賴瑞聯(lián)　沈朝貴　馮新　陳義挺　韋曉霞　吳如健

關(guān)鍵詞：橄欖；轉(zhuǎn)錄組；簡(jiǎn)單重復(fù)序列；單核苷酸多態(tài)性；插入缺失標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

橄欖（Canarium album）是我國(guó)熱帶亞熱帶地區(qū)特色果樹(shù)，其果實(shí)富含多種營(yíng)養(yǎng)和藥用成分，在我國(guó)福建、廣東、四川、廣西等地區(qū)廣泛栽培。福州市是我國(guó)橄欖最主要的產(chǎn)地之一，“福州橄欖”品牌于2011 年獲得農(nóng)業(yè)部地理標(biāo)志保護(hù)品牌，2017 年品牌價(jià)值評(píng)估達(dá)20.80 億元人民幣，入選全國(guó)農(nóng)產(chǎn)品百?gòu)?qiáng)[1]。福州市傳統(tǒng)栽培的橄欖品種主要包括長(zhǎng)營(yíng)、惠圓、檀香、自來(lái)圓等。其中，長(zhǎng)營(yíng)和惠圓的果實(shí)性狀存在明顯差異，長(zhǎng)營(yíng)可食率約為78.40%，可供鮮食或加工，在長(zhǎng)營(yíng)基礎(chǔ)上選育出了一系列鮮食品種，例如福欖1 號(hào)（光甜）[2]、清欖1 號(hào)[3]、福欖2 號(hào)[4]等；惠圓可食率約為85.20%，因鮮食品質(zhì)較差，主要以加工為主，通過(guò)惠圓選育出了惠圓1 號(hào)[5]、惠圓3 號(hào)[6]等橄欖加工品種。作為我國(guó)特色果樹(shù)產(chǎn)業(yè)，品質(zhì)性狀提升是橄欖科研創(chuàng)新的重要命題。目前，在橄欖品種選育[2， 7]、性狀評(píng)價(jià)[8-9]、品質(zhì)模型[10]、遺傳背景[11]等方面都開(kāi)展了大量研究。值得注意的是，橄欖童期較長(zhǎng)，開(kāi)發(fā)果實(shí)性狀相關(guān)分子標(biāo)記用于育種材料初步篩選可有效提高種質(zhì)創(chuàng)新和育種效率。而現(xiàn)階段，橄欖果實(shí)性狀形成分子機(jī)制研究及相關(guān)標(biāo)記的開(kāi)發(fā)仍處于空白，限制了橄欖分子輔助育種進(jìn)程。

DNA 分子標(biāo)記鑒定是植物分子輔助育種重要技術(shù)手段，尤其是具有高靈敏度、高特異性的簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（simple sequence repeats， SSR）和單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotide polymorphism，SNP）在許多植物中得到了有效應(yīng)用。?AHIN 等[12] 篩選了抗霜霉病相關(guān)的向日葵（Helianthus annuus）SSR 標(biāo)記并成功應(yīng)用于向日葵輔助育種；GHARSALLAH 等[13]結(jié)合表型和SSR 標(biāo)記挖掘了番茄（Lycopersicon esculentum）品種耐鹽特性相關(guān)位點(diǎn)，有效提高了番茄耐鹽脅迫育種效率；TERAKAMI 等[14]采用SSR 標(biāo)記對(duì)中國(guó)梨（Pyrus ussuriensis）黑斑病易感基因進(jìn)行了定位，為梨抗黑斑病輔助育種提供了重要途徑。

