劉慧斌　朱周俊　趙君茹　盧元賢　吳凱　袁德義

關(guān)鍵詞：高州油茶；葉片；解剖結(jié)構(gòu)；耐熱性

中圖分類號：S794.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

高州油茶（Camellia gauchowensis Chang）屬山茶科（Theaceae）、山茶屬（Camellia）常綠喬木。具有樹形高大、壽命長、果實(shí)大、單株產(chǎn)量高、出油率高等優(yōu)點(diǎn)，主要分布在我國廣東大部分地區(qū)和海南等地區(qū)[1-2]。油茶的正常生長發(fā)育需要適宜溫度和充足的水分，溫度過低或者過高都會影響果實(shí)生長。近年來全球氣候變暖，溫度持續(xù)升高，當(dāng)溫度高過植物承受的范圍，植物就會受害，產(chǎn)量就會降低，因此研究油茶耐熱性，選育出耐熱性較強(qiáng)的樹種相當(dāng)重要。

目前有關(guān)耐熱性的研究主要集中在生理生化的水平上，研究高溫脅迫條件下的相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性等變化，反映植物的耐熱性強(qiáng)弱[3-4]。植物的生理生化指標(biāo)在短期內(nèi)環(huán)境的變化較為明顯，而植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)是長期特定環(huán)境下形成的，也可以作為研究耐熱性的參考指標(biāo)[5]。葉片是植物進(jìn)行光合作用、呼吸作用和蒸騰的重要器官，葉片表皮是直接與外界接觸的組織，對高溫變化較為敏感，葉片表皮結(jié)構(gòu)的變化也能反映植物對環(huán)境的適應(yīng)能力，葉片是研究耐熱性的主要器官[6]。目前，有關(guān)葉片解剖結(jié)構(gòu)與植物耐熱性的研究在礬根[3]、洋水仙[4]、珙桐[7]、獼猴桃[8]、杜鵑花[9]、報春[10]等植物上已有報道。而有關(guān)對油茶葉片解剖結(jié)構(gòu)與耐熱性關(guān)系的研究較少，僅陳萍等[11]在海南油茶開展了相關(guān)研究。有關(guān)高州油茶葉片解剖結(jié)構(gòu)與其耐熱性關(guān)系的研究未見報道。本研究以6 個高州油茶無性系為試材，觀察比較不同高州油茶無性系葉片形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)和氣孔的相關(guān)指標(biāo)，運(yùn)用相關(guān)性分析和隸屬函數(shù)法對其耐熱性進(jìn)行綜合評價，為高州油茶耐熱品種的選育、引種栽培等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2020 年9 月在廣東省清遠(yuǎn)市古朕茶油發(fā)展有限公司高州油茶資源圃進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)材料為6 個高州油茶無性系，編號分別為HM19、HMZ25、HMZ24、A11、A5 和A16。

1.2 方法

1.2.1 葉片形態(tài)測量 隨機(jī)挑選30 片葉片，利用圖像掃描儀對所選葉片進(jìn)行掃描， 采用Image-Pro-plus 軟件測量葉片的長度、寬度和葉片面積。

1.2.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)測定 采用石蠟切片法進(jìn)行葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)制作：取出經(jīng)卡諾固定液固定后的葉片，經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋制成切片（厚度8 μm）、番紅固綠染色、封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

采用Image-Pro-plus 軟件測量其葉片厚度（leaf thickness， LT）、上表皮厚度（upper epidermisthickness， TU）、下表皮厚度（lower epidermisthickness， TL）、柵欄組織厚度（thickness ofpalisade tissue， TP）、海綿組織厚度（thickness of spongy tissue， TS）、主脈厚度（thickness of mainvein， TMV）、木質(zhì)部厚度（xylem thickness， XT）、韌皮部厚度（phloem thickness， PT）和維管束厚度（vascular bundle thickness， VB）。計(jì)算柵海比（palisade tissue-spongy tissue ratio， P/S）、葉片緊實(shí)度（tightness of tissue structure， TST）、葉片疏松度（looseness of tissue structure， TSL）及變異系數(shù)（coefficient of variation， CV）。其中，柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度；葉片組織緊實(shí)度=柵欄組織厚度/葉片厚度；葉片結(jié)構(gòu)疏松度=海綿組織厚度/葉片厚度。

1.2.3 氣孔觀察 采用指甲油印記法制片，在顯微鏡及其成像系統(tǒng)下觀察、拍照[12] 。采用Image-Pro-plus 軟件測量氣孔密度（stomatal density，SD）和氣孔長度（stomatal length， SL）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理和簡單的分析，采用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和系統(tǒng)聚類分析。相關(guān)指數(shù)公式[13-14]為：

