成為主流。但是核酸染料也有著自身的局限性，由于核酸染料是非序列依賴性的，因此在對核酸進(jìn)行標(biāo)記時(shí)無法區(qū)分序列不同的核酸，也無法通過染色區(qū)分某一特定的引物的延伸產(chǎn)物，同時(shí)，使用核酸染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 時(shí)也不得不考慮假陽性問題等。為了擺脫以上種種困境，以TaqMan探針為代表的使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的寡核苷酸探針被開發(fā)出來，這些經(jīng)過設(shè)計(jì)的序列以FRET原理為基礎(chǔ)，成為了第二類基于熒光的核酸代謝相關(guān)酶研究方法。

Table 3 Comparison of advantages and disadvantages of common nucleic acid dyes表3 常見核酸染料優(yōu)缺點(diǎn)比較

2.2 第二代熒光探針：基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理的特異性探針

第二代熒光探針基于FRET的原理，它能夠?qū)⒎肿娱g的能量以非輻射的方式轉(zhuǎn)移到另一個(gè)熒光團(tuán)，這種轉(zhuǎn)移過程受到分子間距離的限制。這種技術(shù)可以有效地檢測出分子間的相互作用，從而提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。當(dāng)供體和受體之間相距在1~10 nm區(qū)域內(nèi)時(shí)，由于供體發(fā)出的熒光能量被受體吸取，導(dǎo)致供體熒光強(qiáng)度顯著降低，而受體熒光強(qiáng)度則會(huì)顯著增強(qiáng)［53］。

第二代熒光探針可分為化學(xué)水解型熒光探針、核酸雜交型熒光探針和分子互作型熒光探針［54］?；瘜W(xué)水解型熒光探針中的猝滅基團(tuán)吸收來自報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)。在擴(kuò)增過程中，寡核苷酸與互補(bǔ)目標(biāo)序列雜交后利用核酸酶的酶切活性，探針中的磷酸二酯鍵被水解，報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，從而釋放出熒光信號(hào)，如TaqMan［55］、QZyme［56-57］等探針。核酸雜交型熒光探針通過與標(biāo)記了報(bào)告基團(tuán)的探針與目標(biāo)DNA 結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)報(bào)告基團(tuán)與猝滅基團(tuán)的分離，比如雙雜交探針［58］、分子信標(biāo)（MB）［59］、MGB Eclipse 探針［60］、蝎型探針［61］、Ampli-fluor 探針［62］和LUX 引物［63］，它們會(huì)在延伸過程中無損釋放，報(bào)告基因和猝滅劑之間建立物理距離，釋放報(bào)告基因的熒光信號(hào)。分子互作型熒光探針的報(bào)告基團(tuán)在連接到RNA 上后不會(huì)立即被激活，只有當(dāng)RNA 與相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合之后，才會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，如PIFE探針［64］。

2.2.1化學(xué)水解型探針

化學(xué)水解型探針通常用于實(shí)時(shí)定量PCR。當(dāng)擴(kuò)增未開始時(shí)，猝滅基團(tuán)可以有效地吸收報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)，在擴(kuò)增步驟中，基于熱穩(wěn)定型Taq聚合酶5'-3'的核酸外切酶活性［55］，短寡核苷酸與互補(bǔ)目標(biāo)序列雜交后被水解，報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開，進(jìn)而釋放出熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測核酸擴(kuò)增的目的（圖2c）。TaqMan 探針可以在指數(shù)擴(kuò)增階段準(zhǔn)確地定量產(chǎn)物［65-66］。得益于其高特異性，除實(shí)時(shí)熒光qPCR，TaqMan探針還可用于量化基因表達(dá)，遺傳多樣性等檢測，也能夠用于各種核酸酶的活性及抑制檢測，如靶向核酸切割［67］、糖基化［68］、甲基化［69-70］和磷酸化［71］的酶。

由BD Biosciences 公司2003 年研發(fā)的QZyme Assay的原理與其他定量PCR系統(tǒng)的原理相似，但涉及不同的熒光信號(hào)生成機(jī)制［56-57］。DNAzyme 是一種具有獨(dú)特催化活力的寡核苷酸，它具有兩種底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域，能夠在特殊的磷酸二酯鍵處有效地切割核酸底物（圖2a），QZyme 系統(tǒng)包括了DNAzyme 以及與其非活性鏈相連的5'端特異性引物和3'端特異性引物各一條，還有一種DNAzyme特異性的熒光底物，這是一種一端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)，另一端標(biāo)記有猝滅基團(tuán)的寡核苷酸片段。在擴(kuò)增過程中，產(chǎn)生包含活性的正向DNAzyme 拷貝的擴(kuò)增子，從而裂解底物，在空間上分離熒光團(tuán)和猝滅劑，因此擴(kuò)增子的積累伴隨著熒光的增加。

2.2.2核酸雜交型探針

雙雜交探針，即相鄰雜交探針，由Heller 和Morrison［58］于1985 年首次提出。該測定使用兩個(gè)與相鄰DNA 序列雜交的寡核苷酸探針。兩個(gè)探針末端分別用發(fā)色團(tuán)標(biāo)記，其中一個(gè)探針有3'供體，另一個(gè)有1 個(gè)5'受體。FRET 在雙雜交后形成，通過供體的猝滅和受體熒光的敏化發(fā)出熒光信號(hào)。兩個(gè)熒光基團(tuán)的激發(fā)光光譜有一定程度的重疊，且兩條探針需要與靶核酸的雜交位置應(yīng)相互鄰近（通常為1~5 個(gè)堿基）。兩個(gè)探針需要被精確地雜交到特定的靶順序上才能夠探測到熒光，因此該方法具有極強(qiáng)的特異性（圖2b）。

1996 年，Tyagi 和Kramer［59］首次提出了分子信標(biāo)。分子信標(biāo)是由15~30 個(gè)堿基組成的DNA 序列，兩側(cè)分別有2個(gè)短的互補(bǔ)莖序列，當(dāng)整個(gè)序列在缺少目標(biāo)序列時(shí)，將自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成可以令猝滅劑和熒光團(tuán)之間更加緊密地結(jié)合，有效地抑制熒光信號(hào)。當(dāng)目標(biāo)DNA或RNA分子存在時(shí)，它們之間會(huì)發(fā)生雜交，雜交越強(qiáng)，熒光團(tuán)和猝滅劑之間的空間分離更加明顯，從而提高熒光信號(hào)的強(qiáng)度（圖2d）［72］。相比于TaqMan 探針，分子信標(biāo)在擴(kuò)增過程中具有更高的穩(wěn)定性，不會(huì)出現(xiàn)降解現(xiàn)象，而且在每個(gè)循環(huán)中，它都能夠與靶標(biāo)序列結(jié)合，從而產(chǎn)生可測量的熒光信號(hào)。這種基于分子信標(biāo)設(shè)計(jì)的熒光響應(yīng)目標(biāo)酶的檢測探針已應(yīng)用于監(jiān)測各種核酸酶的催化過程，如切割［73-75］、連接、糖基化［75］、甲基化［76-77］和磷酸化［78-79］。

Afonina 等［60］于2002 年 報(bào) 道了MGB Eclipse probe，其主要特征是在5'端DNA 小溝結(jié)合基團(tuán)（minor groove binder，MGB）配體以及猝滅劑，在 3'端具有熒光團(tuán)。單鏈MGB Eclipse 探針的熒光在未雜交時(shí)被末端染料和猝滅基團(tuán)的相互作用而有效猝滅。在與互補(bǔ)目標(biāo)雜交后，MGB 分子嵌入雙鏈并使探針高度穩(wěn)定，這使更短、更特異的探針序列成為可能。5'-MGB-quencher 基團(tuán)還可以防止探針在PCR 過程中被Taq DNA 聚合酶水解。如圖2e所示，歸因于MGB和堿基雜交賦予的出色特異性，MGB Eclipse 探針可廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光qPCR。MGB Eclipse probe 系統(tǒng)顯著地增強(qiáng)特異性，尤其是對于某些特定類型的單核苷酸多態(tài)性識(shí)別，如富含鳥嘌呤-胞嘧啶的錯(cuò)配、或富含腺嘌呤-胸腺嘧啶的目標(biāo)核酸中鳥嘌呤-胸腺嘧啶替換，以及任何情況下的鳥嘌呤-胸腺嘧啶錯(cuò)配。