在SNP 開(kāi)發(fā)相關(guān)研究中，TAN 等[15]開(kāi)發(fā)了小麥（Triticum aestivum）抗黑森癭蚊基因的SNP 標(biāo)記，可用于進(jìn)一步指導(dǎo)小麥育種；KIM 等[16]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘了蘿卜（Raphanus sativus）SNP標(biāo)記用于蘿卜種子的鑒定、純度檢測(cè)和親本組合的調(diào)整；FROUIN 等[17]鑒定了水稻（Oryza sativa）預(yù)防砷吸收和積累相關(guān)的SNP 位點(diǎn)，為水稻相關(guān)育種提供了參考依據(jù)。目前，橄欖轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相關(guān)研究也取得了一定進(jìn)展，為分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)[18]。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)具有不同性狀的橄欖品種長(zhǎng)營(yíng)和惠圓的果實(shí)進(jìn)行SSR 和SNP/InDel 特征分析，以期為橄欖果實(shí)性狀相關(guān)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為長(zhǎng)營(yíng)和惠圓橄欖品種的果實(shí)，取自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所橄欖種質(zhì)資源圃（26° 07′40″N，119°20′16″E）。以孔祥佳等[19]建立橄欖果實(shí)成熟度評(píng)價(jià)體系為參考標(biāo)準(zhǔn)，采集不同品種成熟、健康、無(wú)機(jī)械病蟲(chóng)損傷的果實(shí)，充分洗凈后用液氮速凍，并置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與檢測(cè) 采用植物多糖多酚試劑盒E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit 提取果實(shí)總RNA，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 bioanalyzer（Agilent Technologies， USA）檢測(cè)總RNA的完整性， 隨后利用NanoPhotometer spectrophotometer（IMPLEN， USA）檢測(cè)總RNA 的純度。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建與質(zhì)檢 取1 μg 橄欖果實(shí)總RNA，采用NEBNext? UltraTM RNA Library Kit試劑盒（Illumina， USA）進(jìn)行建庫(kù)。首先使用Oligo（dT）磁珠富集帶有polyA 尾的mRNA，使用二價(jià)陽(yáng)離子在高溫下在NEBNext 第一鏈合成反應(yīng)緩沖液（5×）中進(jìn)行裂解，使用隨機(jī)寡核苷酸引物和M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶體系合成cDNA 第一鏈。隨后使用RNaseH 酶降解RNA 鏈，再通過(guò)DNA 聚合酶I 合成cDNA 第二鏈。純化后的cDNA 進(jìn)行末端修復(fù)、加A 尾、連接測(cè)序接頭，隨后使用AMPure XPbeads 篩選長(zhǎng)度為250～300 bp 的cDNA片段，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行PCR 產(chǎn)物純化，最終獲得文庫(kù)。采用Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen，USA）和Agilent2100 bioanalyzer 進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)，隨后采用qRT-PCR 對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，篩選有效濃度高于2.0 nmol/L 的文庫(kù)后用于后續(xù)測(cè)序。

1.2.3 RNA 測(cè)序與數(shù)據(jù)組裝 采用TruSeq PECluster Kit v3 cBot HS（Illumina， USA）對(duì)樣本進(jìn)行聚類(lèi)，隨后在Illumina Novaseq 平臺(tái)上對(duì)制備的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并產(chǎn)生150 bp 配對(duì)末端讀數(shù)。測(cè)序片段的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA 轉(zhuǎn)化為fastq 格式的序列數(shù)據(jù)文件，去除帶測(cè)序接頭、無(wú)法確定堿基信息以及低質(zhì)量的reads，最終獲得高質(zhì)量的clean reads。隨后采用TRINITY 軟件[20]將cleanreads 拼接成transcripts，再采用CORSET 軟件[21]進(jìn)行層次聚類(lèi)后得到最長(zhǎng)cluster 序列作為unigene用于后續(xù)分析。每個(gè)樣本進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 SSR 位點(diǎn)鑒定 采用MISA 1.0 軟件[22]篩選和識(shí)別unigene，并對(duì)轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)進(jìn)行分析，鑒定出單堿基重復(fù)、雙堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)、四堿基重復(fù)、五堿基重復(fù)和六堿基重復(fù)等類(lèi)型的橄欖果實(shí)SSR。采用Microsoft Excel 2013 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表制作。

1.2.5 SNP/InDel 分型與特征分析 采用Picardtoolsv1.41 和Samtools v0.1.18 軟件進(jìn)行排序并刪除重復(fù)數(shù)據(jù)，同時(shí)合并每個(gè)樣本的校準(zhǔn)結(jié)果，并采用GATK3 軟件v3.4 版本[23]默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖果實(shí)的SSR 位點(diǎn)檢測(cè)

