王蘭 邱紅 朱月蓉 顧暢 張薇薇 楊帆

免疫介導(dǎo)的肝損傷是HBV感染后的一個(gè)重要致病因素,CD4+T淋巴細(xì)胞(如Th1、Th2和Th17細(xì)胞)的不充分應(yīng)答可以導(dǎo)致HBV持續(xù)感染[1]。Th9細(xì)胞作為近年來被發(fā)現(xiàn)的新型CD4+輔助性T細(xì)胞,通過與其他T細(xì)胞亞群交互作用,發(fā)揮促炎/抗炎功能[2]。Th9細(xì)胞已被證實(shí)參與了多種免疫介導(dǎo)的炎性疾病,如:末梢神經(jīng)炎、過敏性疾病、結(jié)直腸炎等等,但同時(shí)也延緩了腫瘤的進(jìn)展[3-6]。越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道Th9及相關(guān)細(xì)胞因子參與了肝臟的慢性損傷過程,包括肝纖維化、急性肝衰竭等等[7-10]。

本研究探討了Th9細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在HBV感染后不同肝纖維化分期患者體內(nèi)的變化及其在乙型肝炎肝纖維化過程中的診斷價(jià)值。

資料與方法

一、一般資料

選取2021年1月至12月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)就診的慢性HBV感染者207例,其中男性108例,女性99例,年齡(40.4±8.8歲)。診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[11]。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合慢性HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn);②HBV感染史≥6個(gè)月;③行肝組織病理活檢。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他肝炎病毒、HIV、EBV感染者;②合并自身免疫性肝炎、酒精性肝病、肝硬化等;③接受核苷(酸)類藥物或干擾素抗病毒治療者;④合并惡性腫瘤者。

二、研究方法

西門子ADVIA 2400型全自動(dòng)生化分析儀檢測受試者生化指標(biāo);ADVIA 2120型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)。

相關(guān)無創(chuàng)診斷模型計(jì)算公式為:FIB-4=(年齡(歲)×AST(U/L))/(PLT(109/L)×ALT(U/L)1/2),APRI=AST/ULN×100/PLT(109/L),AAR=AST(U/L)/ALT(U/L),RPR=RDW(%)/PLT(109/L)。

外周血IL-9及Th9細(xì)胞水平檢測:采用ELISA法檢測各組受試者血清IL-9含量,具體實(shí)驗(yàn)步驟按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。取100 μL外周血,采用平衡密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,分離細(xì)胞用50 ng/mL(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(PMA),1 μg/mL離子霉素,2 μmol/L蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑37°C刺激4 h,然后加入IL-9A-PE及IL-17A-FITC抗體共孵育20 min,磷酸鹽緩沖液洗滌重懸后上機(jī)檢測。CD3+CD8-為CD4+T細(xì)胞,其中IL-9+IL-17-定義為Th9細(xì)胞。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、不同肝纖維化程度組臨床一般資料比較

根據(jù)受試者肝臟穿刺活檢及病理學(xué)檢查的結(jié)果,以Scheuer評分系統(tǒng)界定為S0(31例)、S1(33例)、S2(44例)、S3(56例)、S4(43例)五期。S0為無纖維化組,S1～S2為輕中度纖維化組,S3～S4為重度纖維化組,各組性別及年齡構(gòu)成均無明顯差異(P>0.05)。

無纖維化組、輕中度纖維化組及重度纖維化組比較,ALT及AST水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);FIB-4、APRI、AAR、RPR差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 不同肝纖維化程度組ALT、AST、FIB-4、APRI、AAR、RPR、GPR比較[M(P25, P75)]

二、不同肝纖維化程度組外周血IL-9及Th9細(xì)胞水平

無纖維化組、輕中度纖維化組及重度纖維化組比較,IL-9及Th9細(xì)胞水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 不同肝纖維化程度組外周血IL-9及Th9細(xì)胞水平比較(±s)

三、外周血IL-9及Th9細(xì)胞水平與肝纖維化分期的相關(guān)性

ALT、AST水平與肝纖維化分期無明顯相關(guān)性(r=-0.053、0.122,P=0.522、0.138); FIB-4(r=0.740,P<0.01)、APRI(r=0.581,P<0.01)、AAR(r=0.379,P<0.01)、RPR(r=0.714,P<0.01)與肝纖維化分期呈正相關(guān);外周血IL-9(r=0.396,P=0.009)及Th9細(xì)胞(r=0.421,P=0.002)水平與肝纖維化分期呈正相關(guān)。

四、各變量對肝纖維化程度的診斷效能

FIB-4、APRI、AAR、RPR、IL-9及Th9對乙型肝炎所致的輕中度及重度肝纖維化的診斷效能較好,FIB-4的診斷效能最高,其AUC分別為0.878(輕中度組)和0.831(重度組);在輕中度肝纖維化組中,FIB-4的敏感度最大,說明其漏診率最低,而APRI的特異度最大,即誤診率最低。在重度肝纖維化組中,FIB-4的漏診率依舊最低,RPR的誤診率最低。見表3。