David Whitcombe 團(tuán)隊(duì)［61］于1999 年首次報(bào)道蝎型探針（scorpions probes）。蝎型探針包括一段目標(biāo)片段特異性序列、一對自互補(bǔ)的回文序列和一對熒光團(tuán)/猝滅劑，此外增加了一段與相應(yīng)靶核酸結(jié)合的PCR 引物上，并增加PCR 終止子以防止5'方向莖環(huán)序列的復(fù)制。從引物進(jìn)行一輪PCR 延伸后，新合成的目標(biāo)區(qū)域與探針上的特異性序列互補(bǔ)（圖2g）。經(jīng)過第二輪變性和退火處理后，蝎型探針與目標(biāo)雜交，熒光團(tuán)與猝滅劑分離，從而釋放出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，這一特性比TaqMan 探針和分子信標(biāo)更加迅速、更有效。

Nazarenko 等［62］于2002年首次提出LUX（Light Upon eXtension）探針。LUX 探針基于寡核苷酸的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)對共軛熒光團(tuán)發(fā)射特性的影響，只有探針在與PCR 產(chǎn)物雜交形成雙鏈時(shí)，共軛熒光團(tuán)才會(huì)增加熒光強(qiáng)度。LUX 探針設(shè)計(jì)由以下元素構(gòu)成：以C或G作為引物的3'端核苷酸，熒光團(tuán)連接至從3'端起的第2 個(gè)或第3 個(gè)堿基（T），在標(biāo)記核苷酸兩側(cè)的3 個(gè)核苷酸內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)G，以及莖環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾引物。LUX探針的5'端在低于其熔點(diǎn)的溫度下形成平末端發(fā)夾。LUX 探針的設(shè)計(jì)十分簡單，可以通過將引物的上述特征和其他如長度和熔解溫度（Tm）的特征輸入專門的軟件，來產(chǎn)生位于整個(gè)目標(biāo)序列中的大量引物對［64］。

2.2.3分子相互作用型探針

對于RNA 及相關(guān)靶向酶的檢測，蛋白質(zhì)誘導(dǎo)熒光增強(qiáng) （protein-induced fluorescence enhancement，PIFE） 能夠補(bǔ)充FRET 對蛋白質(zhì)-RNA 互相作用的檢測。PIFE 能夠記錄蛋白質(zhì)與RNA 結(jié)合后的運(yùn)動(dòng)和活性，且PIFE 可以通過全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀察和監(jiān)測，并只需要一種染料就可以標(biāo)記一條RNA鏈（圖2f）。PIFE的好處在于它可以節(jié)省設(shè)計(jì)染料結(jié)合位點(diǎn)的時(shí)間，它不會(huì)使染料影響蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力和解離。通常，染料位于RNA 的5'端或3'端，染料的選擇也類似于FRET，需要考慮量子產(chǎn)率、熒光強(qiáng)度、壽命、動(dòng)態(tài)各向異性和光穩(wěn)定性。與FRET相同，PIFE也具有距離依賴性，并且在熒光團(tuán)和蛋白質(zhì)附近的0~3 nm 范圍內(nèi)表現(xiàn)更好，而FRET 在3~10 nm 處表現(xiàn)出最高的靈敏度。這表明FRET 和PIFE 在短距離測量RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物動(dòng)力學(xué)方面能夠彼此補(bǔ)充［80］。總之，PIFE 可廣泛應(yīng)用于研究RNA 與不同酶如聚合酶、解旋酶或核酶和核糖開關(guān)的相互作用，以實(shí)現(xiàn)RNA識(shí)別和酶活性的檢測。

Fig. 2 Schematic of specific probe based on FRET principle圖2 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的特異性探針原理圖

2.3 第三代熒光探針：基于遺傳編碼的熒光RNA適配體和熒光DNA適配體

為了開發(fā)低成本、高通量、快速的檢測核酸代謝相關(guān)酶的方法，研究者們進(jìn)行了一些新的探索。熒光蛋白可在基因水平上進(jìn)行遺傳編碼，并在細(xì)胞自身生化反應(yīng)機(jī)制下產(chǎn)生熒光。將熒光蛋白與目標(biāo)蛋白融合可以幫助研究人員“照亮”目標(biāo)蛋白，揭示目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞與活體中的各種行為，為研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)在生命活動(dòng)中的作用提供技術(shù)支持，即應(yīng)用熒光蛋白檢測蛋白質(zhì)的代謝過程，以及蛋白質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性。受到熒光蛋白的啟發(fā)，基于熒光核酸適配體的檢測方法被開發(fā)出來以應(yīng)用于對核酸代謝酶活性的研究。

何謂“熒光核酸適配體”？熒光核酸適配體指的是通過合成生物學(xué)技術(shù)得到的可以與熒光團(tuán)染料特異性結(jié)合并可以激活染料熒光的一類核酸適配體［81］。熒光核酸適配體在自然界中并不存在，必須通過人工合成與篩選的方式得到［82-83］。篩選熒光核酸適配體所使用的技術(shù)為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）。研究人員構(gòu)建出長度20~100 nt（豐富度可以達(dá)到1014~1015）的單鏈寡核苷酸文庫，隨后需要依次經(jīng)過與靶標(biāo)（染料小分子）的孵育、洗雜、洗脫、富集、次級(jí)文庫的制備等多個(gè)步驟作為一輪篩選，一般經(jīng)過6~15 輪的篩選后即可得到與靶標(biāo)特異性結(jié)合的序列。核酸具有制備簡便、結(jié)構(gòu)修飾容易、選擇性高、親和力強(qiáng)等多種優(yōu)勢。熒光核酸適配體按照其化學(xué)本質(zhì)可以分為熒光RNA適配體和熒光DNA適配體。

2.3.1熒光RNA適配體

熒光RNA 適配體孔雀石綠適配體（MG aptamer）由Grate 和Wilson［84］于1999 年報(bào)道。染料MG結(jié)合與該適配體結(jié)合后，其最大吸收波長產(chǎn)生了14 nm的紅移。2003年，Babendure等［81］發(fā)現(xiàn)MG Aptamer可以結(jié)合孔雀石綠（MG）及其衍生物并顯著增強(qiáng)它們的熒光，熒光激活倍數(shù)有的可達(dá)2 300 倍以上，據(jù)此提出了熒光核酸適配體這一概念。本文對已報(bào)道的熒光RNA 適配體及其發(fā)色團(tuán)按照復(fù)合物的發(fā)射波長進(jìn)行了總結(jié)（圖3）。研究者們基于傳統(tǒng)染料如Hoechst、噻唑橙、二甲基吲哚紅和磺基羅丹明B 等開發(fā)了諸如Hoechst 1c［85］、Mango［86］、Peach［87］、DIR2s-apt［88］、o-Coral［89］和SRB-2［90］等RNA熒光適配體。

2008年，Sando等［85］合成了一種Hoechst衍生物Hoechst 1，隨后篩選獲得了該染料的RNA 適配體I-mini3-4，其熒光激活倍數(shù)近30 倍，平衡解離常 數(shù)（KD） 為35 nmol/L。Dolgosheina 等［86］在2014 年篩選得到了可以特異性識(shí)別并結(jié)合TO1 的RNA適配體Mango。Mango以很高的親和力（KD=3 nmol/L）結(jié)合TO1-biotin 并發(fā)出黃色熒光，結(jié)合TO1 的衍生物TO3-Biotin 產(chǎn)生紅色熒光。2008 年，Constantin 等［91］篩選獲得了稱為DIR-Apt1 的RNA適配體，它與DIR 結(jié)合的KD為86 nmol/L，復(fù)合物發(fā)出明亮的紅色熒光。2017 年，Tan 等［92］篩選獲得了另一種可以特異性結(jié)合DIR 染料的RNA 適配體DIR2s-Apt，親和力為966 nmol/L。

