劉 娜,田雨菁,馮哲瀚,李虎良,張 蕾,黃金海,華德平

(天津大學 生命科學學院,天津 300072)

花青素來源于植物,水溶性良好,屬黃酮類化合物。植物被其賦予鮮艷的顏色,從而吸引昆蟲授粉[1-2]。此外,花青素在醫(yī)藥和工業(yè)生產(chǎn)中也具有很重要的作用,如預防糖尿病、肥胖、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等,甚至可能預防癌癥[3],被普遍用于食品著色劑,營養(yǎng)品、化妝品添加劑等[4]。傳統(tǒng)獲得花青素的方法是從植物組織中提取[5],但植物中花青素的含量易隨季節(jié)和區(qū)域波動、存在質(zhì)量很難控制、純度相對較低等問題[6-7],這使得利用微生物進行花青素生物合成具有潛在優(yōu)勢。

3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)是花青素合成通路中催化活化的糖分子從核苷二磷酸向低分子量底物上轉(zhuǎn)移的關鍵酶,能將不穩(wěn)定的花青素轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的彩色花色苷[8]。3GT作用于活化的糖分子作為供體底物在花青素的O(OH-和COOH-)、N、C、S原子上進行花青素的糖基化,最常見的供體分子為UDP-葡萄糖[9]。

已有對3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的研究表明,3GT對于維持花青素含量至關重要,在研究牽?；ㄉ淖兓瘯r發(fā)現(xiàn),3GT缺陷的牽?；ɑò觐伾蝗缰邦伾r艷[10]。有研究發(fā)現(xiàn),花青素在3號位的糖基化對于葡萄漿果和葡萄酒的紅色色素沉著至關重要。對葡萄3GT進行克隆與特征分析,發(fā)現(xiàn)紅色葡萄品種的果皮和果肉在轉(zhuǎn)紅期表達3GT,并且隨著3GT表達的上調(diào),果皮顏色逐漸加深,而白色葡萄品種中未見表達[11]。亦有研究證實,3GT的活性增加導致花青素在蘋果和荔枝中積累增加[12]。深色葡萄3GT的表達受到多種因素的影響,僅在轉(zhuǎn)色期后進行表達,且隨時間的變化,表達水平也會改變[13]。這些研究都證實了3GT對花青素積累的重要性。

目前已經(jīng)在許多植物中克隆得到了糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因,如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、荷蘭鳶尾(Irishollandica)、草莓(Fragariaananassa)、矮牽牛(Petuniahybrida)和葡萄(Vitisvinifera)等。藍莓(Vacciniumcorymbosum)果實在成熟過程中會積累大量的花青素,然而對于藍莓中3GT基因的研究還未有報道,本研究克隆了藍莓3GT(Vc3GT)基因并利用在線分析網(wǎng)站和生物信息學軟件對Vc3GT及其編碼氨基酸進行了理化性質(zhì)、磷酸化位點、信號肽與跨膜結構域預測、酶和底物分子對接預測和啟動子順式作用元件預測等,旨在研究該基因的特征和功能,為后續(xù)進一步研究糖基轉(zhuǎn)移酶的作用及花青素異源合成表達提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

高叢藍莓(市場購置),Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)試劑盒(上海翊圣生物科技股份有限公司,CAT:11139ES60),pClone007克隆載體(北京擎科生物科技有限公司,CAT:TSV-007S),質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生化科技有限公司,CAT:DP103-03),大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(天津大學黃金海教授實驗室制備),LB培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 藍莓3GT克隆

1.2.1.1 藍莓mRNA的提取及cDNA的合成 利用TRIzol-KAc法提取藍莓mRNA,利用Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將其合成第一鏈cDNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2Vc3GT基因擴增 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中藍莓3GT序列(Gene Bank:MH321467.1)設計引物,上游引物3GT-F:5′-ATGTCCAACTTCTCAAAAGACCGGC-3′;下游引物3GT-R:5′-GCGGCGTTCATTTCTAAATGTTGTACC-3′。反應體系為20 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,模板1 μL,2×Hieff Robust PCR Master Mix 10 μL,ddH2O 8 μL。反應程序,95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。擴增程序結束后,取4 μL PCR產(chǎn)物檢測瓊脂糖凝膠電泳,查看PCR擴增產(chǎn)物的大小及特異性。

1.2.1.3Vc3GT基因T載體連接及測序 取上述Vc3GTPCR擴增產(chǎn)物1 μL,pClone007 0.5 μL,10×Topo Mix 1 μL,ddH2O 7.5 μL混勻,16 ℃過夜連接。第2天,準備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入其中,經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切及測序,確定已成功將3GT連接入T載。

1.2.2Vc3GT及其編碼蛋白的生物信息分析 根據(jù)測序獲得的Vc3GT序列及其翻譯的氨基酸序列,使用 NCBI 數(shù)據(jù)庫ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析Vc3GT開放閱讀框數(shù)據(jù);利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫中Blast工具中的 Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析程序,獲得Vc3GT蛋白保守域分析數(shù)據(jù);利用DNAMAN軟件對Vc3GT氨基酸序列及其他植物3GT氨基酸進行多重序列比對分析;運用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT的理化性質(zhì)分析數(shù)據(jù);通過 NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)在線分析網(wǎng)站,對Vc3GT的磷酸化位點進行預測;使用ProtScal(http://web.expasy.org/protscale/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT親水性和疏水性分析的預測數(shù)據(jù);利用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT跨膜域的預測數(shù)據(jù);利用 SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT信號肽的預測數(shù)據(jù);運用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=%20npsa_sopma.html)網(wǎng)站,獲得Vc3GT二級結構的預測數(shù)據(jù);通過SWISS-MODLE(http://swissmodel.expasy.org/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT三級結構的預測模型;利用MEGA 7.0對藍莓3GT氨基酸序列和選取的其他植物3GT氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹;使用PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT啟動子區(qū)順式作用元件分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 Vc3GT與底物矢車菊素分子對接模擬 3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶能將矢車菊素(C15H11O6)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的3-O-矢車菊花色苷。通過自動化拓撲構建器和存儲庫小分子ATB網(wǎng)站(https://atb.uq.edu.au/index.py)直接獲得矢車菊素的三維結構,并保存為PDB格式,通過SWISS-MODLE獲得Vc3GT蛋白的三維結果。利用Auto Dock(https://autodock.scripps.edu/)軟件實現(xiàn)分子對接,將獲得結果利用Discovery Studio visualizer進行圖形化展示。