2.1.1 SSR 位點(diǎn)數(shù)量 通過(guò)長(zhǎng)營(yíng)和惠圓橄欖品種果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序， 6 個(gè)測(cè)序樣本平均獲得22 813 726 bp 的raw reads，過(guò)濾后的clean reads為22 019 057 bp，原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后的平均堿基數(shù)為6.61 Gb，整體測(cè)序錯(cuò)誤率約為0.02%，Q20 和Q30 分別為98.11%和94.19%，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果較好，可用于后續(xù)分析。拼接后，共獲得125 021條轉(zhuǎn)錄本和44 062 條unigenes，這些unigenes 包含54 735 280 bp 核苷酸。采用MISA1.0 對(duì)獲得的unigenes 進(jìn)行SSR 位點(diǎn)鑒定，總共在10 124 條unigenes 上鑒定到13 935 個(gè)SSR 位點(diǎn)，發(fā)生頻率為22.98%，平均每1 kb 序列出現(xiàn)0.25 個(gè)SSR 位點(diǎn)。這些SSR 分布的unigenes 中，2657 條序列包含1 個(gè)以上的SSR 位點(diǎn)，1072 條序列包含復(fù)合型SSR 位點(diǎn)?？梢?jiàn)，橄欖果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中廣泛分布SSR 位點(diǎn)。

2.1.2 SSR 重復(fù)基元類(lèi)型 橄欖果實(shí)SSR 位點(diǎn)的重復(fù)基元類(lèi)型如表1 所示。SSR 重復(fù)基元類(lèi)型較為豐富，除了含有單堿基重復(fù)到六堿基重復(fù)6 種類(lèi)型，還包含977 種復(fù)雜重復(fù)類(lèi)型。對(duì)單堿基重復(fù)到六堿基重復(fù)的SSR 類(lèi)型進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，單堿基重復(fù)的SSR 類(lèi)型最多，達(dá)到9308 個(gè)，占全部SSR 位點(diǎn)的66.80%，隨著重復(fù)基元堿基數(shù)的增加，類(lèi)型數(shù)量逐漸減少，六堿基重復(fù)的SSR 類(lèi)型僅有65 個(gè)，占全部SSR 位點(diǎn)的0.47%。從SSR位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率和分布距離來(lái)看，單堿基重復(fù)的SSR 位點(diǎn)類(lèi)型分別為21.12%和5.88 kb，而六堿基重復(fù)的SSR 位點(diǎn)類(lèi)型分別為0.15%和842.08 kb。結(jié)果可見(jiàn)，不同重復(fù)基元類(lèi)型的SSR 位點(diǎn)數(shù)目和分布存在較大差異。

2.1.3 SSR 序列長(zhǎng)度分布 不同重復(fù)基元的橄欖果實(shí)SSR 類(lèi)型的序列長(zhǎng)度為10～320 bp，平均長(zhǎng)度為36.19 bp。對(duì)其中單堿基重復(fù)基元到六堿基重復(fù)基元的SSR 序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)（表2），整體上序列長(zhǎng)度為10～72 bp，平均長(zhǎng)度為14.34 bp。其中，長(zhǎng)度差異最大的是單堿基重復(fù)的SSR 類(lèi)型，介于10～64 bp 之間，平均長(zhǎng)度為12.85 bp；差異最小的為五堿基重復(fù)的SSR類(lèi)型，介于25～30 bp之間，平均長(zhǎng)度為25.68 bp。

2.1.4 SSR 優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元分布特征 橄欖果實(shí)SSR 位點(diǎn)基元數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖1 所示。分布頻率最高的基元分別是A/T（9290個(gè)，占比66.67%）、AG/CT（1304 個(gè)，占比9.36）、AT/AT（857 個(gè)，占比6.15%）、AAT/ATT（421 個(gè)，占比3.02%）、AAG/CTT（392 個(gè)，占比2.81%）。對(duì)不同SSR 重復(fù)基元類(lèi)型的出現(xiàn)頻數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，所有SSR 位點(diǎn)共出現(xiàn)105 種重復(fù)基元，單堿基到六堿基重復(fù)的基元類(lèi)型分別為2、4、10、21、29、39 種。單堿基重復(fù)基元到六堿基重復(fù)基元中的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元分別為A/T、AG/CT、AAT/ATT、AAAT/ATTT （ 65 個(gè)， 占比0.47% ）、AAGAG/CTCTT （10個(gè)， 占比0.07% ） 和AGATGG/ATCTCC（5 個(gè)，占比0.04%）。