Fig. 3 Fluorescent RNAs and fluorophore ligands圖3 目前已有熒光RNA適配體及其熒光團(tuán)配體

基于熒光蛋白的生色團(tuán)具有小分子質(zhì)量、電中性、背景熒光弱的特性，研究人員期望獲得類似熒光蛋白性能的“擬熒光蛋白R(shí)NA”，即用一個(gè)RNA適配體去結(jié)合、包裹并激活生色團(tuán)的熒光。目前已報(bào)道的熒光RNA 適配體及其配體在光譜上的分布如圖3。2011 年，Jaffrey 研究團(tuán)隊(duì)［93］模擬GFP 熒光團(tuán)HBI 合成了染料分子DFHBI 及其RNA 適配體Spinach。DFHBI在沒有結(jié)合Spinach時(shí)的背景熒光很低，結(jié)合Spinach 之后相對熒光強(qiáng)度較高，平衡解離常數(shù)（KD）為537 nmol/L。由于Spinach 熱穩(wěn)定性差，亮度很低，研究者們相繼研究出Spinach2［94］、 Broccoli［95］、 iSpinach［94］和Baby Spinach［96］的RNA 適配體，提高了它們的亮度和熱穩(wěn)定性還降低了其對離子濃度的敏感性并縮小了它的尺寸。然而由于DFHBI 及其類似物極易發(fā)生順/反光異構(gòu)化，因此以其為熒光團(tuán)開發(fā)的熒光RNA 大多存在較為嚴(yán)重的光猝滅現(xiàn)象。2017 年，科學(xué)家們在RFP 的熒光團(tuán)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了新的染料分子DFHO。通過體外篩選得到了選擇性結(jié)合DFHO 的RNA適配體Corn［97］。Corn分子體積?。▇30 nt），但其光穩(wěn)定性優(yōu)于Spinach 和Broccoli，可以提供高精度的定量結(jié)果。這充分說明，光穩(wěn)定性取決于染料分子與RNA 適配體形成的復(fù)合物，而不僅僅取決于染料分子。這些熒光RNA 適配體與染料分子結(jié)合后亮度較低，且親和力較弱、熱穩(wěn)定性較差、容易錯(cuò)誤折疊，且Spinach、Broccoli 和Corn不具備生物正交性。

2019年，楊弋課題組與朱麟勇課題組［98］構(gòu)成的聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)在熒光RNA 適配體領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，他們基于全新的分子設(shè)計(jì)理念設(shè)計(jì)合成了全新的熒光團(tuán)分子HBC。HBC 是結(jié)構(gòu)上具有乙烯橋的分子轉(zhuǎn)子。在自由溶液中，分子轉(zhuǎn)子受激發(fā)時(shí)獲得的能量主要通過圍繞乙烯橋旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行非輻射衰減，因此HBC 在水溶液中幾乎沒有熒光；當(dāng)分子轉(zhuǎn)子被蛋白質(zhì)或核酸結(jié)合時(shí)，乙烯橋的運(yùn)動(dòng)會(huì)被限制，受激發(fā)時(shí)獲得的能量會(huì)通過產(chǎn)生熒光的方式進(jìn)行輻射衰減。Pepper是能夠特異性結(jié)合并激活HBC的RNA適配體。Pepper對HBC有著很強(qiáng)的結(jié)合力，KD為3.5 nmol/L，結(jié)合后的熒光增強(qiáng)倍數(shù)超過3 000 倍。另外，其熱穩(wěn)定性好，光譜涵蓋綠色（485 nm）到紅色（620 nm）的熒光波段，為實(shí)現(xiàn)多種RNA 代謝酶活性檢測以及多色檢測提供了應(yīng)用前景。此外，HBC 有著極低的細(xì)胞毒性且容易進(jìn)入細(xì)胞，相對于Broccoli和Corn，Pepper在大腸桿菌細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的熒光亮度要高一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。因此Pepper 系列熒光RNA 適配體也為活細(xì)胞中研究目標(biāo)RNA 的功能提供了極具價(jià)值的工具。

基于熒光RNA 適配體的應(yīng)用分為體內(nèi)成像與體外檢測兩種。基于核酸代謝相關(guān)酶的活性研究主要集中在體外的檢測，上述熒光RNA 適配體可被用于構(gòu)建無標(biāo)記的生物傳感器，相較于早期的方法能夠?qū)崿F(xiàn)更加簡便、靈活和高靈敏的檢測。譬如早期在體外檢測轉(zhuǎn)錄的方法很大程度上依賴于放射性核苷酸的摻入或基于雜交的方法檢測轉(zhuǎn)錄過程以及轉(zhuǎn)錄酶的活性。近年來，將蛋白質(zhì)輸入直接轉(zhuǎn)導(dǎo)至核酸輸出是一種提高蛋白質(zhì)檢測靈敏度的創(chuàng)新策略，因?yàn)樗梢赃M(jìn)一步整合多種核酸擴(kuò)增技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）、鏈置換擴(kuò)增（SDA）、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）和滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）［99-102］等。

2.3.2熒光DNA適配體

相比于熒光RNA適配體，熒光DNA適配體具有更好的穩(wěn)定性，因此在生物分析和細(xì)胞外分子成像中具有更廣泛的應(yīng)用。與熒光RNA 適配體的發(fā)展相比，熒光DNA 適配體的發(fā)展較為緩慢，基于熒光DNA 適配體構(gòu)建小分子或蛋白質(zhì)等生物傳感器的報(bào)道較少。

很多已知的G 四聯(lián)體DNA 比如EAD、c-Myc、c-kit2、bcl-2、c-kit1、Kras、T95、TBA、Hras、HTG-21、Telo21、Oxy、Hum 21，如花菁染料、三苯基甲烷染料、咔唑、卟啉等這些熒光染料配體在與這些G 四聯(lián)體DNA 結(jié)合后熒光被顯著增強(qiáng)［103］。不同分子與G四聯(lián)體的結(jié)合位點(diǎn)不同，熒光響應(yīng)機(jī)制也不同。根據(jù)不同的折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，G四聯(lián)體可以識(shí)別凹槽中的小分子，并將小分子堆疊在凹槽的頂部或底部上，或者允許小分子插入G四聯(lián)體的平面之間。靜電力、范德華力、氫鍵、π-π堆積和其他非共價(jià)相互作用共同穩(wěn)定了G四聯(lián)體與染料配體之間的結(jié)合。大多數(shù)G四聯(lián)體的配體都含有一個(gè)平面芳香核，其通過π-π堆積與外部G四聯(lián)體相互作用，側(cè)鏈通過氫鍵與DNA 堿基和環(huán)的磷酸骨架相互作用后形成穩(wěn)定的復(fù)合物。Jin 等［104］設(shè)計(jì)并開發(fā)了V 型染料BPBC。BPBC 在水性緩沖液條件下幾乎沒有熒光，與平行G 四聯(lián)體（EAD、c-Myc、c-kit 2 等）結(jié)合后熒光增加330~1 800 倍，與單鏈或雙鏈DNA結(jié)合后熒光僅增加約30倍，與反平行G 四聯(lián)體結(jié)合時(shí)增加30~110 倍。G 四聯(lián)體共有3種結(jié)構(gòu)類型：平行G四聯(lián)體、反平行G四聯(lián)體和混合型G四聯(lián)體，常見G四聯(lián)體的序列及其結(jié)構(gòu)類型見表4。