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片形態(tài)特征

6個高州油茶無性系的葉長、葉寬、葉面積均存在顯著差異（P<0.05，表1）。葉長在6.73～9.16 cm之間，平均為8.17 cm，A11 最長，A5 最短；葉寬在3.40～4.50 cm 之間，平均為3.86 cm，HMZ25葉片最寬，A5 葉片最窄；葉面積變化范圍為16.58～26.71 cm2，其中HMZ25 葉面積最大，A5葉面積最小。A5 的葉長、葉寬、葉面積均為最小。

2.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 葉表皮和氣孔 高州油茶葉片結(jié)構(gòu)由上表皮細(xì)胞、柵欄組織、海綿組織和下表皮細(xì)胞組成（圖1）。油茶葉片為異面葉，上表皮和下表皮均由一層長形、圓形、橢圓形細(xì)胞緊密排列組成，且上表皮厚度均大于下表皮。氣孔位于下表皮，氣孔為橢圓形或者扁圓形（圖2）。

6 個高州油茶無性系上表皮最厚為HM19，厚度35.11 μm，下表皮最厚為HM19，厚度21.61 μm；上下表皮最薄為A5，分別為23.13、13.85 μm。油茶氣孔分布在下表皮，6 個高州油茶無性系葉片氣孔密度在126.75～183.09 個/mm2 范圍內(nèi)，氣孔長度為24.61～30.33 μm。氣孔密度最大為HMZ25，最小為A16。氣孔長度最長為A16，最短為HMZ24（表2）。

2.2.2 葉肉組織結(jié)構(gòu) 6 個高州油茶無性系的柵欄組織和海綿組織形態(tài)有明顯差異（圖1）。其中HMZ24 和A5 的柵欄組織由兩層細(xì)胞組成，HMZ24 兩層?xùn)艡诮M織長度相近，排列疏松，A5上層?xùn)艡诮M織要長于下層，上層排列緊密，緊挨海綿組織的下層?xùn)艡诮M織排列疏松。HM19、HMZ25、A11、A16 只有一層?xùn)艡诮M織，HM19柵欄層細(xì)胞細(xì)長且排列較緊密，HMZ25、A11、A16 柵欄層細(xì)胞短粗且排列疏松。海綿組織排列疏松，細(xì)胞大小和形狀明顯不同。

高州油茶的葉肉解剖結(jié)構(gòu)存在顯著性差異（表3）。6 個高州油茶無性系的柵欄組織厚度在82.43～137.41 μm 范圍內(nèi)，其中最大為HMZ24，最小為HMZ25。海綿組織厚度變化范圍在153.63～183.47 μm 之間，厚度最大為HM19，最小為A16。海綿組織厚度均明顯高于柵欄組織厚度，柵海比均小于1，在0.49～0.90 之間，最大為A16，最小為HM19。葉片結(jié)構(gòu)緊實(shí)度范圍在0.27～0.41 之間，最大為A16，最小為HM19。葉片疏松度范圍在0.46～0.58 之間，最大為HMZ25，最小為A16。

2.2.3 主脈組織結(jié)構(gòu) 主脈主要由上下兩層表皮細(xì)胞、排列緊密的厚角組織、半月形輻射狀排列的木質(zhì)部、韌皮部組成（圖3）。對6 個高州油茶無性系主脈組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，主脈厚度、木質(zhì)部厚度、韌皮部厚度、維管束厚度均達(dá)到顯著差異水平（表4）。6 個油茶無性系主脈厚度在566.23～821.28 μm 范圍內(nèi)，最大為A16，最小為HMZ24。維管束厚度在262.12～403.07 μm范圍內(nèi)，最大為A16，最小為A11。

2.3 6 個高州油茶無性系耐熱性綜合評價

2.3.1 篩選高州油茶耐熱性指標(biāo) 高州油茶的葉片指標(biāo)在品系間達(dá)到顯著性差異，選出具有代表性的指標(biāo)來代表耐熱性。首先對6 個高州油茶無性系葉片形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)的14 項(xiàng)指標(biāo)運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行聚類分析，14 項(xiàng)指標(biāo)可以分為4 類：第1 類包括葉長、葉寬、葉面積；第2 類包括葉厚、柵欄組織厚度、葉片結(jié)構(gòu)緊實(shí)度、柵海比；第3類包括上表皮厚度、下表皮厚度、葉片結(jié)構(gòu)疏松度、海綿組織厚度、氣孔密度；第4 類包括主脈厚度和維管束厚度（圖4）。運(yùn)用SPSS 軟件對14項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，獲得相關(guān)系數(shù)矩陣（表5）。指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)反映了各指標(biāo)間的相關(guān)性。根據(jù)聚類分析結(jié)果和相關(guān)矩陣，按照公式（1）計(jì)算4 類中各指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)，然后根據(jù)相關(guān)指數(shù)大小對其進(jìn)行排序（表6）。4 類指標(biāo)中的典型指標(biāo)分別為：第1 類為葉面積；第2 類為柵欄組織厚度；第3 類為海綿組織厚度；第4 類為維管束厚度（表6）。