2.1.5 SSR 各基元類(lèi)型重復(fù)次數(shù) 橄欖果實(shí)SSR位點(diǎn)不同基元類(lèi)型的重復(fù)次數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2 所示。其中，單堿基重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要分布在9～12 和13～16 之間，分別占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的41.69%和17.22%，占單堿基重復(fù)基元總數(shù)的62.42%和25.77%；雙堿基到六堿基重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)均主要集中在5～8，分別占對(duì)應(yīng)重復(fù)基元總數(shù)的68.67%、93.55%、98.30%、100%和98.46%。不同重復(fù)基元類(lèi)型的SSR 位點(diǎn)數(shù)量隨著重復(fù)次數(shù)的增多呈遞減趨勢(shì)。

2.2 橄欖果實(shí)的SNP/InDel 的特征分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行不同性狀橄欖品種果實(shí)SNP/InDel 挖掘。共獲得284 992 個(gè)SNP 位點(diǎn)，平均每1 kb 序列含有5.21 個(gè)。其中，轉(zhuǎn)換類(lèi)型的SNP 位點(diǎn)共166 162 個(gè)，C/T 和A/G 發(fā)生頻率相近，每1 kb 序列分別含有1.51 個(gè)和1.52 個(gè)。顛換類(lèi)型的SNP 位點(diǎn)共118 830 個(gè)，每1 kb 序列中A/T、A/C、T/G 和C/G 的平均個(gè)數(shù)分別為0.63、0.53、0.54 和0.47。轉(zhuǎn)換類(lèi)型的SNP 位點(diǎn)（3.03個(gè)）的發(fā)生頻率明顯高于顛換類(lèi)型（2.18 個(gè)）。其中，第1、2 和3 位上發(fā)生SNP 突變的密碼子數(shù)量分別為51 513、25 378 和50 306。在這些SNP 位點(diǎn)中，4479 條unigenes 包含1 個(gè)SNP 位點(diǎn)，3096 條unigenes 包含2 個(gè)SNP 位點(diǎn)，2419條unigenes 包含3 個(gè)SNP 位點(diǎn)，隨著SNP 位點(diǎn)數(shù)增多，unigenes 的數(shù)量逐漸減少（圖3A）。值得注意的是，其中的14 條unigenes 包含有100個(gè)以上的SNP 位點(diǎn)（表3），其中的9 條unigenes得到了功能注釋?zhuān)杂? 條unigenes 在所有數(shù)據(jù)庫(kù)中未得到有效比對(duì)，這些存在高頻SNP 變異的unigenes 可能在果實(shí)性狀差異形成過(guò)程中發(fā)揮了重要功能。

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，共獲得18 548 個(gè)InDel位點(diǎn)，平均每1 kb 序列含有2.95 個(gè)，其分布變化趨勢(shì)與SNP 相似（圖3B），unigenes 中含有1 個(gè)InDel 位點(diǎn)的數(shù)量最多，達(dá)到7853 條。InDel 位點(diǎn)最多的是Cluster-4594.16496，達(dá)到24 個(gè)InDel位點(diǎn)，通過(guò)比對(duì)預(yù)測(cè)，其可能是胼胝質(zhì)合成酶。

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可有效開(kāi)發(fā)橄欖SSR 和SNP/InDel 標(biāo)記