除了表4中所列舉的一些已報(bào)道的G四聯(lián)體可以與通用的G四聯(lián)體特異性染料結(jié)合后產(chǎn)生熒光激活的DNA外，還有一些是經(jīng)過嚴(yán)格的SELEX篩選和結(jié)構(gòu)優(yōu)化而得到的只針對某種染料具有激活效果的特異性熒光DNA 適配體，它們之中有G 四聯(lián)體也有非G四聯(lián)體。Sando等［105］于2007年報(bào)道了第一個(gè)熒光DNA 適配體并命名為Class1-1-mini，其可以與常規(guī)的DNA 染料Hoechst 的衍生物產(chǎn)生近200倍的熒光增強(qiáng)。自2007年至今，已有報(bào)道的熒光DNA 適配體共有13 條，適配體大小在18~99 nt之間。根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道把目前已有的熒光DNA 適配體進(jìn)行了歸納整理［104-116］（表5）。在熒光DNA適配體的篩選工作中，裴仁軍研究員團(tuán)隊(duì)的工作比較突出，在已報(bào)道的13條適配體中，有8條出自該團(tuán)隊(duì)，分別是MG.1-3、BBR4S3、ThT.2-2、DIR2-1、CV30S、Nm1、Nm2 和ZnP1.2。這些熒光DNA 適配體所使用的染料分別為孔雀石綠、小檗堿、硫磺素T、DIR、結(jié)晶紫、N-甲基卟啉二丙酸 IX等常見的核酸染料［110，112-116］。達(dá)泊氧磺酰乙二胺（SEDA）和達(dá)泊氧磺酸（SA）是達(dá)泊氧染料的兩種衍生物。DAP-10-42 可以同時(shí)激活SEDA 和SA 兩種染料分別722倍和35倍，由于其與染料的較高親和力，常被用來設(shè)計(jì)為生物傳感器［107］。Jaffrey 團(tuán)隊(duì)［111］于2022 年報(bào)道了一種熒光DNA 適配體適配體Lettuce，可以有100倍左右的激活效果，其激活的染料是DFHBI-1 T，與作為熒光RNA 適配體的Spinach的染料DFHBI相似，都是模擬GFP熒光團(tuán)HBI的染料分子。聶舟團(tuán)隊(duì)［117］報(bào)道了一組類似于RFP發(fā)色團(tuán)的全新多色發(fā)色團(tuán)的設(shè)計(jì)，證明了G四聯(lián)體可以將DFHBFSI 等RFP 發(fā)色團(tuán)類似物封裝入G 四聯(lián)體形成的空隙空間中，其激發(fā)波長跨越了583~668 nm，幾乎覆蓋了整個(gè)RFP 家族的熒光波段。

Table 4 Common sequences of G-quadruplex and their structural types表4 常見的G四聯(lián)體的序列及其結(jié)構(gòu)類型

Table 5 Fluorescent DNAs and fluorophore ligands表5 目前已報(bào)道的熒光DNA適配體及其熒光團(tuán)配體

本文整理了目前已有的熒光DNA 適配體及其配體在光譜上的分布（圖4a）以及各熒光DNA 適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬結(jié)果（圖4b）。相較于熒光RNA 適配體領(lǐng)域已開發(fā)出Spinach、Broccoli 和Pepper 等一批性質(zhì)優(yōu)秀的適配體而言，目前熒光DNA適配體的發(fā)展仍不足，尚有需要改善的空間，比如進(jìn)一步開發(fā)出堿基數(shù)少、分子質(zhì)量小、高熒光激活倍數(shù)且高親和力的適配體。而且需要注意的是，熒光核酸適配體通常需要鎂離子的激活，但是不同的熒光核酸適配體對于鎂離子的需求濃度不同，因此開發(fā)出低鎂離子依賴以及鎂離子不依賴的熒光核酸適配體亦是未來的發(fā)展需求。

Fig. 4 The spectral distribution （a） and secondary structure （b） of fluorescent DNAs圖4 目前已有熒光DNA適配體的光譜分布（a）及二級(jí)結(jié)構(gòu)（b）

綜上，熒光核酸適配體領(lǐng)域中已有一批熒光DNA適配體和熒光RNA適配體被開發(fā)并用作分子生物學(xué)研究的新工具，其中一項(xiàng)重要的應(yīng)用就是目前基于熒光DNA 適配體和熒光RNA 適配體的探針。探針的設(shè)計(jì)策略主要是將熒光核酸適配體的序列設(shè)計(jì)在檢測體系之中，將目標(biāo)酶的催化作用與熒光核酸適配體的合成或降解相關(guān)聯(lián)，使作為輸出信號(hào)的熒光上升或下降，同時(shí)可結(jié)合納米技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)等實(shí)現(xiàn)信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大，大大提高熒光核酸適配體的檢測靈敏度，這對于高通量藥物篩選、體外診斷、預(yù)后監(jiān)測等多個(gè)領(lǐng)域都具有重要意義。

3 基于熒光法的核酸酶學(xué)分析探針的應(yīng)用

基于熒光法的核酸酶學(xué)分析探針在核酸檢測、RNA 代謝檢測以及各種核酸代謝相關(guān)酶的活性分析等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出其強(qiáng)大的優(yōu)勢。相關(guān)領(lǐng)域的檢測會(huì)隨著熒光法的更新與迭代，不斷提高探針檢測的靈敏度、特異性和通用性。研究者可以通過加入非特異性核酸染料來實(shí)現(xiàn)單色的實(shí)時(shí)熒光檢測（圖5a），該方法是有效的，但是不能提供多重靶核酸的即時(shí)檢測，且具有較高的背景熒光。

基于FRET原理的第二代熒光法通過標(biāo)記多種顏色的熒光基團(tuán)，克服了核酸染料不能檢測多重核酸的局限。這其中最著名的方法是分子信標(biāo)法［59］。這種方法可以簡單快速地檢測靶標(biāo)序列［72-73］（圖5b）。然而分子信標(biāo)法的問題在于它需要至少合成含有兩種不同小分子共軛物即熒光染料和猝滅劑的發(fā)夾寡核苷酸，且為了準(zhǔn)確鑒定靶核酸中的關(guān)鍵序列能特異性地與分子信標(biāo)雜交而不與檢測樣品中其他相似序列雜交，需要設(shè)置多組多色的分子信標(biāo)，這需要花費(fèi)大量的時(shí)間和人力，增加了檢測成本。

Fig. 5 Schematic diagram of nucleic acid detection based on fluorescence method圖5 基于熒光法的核酸檢測示意圖

基于熒光核酸適配體原理的第三代熒光法對核酸的檢測有多種策略，有的研究者們通過對熒光DNA適配體（如Lettuce）和熒光RNA適配體（如Pepper、Spinach、Broccoli）進(jìn)行修飾，使其在5'和3'端含有側(cè)翼序列，這些序列可與靶核酸序列雜交［94-95，111，118-120］。通過對熒光核酸適配體進(jìn)行修飾或者將熒光核酸適配體分裂成兩個(gè)無熒光的RNA，縮短關(guān)鍵螺旋莖降低其熱力學(xué)穩(wěn)定性，使熒光核酸適配體無法折疊。當(dāng)側(cè)翼序列與靶核酸結(jié)合時(shí)，適配體可以折疊并產(chǎn)生熒光，大大提高了該方法的特異性。也有研究者將熒光核酸適配體技術(shù)與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)恒溫下信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大實(shí)現(xiàn)高特異性和高靈敏度的miRNA 檢測。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已經(jīng)形成了一個(gè)龐大的家族，包括滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（EXPAR）、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）、催化發(fā)夾裝配（CHA）、鏈置換擴(kuò)增（SDA）、雙鏈特異性核酸酶信號(hào)擴(kuò)增（DSNSA） 及其環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等，這些技術(shù)的實(shí)現(xiàn)主要依賴于酶的聚合作用、水解反應(yīng)或無酶鏈替換過程［121-125］（圖5c）。

熒光法在核酸檢測和RNA代謝、DNA代謝相關(guān)酶活檢測方面發(fā)揮著重要作用，為分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程方面提供了重要的支持。接下來，將以T7 RNA 聚合酶、甲基轉(zhuǎn)移酶和T4 多核苷酸激酶等為例，具體討論三代熒光檢測法的區(qū)別與聯(lián)系。

3.1 T7 RNA聚合酶的活性檢測

T7 RNA 聚 合 酶（T7 RNA polymerase，T7 RNAP） 可 催 化從5'到3'方 向的RNA 合 成。T7 RNAP已廣泛應(yīng)用于原核生物和真核生物中的高水平基因表達(dá)，也被用于RNA干擾、RNA編輯、合成基因電路、構(gòu)建Vaccinia/T7 混合系統(tǒng)等。T7 RNAP是體內(nèi)和體外方法中廣泛使用的最重要的酶之一，檢測T7 RNA聚合酶的活性對于分子生物學(xué)和生物工程領(lǐng)域具有重要意義［126］。

3.1.1基于核酸染料法的酶活性檢測

SYBR Green II是可以非特異性結(jié)合RNA的核酸染料，有研究者使用該染料對T7 RNA聚合酶突變體文庫進(jìn)行高通量篩選：加入修飾的NTP 底物和含有T7啟動(dòng)子的雙鏈DNA模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后使用DNA 核酸酶I 消化模板，加入RNA 染料SYBR Green II，只有成功轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生產(chǎn)物的孔會(huì)被檢測到熒光，最后獲得了一個(gè)對2-甲基硒修飾的NTP耐受度更高的T7 RNA聚合酶突變體。該方法直觀簡單，但是具有較高的背景熒光（圖6a）。