2.3.2 6 個高州油茶無性系耐熱性綜合評價 根據(jù)表6 篩選出的耐熱性密切相關(guān)的4 項(xiàng)指標(biāo)（葉面積、柵欄組織厚度、海綿組織厚、維管束厚度），應(yīng)用隸屬函數(shù)法，運(yùn)用公式（2）、（3），求出平均隸屬函數(shù)值，對6 個油茶無性系的耐熱性進(jìn)行綜合評價。隸屬函數(shù)值越大，耐熱性越強(qiáng)。結(jié)果表明6 個高州油茶無性系的平均隸屬值在0.125～0.793 之間，其中A16 平均隸屬值最高，為0.793，HMZ25 平均隸屬度最低，為0.125。6 個油茶無性系耐熱性強(qiáng)弱依次為：A16>A5>HMZ24>A11>HMZ19>HM25（表7）。

3 討論

溫室效應(yīng)導(dǎo)致氣候變暖，溫度升高會使植物產(chǎn)生熱害，直接影響植物的外部形態(tài)和植物體內(nèi)活性酶以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[15]，植物的光合作用也會受到影響[16]。植物葉片是直接感受外界環(huán)境變化最大的器官，對外界環(huán)境的變化較為敏感，是植物進(jìn)化過程中可塑性最大的器官，其結(jié)構(gòu)特征能夠在一定程度上體現(xiàn)植物本身對所在環(huán)境的適應(yīng)性變化，長期的高溫對植物葉片造成外部形態(tài)以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[17]。

不同無性系的高州油茶的柵欄組織厚度、維管束厚度、海綿組織和葉面積與耐熱性的排序基本一致，油茶耐熱性與柵欄組織厚度、維管束厚度呈正相關(guān)，與海綿組織厚度和葉面積呈負(fù)相關(guān)。柵欄組織厚度大小順序?yàn)椋?A16>A5>A11>HMZ25，海綿組織厚度大小順序?yàn)椋篐MZ25>A11>A5>A16，柵欄組織厚度較大，海綿組織厚度較小，耐熱性較強(qiáng)，與前人結(jié)果[7， 9， 18]相似，柵欄組織可以增強(qiáng)植株在光合作用中對水分和光能的利用效率，減少葉表面水分蒸發(fā)[19]。海綿組織厚度主要反映植物對弱光環(huán)境或中生、濕生環(huán)境的適應(yīng)，這些環(huán)境往往溫度較低、植株耐熱性較弱[20]。在植物感受到外界高溫脅迫時，為了適應(yīng)環(huán)境而增加?xùn)艡诮M織厚度，減少海綿組織厚度，使海綿組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)變疏松。葉脈維管束是植物葉片主要的輸導(dǎo)組織，為葉片提供無機(jī)養(yǎng)分和水分，并往地下部分輸送光合產(chǎn)物，并具有保水、貯水功能各器官[21-22]。葉脈維管束組織厚度越大，養(yǎng)分和水分的利用效率越高，植物體的生命力越旺盛，其抗逆性越強(qiáng)[23-24]。主脈厚度和維管束厚度能增強(qiáng)植物的耐熱性，本研究中維管束厚度大小順序?yàn)椋篈16>A5>HM19>HMZ25，與耐熱性順序基本一致。葉片面積最大為HMZ25，耐熱性較差，葉面積最小為A5，耐熱性較強(qiáng)，表明葉片的面積大小與耐熱性呈負(fù)相關(guān)性[25]。在6 個高州油茶無性系中，耐熱性最強(qiáng)的A16 維管束厚度最大，海綿組織厚度最小，耐熱性最差的HMZ25 柵欄組織厚度最小，葉面積最大，A5 葉面積最小，HM19海綿組織厚度最大，維管束厚度最小為A11。

單一指標(biāo)不能準(zhǔn)確評定耐熱性，平均隸屬函數(shù)法通過整合平均具有代表性的耐熱性指標(biāo)來綜合評價，減少單方面指標(biāo)帶來的誤差，是一種常用的綜合性評價方法[26-28]。本研究通過系統(tǒng)聚類、相關(guān)性分析與隸屬函數(shù)分析法，將14 項(xiàng)指標(biāo)分為4 類，再從4 類中通過相關(guān)指數(shù)，選出典型的耐熱性指標(biāo)，通過隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合性評定。葉片的4 項(xiàng)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)（葉面積、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、維管束厚度）可以作為高州油茶的耐熱性的評定指標(biāo)，研究結(jié)果表明：6個高州油茶無性系耐熱性順序?yàn)椋?A16>A5>HMZ24>A11>HMZ19>HM25。