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是植物SSR 和SNP/InDel 標(biāo)記開(kāi)發(fā)有效的技術(shù)手段。VIDYA 等[24]從生姜（Zingiberofficinale）轉(zhuǎn)錄組中挖掘了16 790 個(gè)EST-SSR 位點(diǎn)，其中4597 個(gè)SSR 位點(diǎn)分布在已預(yù)測(cè)的編碼基因中；ZHOU 等[25]從楠木（Phoebe bournei）轉(zhuǎn)錄組中鑒定了40 853 個(gè)SSR 位點(diǎn)，并對(duì)其中23個(gè)多態(tài)性EST-SSR 標(biāo)記進(jìn)行應(yīng)用；TULSANI 等[26]從芫荽（Coriandrum sativum）轉(zhuǎn)錄組中鑒定到了9746 個(gè)SSR 位點(diǎn)，為其轉(zhuǎn)錄組草圖和基因標(biāo)記提供了重要信息；XU 等[27]基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從草珊瑚（Sarcandra glabra）中挖掘了726 476 個(gè)SNP位點(diǎn)和42 939 個(gè)InDel 位點(diǎn)，為其資源開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。本研究采用Illumina Novaseq 測(cè)序平臺(tái)，從不同性狀的橄欖果實(shí)中分別挖掘了13 935 個(gè)SSR 位點(diǎn)、284 992 個(gè)SNP 位點(diǎn)和18 548 個(gè)InDel位點(diǎn)，為后續(xù)橄欖分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

3.2 橄欖果實(shí)中存在豐富多樣的SSR位點(diǎn)

SSR 標(biāo)記具有多態(tài)性高、分辨率高、通用性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是物種種質(zhì)資源鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位、數(shù)量性狀基因位點(diǎn)分析、分子標(biāo)記輔助育種等研究的重要技術(shù)手段[28]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，在10 124條unigenes 上鑒定到13 935 個(gè)SSR 位點(diǎn)，發(fā)生頻率為22.98%。其中，單堿基重復(fù)基元類(lèi)型的SSR位點(diǎn)最多并且單堿基重復(fù)是橄欖果實(shí)的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，隨著重復(fù)堿基數(shù)量的增加，SSR 位點(diǎn)出現(xiàn)頻率下降，與油梨（Persea americana）[29]、甜柿（Diospyros kaki）[30]、香椿（Toona sinensis） [31]等物種的規(guī)律一致。橄欖果實(shí)中的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元主要包括A/T 、AG/CT 、AT/AT 、AAT/ATT、AAG/CTT 等，尤其A/T 的比例達(dá)到66.67%，與甜柿[30]、龍眼（Dimocarpus longan）[32]、油梨[29]等其他物種存在一定的相似性，但仍有差異，可見(jiàn)SSR 位點(diǎn)分布存在物種特異性。此外，橄欖果實(shí)SSR 位點(diǎn)中也發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)CG/CG 和29 個(gè)CCG/CGG 重復(fù)基元，其在雙子葉植物中較為少見(jiàn)[30]，可能在橄欖進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮特殊的生物學(xué)功能。從多態(tài)性上看，通常認(rèn)為長(zhǎng)度大于20 bp的SSR 位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性[33]，橄欖果實(shí)中四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)的SSR 位點(diǎn)長(zhǎng)度均在20 bp 以上，具有更高的多態(tài)性，可能具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 橄欖果實(shí)中廣泛分布SNP/InDel位點(diǎn)

SNP/InDel 具有高效性、準(zhǔn)確性，并且與作物性狀密切相關(guān)。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共檢測(cè)到橄欖果實(shí)284 992 個(gè)SNP 位點(diǎn)，平均每1 kb 序列含有5.21 個(gè)SNP 位點(diǎn)。其中，轉(zhuǎn)換和顛換類(lèi)型的比例為1.398，與理論值0.500 存在較大偏差，說(shuō)明橄欖進(jìn)化過(guò)程中對(duì)不同類(lèi)型的選擇并非隨機(jī)而可能存在偏向性[34]。此外，本研究共獲得橄欖果實(shí)18 548 個(gè)InDel 位點(diǎn)，每1 kb 序列平均包含2.95 個(gè)InDel 位點(diǎn)。后續(xù)還應(yīng)進(jìn)一步針對(duì)SNP/InDel位點(diǎn)進(jìn)行深入研究，開(kāi)發(fā)橄欖果實(shí)性狀相關(guān)的特異性分子標(biāo)記，為橄欖種質(zhì)資源鑒定和分子輔助育種提供技術(shù)支撐。