3.1.2基于FRET原理的熒光探針法的酶活性檢測

有研究者使用T7 RNA 聚合酶將熒光rUThioTP殘基直接摻入RNA 中，隨后用T7 RNA 聚合酶將rUamiTP 殘基直接引入RNA 中，然后與亞基丙二腈烯胺（P3）反應(yīng)。所得到的多重標(biāo)記RNA在RNA中的兩個(gè)熒光標(biāo)記之間表現(xiàn)出FRET，當(dāng)RNA從單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為G 四聯(lián)體時(shí)，F(xiàn)RET 信號(hào)強(qiáng)度增加。這種使用RNA 聚合酶將位點(diǎn)特異性FRET 標(biāo)記到RNA中的方法提示了在RNA中的預(yù)定位置進(jìn)行其他不同位點(diǎn)特異性修飾的可能性（圖6b，c）。還有研究者利用T7 轉(zhuǎn)錄期間從起始到延伸轉(zhuǎn)變過程中的構(gòu)象變化，使得供體和受體之間的距離發(fā)生改變，從而發(fā)生熒光的變化。這種方法相比于核酸染料法大大提高了特異性，但是由于需要體外合成或引入熒光團(tuán)等，操作復(fù)雜［126-127］。

3.1.3基于熒光核酸適配體法的酶活性檢測

研究者將熒光RNA適配體引入T7 RNAP活性的檢測方案，將Broccoli的反向互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)在轉(zhuǎn)錄模板中。當(dāng)T7 RNAP 不存在時(shí)，體系中不會(huì)有熒光RNA適配體的產(chǎn)生即不會(huì)有熒光；當(dāng)T7 RNA聚合酶存在時(shí)，隨著轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Broccoli 不斷產(chǎn)生，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，并且熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與T7 RNAP的活性關(guān)聯(lián)。這種方案可以方便地應(yīng)用于各種噬菌體來源的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，并為開發(fā)更優(yōu)的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)提供平臺(tái)（圖6d）。該方法無需化學(xué)合成、體外標(biāo)記等操作，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，且由于熒光RNA 適配體的高熒光激活倍數(shù)使得該方法的檢測靈敏度極高［128］。

3.2 甲基轉(zhuǎn)移酶的活性檢測

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNA MTase）能夠?qū)⒓谆鵖-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）遷移到目標(biāo)腺嘌呤或胞嘧啶殘基，從而在DNA 識(shí)別中發(fā)揮重要作用［129］。

3.2.1基于核酸染料的酶活性檢測

研究者結(jié)合甲基化特異性和基于SYBR Green的熒光定量PCR 進(jìn)行O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移 酶 （O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT）啟動(dòng)子甲基化分析。這種技術(shù)是一種高度特異性、靈敏且可重復(fù)的方法，它不僅可以定量測定完全甲基化的序列，而且可以根據(jù)百分比定量測定完全未甲基化的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的MGMT DNA 種類。該方法操作復(fù)雜，耗時(shí)長，且只能檢測單重信號(hào)［130］。

Fig. 6 Schematic diagram of T7 RNA polymerase activity detection based on fluorescence method圖6 基于熒光法的T7 RNA聚合酶活性檢測示意圖

3.2.2基于FRET原理的熒光探針的酶活性檢測

研究者通將分子信標(biāo)與酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)相結(jié)合，利用甲基轉(zhuǎn)移酶與核酸內(nèi)切酶（如DpnI 和Nt.AlwI）的序列識(shí)別特異性，將限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)到模板中，在甲基轉(zhuǎn)移酶存在時(shí)觸發(fā)切割效應(yīng)伴隨熒光增強(qiáng)，當(dāng)甲基轉(zhuǎn)移酶不存在時(shí)熒光不增加（圖7b）。該方法對于人體無損傷，檢測時(shí)間短，特異性強(qiáng)，可以設(shè)置多重?zé)晒鈾z測［131］。

3.2.3基于熒光核酸適配體的酶活性檢測

檢測原理與基于FRET的熒光探針法類似，不同點(diǎn)在于，熒光核酸適配體法中無需再添加化學(xué)合成的含有熒光團(tuán)標(biāo)記的探針，而是利用G四聯(lián)體形成的DNA 酶與凝血酶的顯色反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測策略（圖7a），原理簡單，而且該方法中G 四聯(lián)體序列可以替換為熒光強(qiáng)度更高的NG16、CV30S、ZnP1.2、Apt5.9-32 或者Lettuce 等熒光DNA 適配體，該方法是一種具有通用性的原理簡單、操作容易、無標(biāo)記的檢測甲基化酶活性的方法［132］。

Fig. 7 Schematic diagram of methyltransferases activity detection based on fluorescence method圖7 基于熒光法的甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測示意圖

3.3 T4多核苷酸激酶的活性檢測

T4 多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 PNK）可以促進(jìn)核酸5'端的磷酸化，參與細(xì)胞修復(fù)受損的DNA。有研究表示DNA連接酶和多核苷酸激酶的活性與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此針對它們的活性研究是很有必要的。

3.3.1基于核酸染料的酶活性檢測

研究者于2018年開發(fā)出一種使用SYBR Green I核酸染料的DNA 連接酶和磷酸激酶觸發(fā)的超分支滾環(huán)擴(kuò)增（HRCA）熒光檢測平臺(tái)，在這個(gè)體系下如存在T4 PNK便可以將所示探針環(huán)化，并作為模板開啟HRCA，產(chǎn)生大量雙鏈DNA，其與SYBR Green I結(jié)合后熒光顯著增強(qiáng)（圖8a，b）。

3.3.2基于FRET原理的熒光探針的酶活性檢測

研究人員開發(fā)了一種一步法、靈敏快速的熒光分析T4 PNK活性的方法，該方法采用環(huán)狀分子信標(biāo)熒光探針（圖8c）。在T4 PNK 存在的情況下，與探針互補(bǔ)的兩個(gè)短寡核苷酸中的一個(gè)被磷酸化，導(dǎo)致DNA 連接酶促進(jìn)與另一個(gè)寡核苷酸的連接，在連接的DNA 和分子信標(biāo)之間形成穩(wěn)定的雙鏈后構(gòu)成了完整的切刻酶酶切位點(diǎn)，伴隨著切刻酶的輔助作用，熒光信號(hào)得以產(chǎn)生和富集［133］。同時(shí)，研究人員們又開發(fā)了一種結(jié)合核酸外切酶活性和基于分子信標(biāo)的T4 PNK活性檢測策略，該方法是在趙美萍等［134］首次提出的T4 PNK 酶活性檢測方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)和優(yōu)化（圖8d）。在這種方法中，發(fā)夾探針被T4 PNK 磷酸化，然后立即被λ 外切酶切割，DNA片段得以釋放，釋放后的DNA片段與分子信標(biāo)1（MB1）雜交，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。同時(shí)，引入分子信標(biāo)2（MB2）結(jié)合在互補(bǔ)域MB1中，導(dǎo)致T4 PNK傳感的熒光信號(hào)放大［135］。

3.3.3基于熒光核酸適配體的酶活性檢測

底物為5'端和3'端均為磷酸基團(tuán)修飾的單鏈寡核苷酸，T4 PNK在缺失ATP并且存在ADP的情況下，T4 多聚核苷酸激酶可以顯示出磷酸酯酶的活性，可以將3'端的磷酸基團(tuán)切除留下羥基，在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和富含脫氧鳥苷三磷酸的脫氧核苷三磷酸底物存在的情況下引發(fā)聚合反應(yīng)［136］，所得延長的DNA 可形成G 四聯(lián)體，當(dāng)使用硫黃素T作為G四聯(lián)體特異性熒光染料時(shí)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)［137］（圖8e）。

Fig. 8 Schematic diagram of T4 polynucleotide kinase activity detection based on fluorescence method圖8 基于熒光法的T4 多核苷酸激酶活性檢測示意圖