表3 各變量對不同程度肝纖維化的診斷效能分析

五、IL-9、Th9、FIB-4、RPR對肝纖維化程度的聯(lián)合診斷效能

在對IL-9、Th9、FIB-4、RPR四個(gè)指標(biāo)聯(lián)合診斷效能的比較中發(fā)現(xiàn),聯(lián)合各變量可以提高對乙型肝炎所致肝纖維化的診斷效能,其中IL-9+Th9+FIB-4聯(lián)合對輕中度肝纖維化的診斷效能最佳(AUC=0.934),IL-9+Th9+FIB-4+RPR聯(lián)合對重度肝纖維化的診斷效能最佳(AUC=0.943)。同時(shí),IL-9+Th9+FIB-4+RPR聯(lián)合診斷肝纖維化的敏感度最大,即漏診率最低;IL-9+Th9+RPR聯(lián)合診斷的特異度最大,即誤診率最低。見表4。

表4 各指標(biāo)聯(lián)合診斷不同程度肝纖維化的效能

討 論

HBV感染后宿主的免疫應(yīng)答狀態(tài)對疾病進(jìn)程及病毒的清除及疾病轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要[12]。研究顯示,肝星狀細(xì)胞激活及細(xì)胞外基質(zhì)的異常堆積導(dǎo)致了肝纖維化的發(fā)生,CD4+輔助性T細(xì)胞(Th cells)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在此過程中發(fā)揮了重要作用。Th細(xì)胞可以通過其產(chǎn)生的細(xì)胞因子調(diào)控炎性反應(yīng)的強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間,已被證實(shí)的有Th1/Th2細(xì)胞及Treg/Th17細(xì)胞失衡將導(dǎo)致肝損傷及纖維化的發(fā)生等。作為一類新發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞,Th9細(xì)胞可分泌IL-9及IL-10。IL-9作為其主要的效應(yīng)因子,可以通過調(diào)節(jié)Treg 和/或Th17細(xì)胞的發(fā)育及功能來發(fā)揮促炎/抗炎作用[13-14]。近年來,已證明Th9細(xì)胞參與了多種疾病進(jìn)程,如過敏性疾病、自身免疫病、腫瘤、器官移植及寄生蟲感染等,且IL-9與呼吸道合胞病毒及EB病毒感染、肺纖維化、囊性纖維化等纖維化疾病相關(guān)聯(lián)[1-2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),HBV感染者體內(nèi)的IL-9水平較健康人群明顯升高[8],但Th9細(xì)胞在HBV感染后肝纖維化過程中是否發(fā)揮作用尚無明確答案。

目前常用于評估乙型肝炎肝纖維化程度的無創(chuàng)診斷指標(biāo)包括FIB-4、APRI、AAR、RPR等。本研究結(jié)果顯示,隨著肝纖維化程度的加重,FIB-4、APRI、AAR、RPR以及外周血IL-9及Th9細(xì)胞水平亦趨于升高并與HBV感染者的肝纖維化程度呈正相關(guān);提示Th9細(xì)胞增殖及IL-9分泌增加可能參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。有文獻(xiàn)報(bào)道,敲除IL-9的肝纖維化模型小鼠脾臟中Th9、Th17及Th1水平均有所下降,同時(shí)IL-17A、IFN-γ、TGF-β 1, IL-6等促炎因子也表達(dá)下調(diào),均提示IL-9可能在肝纖維化過程中起到了調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。Qin等[8]研究發(fā)現(xiàn),肝硬化患者末梢血中的大量Th9細(xì)胞均高表達(dá)CCR4及CCR6趨化因子受體,而肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、CCR6及CCL20的表達(dá)均明顯上升,說明大量的肝星狀細(xì)胞(HSCs)被活化,最終導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生。

為確定Th9細(xì)胞及IL-9在肝纖維化分期中的診斷效能,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),IL-9及Th9對乙型肝炎所致的輕中度及重度肝纖維化均具備較好的診斷效能,敏感度較高,但特異度較差。將IL-9、Th9、FIB-4、RPR 4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷可以不同程度提高對乙型肝炎所致肝纖維化的診斷效能,其中IL-9+Th9+FIB-4聯(lián)合對輕中度肝纖維化的診斷效能最佳,IL-9+Th9+FIB-4+RPR聯(lián)合對重度肝纖維化的診斷效能最佳;IL-9+Th9+FIB-4+RPR漏診率最低;IL-9+Th9+RPR誤診率最低。

綜上所述,Th9細(xì)胞及IL-9水平在HBV感染后肝纖維化患者外周血中均有不同程度的升高,并與肝纖維化程度呈正相關(guān)性;與FIB-4、RPR聯(lián)合,可提高評估乙型肝炎所致肝纖維化程度的敏感度和特異度,為臨床后續(xù)治療提供參考依據(jù)。

利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。