3.4 脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1的活性檢測

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1 （apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1），又稱氧化還原因子1（Ref-1），是人體必需的基因調(diào)控蛋白和DNA 修復(fù)蛋白［138］。作為最重要的DNA 修復(fù)酶，APE1 作用于雙鏈DNA（dsDNA）中的脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)（AP位點(diǎn)）并啟動(dòng)堿基切除修復(fù)（BER）通路［139-140］。APE1 還可以通過其氧化還原功能調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性。以往研究表明，人體血液中APE1含量的異常變化和組織細(xì)胞與多種疾病有關(guān)，例如前列腺癌［141］、肺癌［142］、卵巢癌［143-144］和膀胱癌［145］。因此開發(fā)出有效檢測APE1的酶活性方法對于癌癥診斷、預(yù)后監(jiān)測和抗癌藥物篩選均具有重要意義。

3.4.1基于FRET原理的熒光探針法的酶活性檢測

研究人員們構(gòu)建了一種含有硫代磷酸化修飾的AP 位點(diǎn)的DNA 探針［146］，其在AP 位點(diǎn)3'端的第4個(gè)堿基和AP 位點(diǎn)5'端的第5 個(gè)堿基分別標(biāo)記猝滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)，當(dāng)不存在APE1 酶時(shí)，基于FRET 原理，熒光被猝滅基團(tuán)猝滅，在APE1 存在的情況下，AP位點(diǎn)的5'端的脫氧核糖-磷酸主鏈將被快速切割裂解，含有熒光團(tuán)的短鏈被釋放從而可以檢測到熒光（圖9a）。該方法無需額外的清理或預(yù)處理步驟，簡單快速，一步完成，線性工作范圍為0.1~5.0 U/ml，檢測下限為0.1 U/ml。該方法的靈敏度有限。

隨后有研究人員，優(yōu)化設(shè)計(jì)了新的檢測探針，開發(fā)出TdT和Endo IV輔助的雙信號(hào)放大測酶活力的方法（圖9b）。他們設(shè)計(jì)了3'端進(jìn)行氨基修飾含有AP 位點(diǎn)發(fā)夾狀的DNA，當(dāng)APE1 存在時(shí)，其可以切除發(fā)夾DNA 底物上的AP 位點(diǎn)，生成3'-OH端，此時(shí)TdT可以在3'端繼續(xù)延伸，通過添加三磷酸脫氧腺苷（dATP）使得底物產(chǎn)生大量的poly-A尾。此時(shí)，含有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的poly-T探針（猝滅狀態(tài)）可以大量地雜交在poly-A尾。隨后高溫加熱將APE1 和TdT 失活并加入內(nèi)切酶IV（Endo IV）來切割A(yù)P 位點(diǎn)，產(chǎn)生帶有熒光基團(tuán)的短鏈，隨著其與猝滅基團(tuán)的分離而發(fā)出熒光。當(dāng)體系中不存在APE1 時(shí)，3'端的氨基修飾阻斷了末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的延伸，后續(xù)反應(yīng)不發(fā)生。該方法具有高靈敏度和高選擇性，該方法的檢測下限為1.7×10-3U/L。

3.4.2基于熒光核酸適配體的酶活性檢測

研究人員開發(fā)出基于聚合酶和切刻酶共同輔助的等溫?cái)U(kuò)增方法來檢測APE1酶的活性。在發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針中設(shè)計(jì)AP 位點(diǎn)，當(dāng)APE1 存在時(shí)，產(chǎn)生3'-OH 端此時(shí)在聚合酶克列諾片段（Klenow Fragment）的作用下將模板的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，聚合成雙鏈DNA，產(chǎn)生了切刻酶的酶切位點(diǎn)，伴隨著切刻酶與聚合酶的作用下，促進(jìn)G四聯(lián)體短鏈的指數(shù)生成，G四聯(lián)體可以與NMM結(jié)合發(fā)出熒光（圖9c）。該方法具有高靈敏度，檢出限為6 U/L［147］。但是在此方法中沒有測試其他非特異性核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶的干擾。

最近，研究人員們開發(fā)了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增結(jié)合G四聯(lián)體的高靈敏度和無標(biāo)記地檢測APE1的新方法。標(biāo)記有AP 位點(diǎn)的發(fā)夾探針可以被APE1 識(shí)別并切割，導(dǎo)致引物序列的釋放從而啟動(dòng)RCA 反應(yīng)（圖9d）。RCA的模板上含有G四聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列，因此反應(yīng)中不斷產(chǎn)生含有串聯(lián)的G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的長鏈擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物可與硫黃素T（ThT）結(jié)合產(chǎn)生熒光，實(shí)現(xiàn)APE1 的高靈敏度無標(biāo)記檢測。該方法的檢出限低至1.52×10-3U/L。

3.5 端粒酶的活性檢測

端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，其本身是一種大型核糖核蛋白復(fù)合物，負(fù)責(zé)在線性染色體的3'端逐步合成端粒DNA重復(fù)序列（TTAGGG），從而逆轉(zhuǎn)每一輪復(fù)制中的DNA 丟失［148］。且最近的研究報(bào)道，除了維持端粒外，端粒酶還參與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、WNT/β連環(huán)蛋白信號(hào)、NF-κB信號(hào)、MYC 驅(qū)動(dòng)的腫瘤發(fā)生、DDR、細(xì)胞黏附和遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等活動(dòng)［149-152］，這些端粒酶的功能與腫瘤的發(fā)生過程有重要聯(lián)系。因此，作為一種通用的腫瘤生物標(biāo)志物，研究端粒酶的活性和抑制作用對于癌癥的診斷和治療具有重要意義。

3.5.1基于核酸染料法的酶活性檢測

傳統(tǒng)的TRAP測定需要進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影，以此使典型的六堿基產(chǎn)物階梯可視化，并在光密度測定后定量端粒酶活性。研究者結(jié)合了SYBR Green的熒光定量PCR與傳統(tǒng)的端粒重復(fù)擴(kuò)增方案（TRAP），優(yōu)化了實(shí)時(shí)定量的TRAP測定［153］，但其應(yīng)用受到擴(kuò)增相關(guān)的錯(cuò)誤和耗時(shí)程序的限制。

3.5.2基于FRET原理的熒光探針法的酶活性檢測

為了解決基于PCR 的局限性，雙擴(kuò)增熒光測定法被用于無PCR檢測端粒酶活性［154］。檢測平臺(tái)應(yīng)用了一種拱形結(jié)構(gòu)DNA 探針來專門控制鏈置換反應(yīng)和隨后的酶輔助擴(kuò)增。端粒酶底物引物被端粒酶延伸形成含有多個(gè)TTAGGG 重復(fù)單元的長延伸產(chǎn)物。因此，一個(gè)延伸產(chǎn)物可以通過鏈置換反應(yīng)釋放出多個(gè)觸發(fā)DNA（t-DNA），從而實(shí)現(xiàn)第一次擴(kuò)增。隨后，t-DNA特異性地打開分子信標(biāo)以恢復(fù)熒光。同時(shí)，t-DNA 在切口核酸內(nèi)切酶的幫助下循環(huán)，不斷打開越來越多的分子信標(biāo)，實(shí)現(xiàn)二次擴(kuò)增。該方法能夠測定相當(dāng)于5 個(gè)HeLa 細(xì)胞或10 個(gè)CCRF-CEM細(xì)胞的端粒酶活性。

3.5.3基于熒光核酸的酶活性檢測

研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)了“DNA機(jī)器”，它是一款由T7核酸外切酶（T7 Exo）、無標(biāo)記識(shí)別分子信標(biāo)（RMB）和具有突出5'端的信號(hào)分子信標(biāo)（SMB）組成的探針，用于端粒酶活性的靈敏檢測［155］。首先，端粒酶延長端粒酶底物（TS）引物，產(chǎn)生具有串聯(lián)重復(fù)序列（TTAGGG）n的端粒酶延長產(chǎn)物（TEP）。EP通過與RMB雜交激活DNA機(jī)器，展開具有凹陷 5'端的 RMB，使RMB 從T7 Exo 脫出，發(fā)生T7 Exo 輔助循環(huán)切割，從而釋放完整的TEP和大量DNA 片段（觸發(fā)DNA）。隨后，觸發(fā)DNA特異性打開SMB 并被T7 Exo 回收，釋放出多個(gè)G 四聯(lián)體（G4）結(jié)構(gòu)。最后，TEP 和釋放的G4 結(jié)構(gòu)與N-甲基-中卟啉IX（NMM）強(qiáng)烈相互作用后產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的熒光。以這種方式，每個(gè)端粒酶介導(dǎo)的延伸事件被有效地轉(zhuǎn)化為放大的熒光信號(hào)。該檢測方式能夠測量相當(dāng)于50 個(gè)HeLa 細(xì)胞/ml 的端粒酶活性，線性范圍為50~2 000 個(gè)細(xì)胞/ml，相較其他方式大大提高了靈敏度。

3.6 8-羥基鳥嘌呤DNA糖基化酶的活性檢測

由ROS 促成的氧化產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤（8-oxoG）是DNA 中發(fā)現(xiàn)的最普遍的堿基損傷。8-羥基鳥嘌呤DNA 糖基化酶（OGG）是一種關(guān)鍵的堿基切除修復(fù)（BER）酶，可以識(shí)別8-oxoG 并從DNA 中切除［156］。OGG 的表達(dá)水平與多種人類癌癥密切相關(guān)，包括肺癌、胃癌、膽囊癌和膀胱癌［157-160］。

3.6.1基于核酸染料法的酶活性檢測

研究者開發(fā)了一種簡單的混合讀取測定法，使用多重循環(huán)酶促修復(fù)擴(kuò)增來靈敏檢測hOGG1［161］。hOGG1 活性產(chǎn)生一個(gè)AP 位點(diǎn)，AP 位點(diǎn)會(huì)被脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（APE1）切割，產(chǎn)生帶有游離基團(tuán)的底物片段3'-OH端。底物片段可以啟動(dòng)循環(huán)酶促修復(fù)擴(kuò)增，指數(shù)級(jí)地產(chǎn)生觸發(fā)器，并使用SYBR Green II 作為熒光染料可以簡單地檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法可以靈敏地測量hOGG1，檢測限為2.97×10-2U/L。

3.6.2基于FRET原理的熒光探針法的酶活性檢測

研究者開發(fā)了一種基于自主核酸外切酶III（Exo III）輔助信號(hào)放大的酶活性檢測技術(shù)，構(gòu)建了用于hOGG1 活性檢測的新型高靈敏度熒光生物傳感平臺(tái)［162］。發(fā)卡探針HP1在8-oxoG位點(diǎn)被切割并被Exo III 消化，釋放觸發(fā)DNA 片段（tDNA1）。tDNA1 與發(fā)卡探針HP2 部分雜交，啟動(dòng)Exo III 循環(huán)切割，釋放另一個(gè)觸發(fā)DNA片段（tDNA2），進(jìn)而觸發(fā)DNA 熒光探針（FP）的循環(huán)切割，從而釋放大量熒光信號(hào)，用于hOGG1 活性檢測?；跓晒馓结樀拿富顧z測具有高靈敏度以及良好的選擇性，直接測量檢測限低至1 U/L，并具有等溫實(shí)驗(yàn)條件、簡單和方便的優(yōu)點(diǎn)。

3.6.3基于熒光核酸的酶活性檢測

研發(fā)團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種利用λ外切核酸酶切割進(jìn)行DNA 糖基化酶活性測定的方法［163］。hOGG1 選擇性地切割含有8-oxoG的DNA雙鏈體時(shí)，能夠生成具有5'-PO4端的新DNA雙鏈體，從而被λ外切核酸酶消化，釋放出游離的G四聯(lián)體單鏈，并與血紅素結(jié)合形成具有催化活性的G 四聯(lián)體-血紅素DNAzyme。DNAzyme可以催化形成ABTS-，因此hOGG1的活性能夠通過紫外-可見光指示吸收強(qiáng)度來進(jìn)行靈敏的定量測定，線性范圍從0.05~32 U/ml，檢測限0.01 U/ml。

3.7 尿嘧啶DNA糖基化酶的活性檢測

尿嘧啶DNA 糖基化酶（UDG）是一種高度保守的損傷修復(fù)蛋白，能夠通過糖基化酶活性啟動(dòng)堿基切除修復(fù)途徑，切除尿嘧啶堿基［164］。UDG在維持細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、病毒增殖等基因組完整性方面起著關(guān)鍵作用［165］。DNA糖基化酶的異常表達(dá)與人類多種疾病密切相關(guān)，如人類免疫缺陷、布盧姆綜合癥、癌癥等［166-169］。因此，UDG的檢測對于研究許多基本生化過程的機(jī)制和功能以及疾病診斷尤其重要。

3.7.1基于核酸染料法的酶活性檢測

在眾多基于核酸染料法中，研究者們?yōu)楦_的UDG 檢測方式設(shè)計(jì)了各種核酸擴(kuò)增的方式，包括雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）［170］、催化發(fā)夾組裝（CHA）［171］、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（EXPAR）［172］、鏈置換擴(kuò)增（SDA）［173-174］和滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）［165，175-176］。但這些方法往往伴隨著復(fù)雜的探針設(shè)計(jì)和反應(yīng)步驟。其中，自啟動(dòng)多重RCA 法獲得的檢測靈敏性較高［165］，線性范圍為0.05~1.25 U/L，檢出限為1.7×10-2U/L。

3.7.2基于FRET原理的熒光探針法的酶活性檢測

多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了利用分子信標(biāo)檢測尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的策略。2007年時(shí)，就有研究團(tuán)隊(duì)利用FRET原理檢測UDG酶活［177］。雙鏈探針由P1 和P2 兩條反向互補(bǔ)鏈組成：一條標(biāo)記DABCYL 作為受體，另一條標(biāo)記TAMRA 作為供體，中間位置有四個(gè)尿嘧啶堿基。當(dāng)UDG 添加至體系中時(shí)，具有4個(gè)AP位點(diǎn)的P1P2探針因熔化溫度降低而被分離，從而發(fā)出熒光信號(hào)，低檢測限為33 U/L。雖然這種檢測方式較傳統(tǒng)方法在靈敏度與簡便性上有所突破，但依舊受限于復(fù)雜環(huán)境下的不穩(wěn)定性。

2014 年，研究者報(bào)道了一種基于尿嘧啶修飾的分子信標(biāo)，探針的莖中僅包含兩個(gè)尿嘧啶堿基（6個(gè)堿基對），非常適合作為UDG的底物［178］。尿嘧啶被切除后，產(chǎn)生的AP位點(diǎn)將顯著降低分子信標(biāo)的熔化溫度，并且由此產(chǎn)生的熒光團(tuán)標(biāo)記信標(biāo)與互補(bǔ)鏈解離，使得熒光顯著增加。該方法無需擴(kuò)增，低檢測限為5 U/L。

3.7.3基于熒光核酸的酶活性檢測

研發(fā)團(tuán)隊(duì)利用G四聯(lián)體DNAzyme鏈（GS）被UDG活性激活的設(shè)計(jì)，開發(fā)了一種比色測定UDG活性的無酶和無標(biāo)記策略［179］。該策略依賴于目標(biāo)激活的立足點(diǎn)介導(dǎo)的鏈置換（TMSD）電路，采用由含尿嘧啶鏈（US）和催化劑鏈（CS）組成的檢測雙鏈探針。樣品中存在的UDG會(huì)切割US內(nèi)的尿嘧啶堿基并破壞檢測雙工探針的穩(wěn)定性，釋放CS。游離CS 促進(jìn)TMSD 反應(yīng)，從而釋放出最初被阻斷鏈（BS）籠罩的G 四聯(lián)體DNAzyme 鏈（GS）。大量GS 被UDG 活性激活，并且通過釋放的GS 的過氧化物酶模擬活性促進(jìn)的ABTS氧化產(chǎn)生明顯的比色信號(hào)?；谶@一設(shè)計(jì)原則，能夠非常靈敏且選擇性極佳地檢測到UDG 活性。通過可靠地測定人血清中的UDG 活性也證明了該測定的實(shí)際適用性。該方法的檢測限低至6 U/L。

綜上，無論是基于熒光RNA 適配體的酶活性檢測方法還是基于熒光DNA 適配體的酶活性檢測方法，其本質(zhì)都是一樣的，即利用熒光適配體實(shí)現(xiàn)高特異性、高靈敏度、無標(biāo)記的實(shí)時(shí)熒光定量檢測酶的活性，且上述體系由于其原理簡單、合成容易、成本低廉、方法特異性強(qiáng)、檢測靈敏等優(yōu)點(diǎn)，相較于非特異性的核酸染料法以及TaqMan 探針法展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。因此，基于熒光核酸適配體的方法具備用于新型高通量藥物篩選和臨床即時(shí)診斷的高通量分析的潛力和實(shí)力。

4 總結(jié)與展望

本文從比色法、高效液相色譜法、放射性標(biāo)記法、凝膠電泳法、電化學(xué)法、酶聯(lián)免疫吸附法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法等傳統(tǒng)酶活性檢測方法講起，分別比較了各個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)。目前這些方法具有操作復(fù)雜、對儀器的要求高、具備放射性危害、靈敏度低等限制性因素，很難進(jìn)行高通量、高靈敏度、高特異性以及低成本的檢測。本文將熒光法按照其發(fā)展歷史分為熒光染料法、基于FRET原理的特異性探針法和熒光核酸適配體法（表6），把這3種熒光檢測方法的優(yōu)勢、劣勢、代表性研究以及作用原理進(jìn)行了整理。

Table 6 Comparison of three fluorescence methods表6 三種熒光法比較

基于遺傳編碼的熒光核酸適配體檢測方法的最大優(yōu)勢就是其原理簡單、成本低廉、特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、安全性好以及易于實(shí)現(xiàn)高通量等優(yōu)勢。熒光核酸適配體將會(huì)在接下來的時(shí)間中，逐漸接過核酸染料和TaqMan 探針的接力棒，為酶活性檢測這一領(lǐng)域開展新的篇章。熒光核酸適配體法在酶學(xué)分析與檢測上有著前所未有的熱度，不同于無法穿過細(xì)胞膜的核酸染料、需要體外合成的TaqMan 等探針，分子質(zhì)量小、設(shè)計(jì)靈活的遺傳編碼的熒光核酸適配體可以在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高時(shí)空分辨率的成像，直觀地展現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)核酸代謝的精確位置和數(shù)量，為核酸代謝相關(guān)酶的體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境的功能研究提供更好的機(jī)遇。

目前來說，熒光RNA 適配體的發(fā)展已取得了長足的進(jìn)步，并在活細(xì)胞成像領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力，評(píng)價(jià)熒光RNA 適配體的性質(zhì)需要從染料背景熒光、光穩(wěn)定性、親和力以及生物正交性等多方面進(jìn)行考察，比如熒光RNA 適配體Mango 和Pepper具有較高的親和力（納摩爾級(jí)別）。然而，已有報(bào)道的生物傳感器大多基于早期開發(fā)的熒光RNA 適配體，且目前基于RNA 相關(guān)酶的酶活性檢測方法受限于針對酶作用機(jī)制的研究。熒光核酸適配體目前在應(yīng)用過程中存在的不足有以下幾點(diǎn)。

首先，目前在各個(gè)領(lǐng)域，包括酶活檢測領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛的熒光DNA 適配體均為G 四聯(lián)體，檢測時(shí)加入NMM、TO等G四聯(lián)體的通用染料。G四聯(lián)體是由Hoogsteen氫鍵連接4個(gè)G形成環(huán)狀平面，兩層或以上的四分體通過π-π堆積形成四聯(lián)體，因此鏈與鏈之間存在相互作用，當(dāng)把不同種類的G四聯(lián)體放在同一體系中，極易發(fā)生分子之間的錯(cuò)誤交聯(lián)。這樣的錯(cuò)誤交聯(lián)一旦發(fā)生，一個(gè)是無法形成正確的G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)也就無法檢測到熒光。另外，目前沒有只針對某種G四聯(lián)體染料響應(yīng)的序列，大多數(shù)的染料均為G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)依賴型的通用染料，例如研究者們開發(fā)出的熒光DNA 適配體DAP-10-42是基于dapoxyl SEDA 篩選得到的，但是有研究證明它對多種芳基甲烷類染料均有激活效果，其中對于AO［107］的激活效果達(dá)2 070倍，激活倍數(shù)高于其篩選的靶標(biāo)染料（722 倍）?；谏鲜鰞蓚€(gè)原因，當(dāng)前已有的熒光DNA適配體很難實(shí)現(xiàn)生物正交性，即同一體系中很難存在2 個(gè)及以上的不同的G 四聯(lián)體。

其次，應(yīng)用熒光核酸適配體設(shè)計(jì)的各種探針，在其基于熒光核酸適配體的信號(hào)輸出階段需要依賴熒光核酸適配體的正確折疊。熒光核酸適配體發(fā)揮功能需要其形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如果二級(jí)結(jié)構(gòu)無法正常形成，那么熒光核酸適配體不能折疊成具有激活染料功能的二級(jí)結(jié)構(gòu)，則無法產(chǎn)生熒光。Baldrich 等［180］探究了基于適配體的生物傳感器在不同的金屬離子濃度、不同溫度等條件下受到的影響。因此，如果溶液中離子濃度、溫度、pH 等環(huán)境不能滿足熒光核酸適配體的要求，則熒光核酸適配體無法正常折疊，最終會(huì)影響熒光強(qiáng)度的檢測。

最后，高性能的熒光核酸適配體開發(fā)難度極大，這是目前熒光核酸適配體的應(yīng)用受限的一大原因。目前已報(bào)道的熒光核酸適配體，尤其是熒光DNA 適配體，其與染料配體結(jié)合后的熒光亮度較低、親和力較弱等自身固有的性質(zhì)仍待改進(jìn)［104-116］。研究者們應(yīng)用熒光核酸適配體進(jìn)行檢測、分析的過程中，會(huì)發(fā)現(xiàn)其檢測限受到極大的限制，雖原理簡單操作方便，但是基于目前已報(bào)道的熒光核酸適配體很難實(shí)現(xiàn)單分子檢測。

基于上述，本文對于熒光核酸適配體的發(fā)展進(jìn)行如下展望：a. 當(dāng)前的熒光核酸適配體篩選的方法較為傳統(tǒng)而且周期長，因此需要優(yōu)化熒光核酸適配體的篩選策略，建立周期短、通用性強(qiáng)的篩選平臺(tái)； b. 目前基于熒光核酸適配體的生物探針主要以“分裂式”、“二聚體式”、“倒置融合”和“環(huán)狀排序”等形式進(jìn)行設(shè)計(jì)檢測microRNA、腫瘤標(biāo)記物等，需加強(qiáng)基于熒光核酸適配體的生物探針的開發(fā)力度；c. 開發(fā)基于熒光核酸適配體的活細(xì)胞上高時(shí)空分辨率的成像，直觀地展現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)核酸代謝的精確位置和數(shù)量，為核酸代謝相關(guān)酶的體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境的功能研究貢獻(xiàn)更多策略；d. 目前熒光核酸適配體尤其是熒光RNA 適配體已經(jīng)基本覆蓋可見光光譜的各個(gè)波段，但是近紅外、遠(yuǎn)紅外波段上的熒光DNA適配體和熒光RNA適配體數(shù)量較少，應(yīng)該拓展當(dāng)前熒光核酸適配體的光譜波長，豐富熒光核酸適配體的種類和數(shù)量以及正交型熒光核酸適配體對，實(shí)現(xiàn)多重檢測與疾病診斷；e. 針對酶的作用機(jī)制研究需要更加深而廣，才能更加有助于研究者們基于不同種類的酶的特有性質(zhì)設(shè)計(jì)針對性更強(qiáng)的酶活性檢測體系，從而搭建基于熒光核酸適配體的核酸代謝新型藥物篩選平臺(tái)；f. 熒光DNA 適配體相較于熒光RNA 適配體具有更加穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，因此熒光DNA 適配體未來將在成為醫(yī)學(xué)診斷和預(yù)后診斷中扮演更加重要的角色。

熒光核酸適配體的開發(fā)仍然在不斷進(jìn)行，未來核酸適配體有望在生物化學(xué)分析、優(yōu)勢酶的定向進(jìn)化、活細(xì)胞成像、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域?yàn)閷?shí)驗(yàn)人員提供更廣闊穩(wěn)定的平臺(tái)。研究者們將進(jìn)一步豐富熒光核酸適配體的工具庫，拓展其在生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。