2 結果與分析

2.1 藍莓3GT基因的克隆

以藍莓cDNA為模板擴增獲得的PCR產(chǎn)物,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)在1 000～1 500 bp存在單一特異性條帶(圖1-A),與Vc3GT的大小相符(1 371 bp)。將PCR產(chǎn)物與T載體連接,經(jīng)菌落PCR與質(zhì)粒酶切鑒定,初步證明Vc3GT成功連接入T載體(圖1-B)。通過測序及序列比對,發(fā)現(xiàn)Vc3GT位于藍莓的4號染色體末端,含有3個外顯子和2個內(nèi)含子[14]。開放閱讀框從ATG到TAG全長1 371 bp,編碼456個氨基酸(圖 1-C),與NCBI公布的序列相比,擴增獲得的Vc3GT在411 bp處的T突變?yōu)镃,對應的氨基酸未發(fā)生改變。

A.Vc3GT基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測示意圖;B.Vc3GT連接入T載體質(zhì)粒圖譜;C.Vc3GT位于藍莓的4號染色體,含有3個外顯子與2個內(nèi)含子。A.The diagram of agarose gel electrophoresis for the PCR amplification of Vc3GT gene;B.The map of the Vc3GT-T vector;C.The Vc3GT localizes on chromosome IV and contains 3 exons and 2 introns.圖1 藍莓Vc3GT的克隆Fig.1 The cloning of Vc3GT from the cDNA of blueberry

2.2 Vc3GT基因的特征分析

2.2.1 不同物種3GT氨基酸同源性分析 Vc3GT蛋白保守域分析是利用NCBI數(shù)據(jù)庫 Blast程序中的Conserved Domains程序進行的,Vc3GT屬于植物糖基轉(zhuǎn)移酶家族,具有典型的GTB-型結構域(圖2-A)。GTB-型糖基轉(zhuǎn)移酶能使活化的糖基供體轉(zhuǎn)移到特定的蛋白質(zhì)、脂肪、雜環(huán)化合物、碳水化合物或其他碳水化合物的殘基等這些受體分子上,形成糖苷鍵。受體分子多樣,所形成的糖復合物結構多樣且具有廣泛的生物學功能。利用DNAMAN軟件對Vc3GT氨基酸序列及其他4種植物3GT氨基酸進行多重序列比對分析,結果表明,Vc3GT與獼猴桃(Actinidiachinensis, ADC34700.1)、桑樹(Morusalba, AOV62766.1)、矮牽牛(Petunia×hybrida, BAA89008.1)、玉米(Zeamays, ABF72120.1)的相似性分別為67.47%,50.76%,47.17%和36.21%(圖2-B)。

A.Vc3GT氨基酸保守域分析;B.多個物種中Vc3GT氨基酸序列比對。A.The diagram of conserved domain for Vc3GT;B.The amino acid sequence of Vc3GT protein in several species.圖2 Vc3GT氨基酸序列分析Fig.2 The amino acid sequence analysis of Vc3GT

糖基轉(zhuǎn)移酶家族的C-末端都含有PSPG結構域(PSPG-box),是UDP-葡萄糖的結合區(qū)域[15],其中包含的高度保守的HCGWNS殘基(圖2-B黑框)[16],是與UDP-葡萄糖尿嘧啶殘基相互作用的區(qū)域。PSPG結構域由44個氨基酸組成(圖2-A、B黑色下劃線部分),其最后一位氨基酸種類決定了糖分子供體的特異性,若第44位是谷氨酰胺(Gln),則糖基供體為UDP-葡萄糖,若是組氨酸(His),則糖基供體為UDP-半乳糖[17]。Vc3GT氨基酸序列中,PSPG結構域中第44位是組氨酸(圖2-B星號標識),預示Vc3GT的糖基供體可能為UDP-半乳糖。Vc3GT活性位點由14個氨基酸組成,分別為第19,20,22,178,181,182,186,211,281,351,353,355,356和359位氨基酸殘基(圖2-B箭頭、菱形和三角),包括TDP結合位點(TDP-binding site)(圖2-B箭頭)和受體底物結合位點(Acceptor substrate-binding pocket)(圖2-B菱形)

2.2.2 Vc3GT編碼蛋白的性質(zhì)預測 利用ProtParam在線網(wǎng)站,分析Vc3GT的理化性質(zhì),發(fā)現(xiàn)Vc3GT含有456個氨基酸,其中亮氨酸(Leu)和絲氨酸(Ser)最多,均占總體的8.8%,其次為纈氨酸,占8.6%。蛋白的分子式為C2279H3521N595O650S15,相對分子質(zhì)量為50 136.52,理論等電點(pI)為6.14,帶負電荷的氨基酸殘基數(shù)為48,帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)為42,不穩(wěn)定系數(shù)為43.16(>40),推測Vc3GT可能為不穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)磷酸化指由蛋白激酶催化的把ATP等的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)特定氨基酸殘基(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)上的過程,通過NetPhos 3.1預測Vc3GT的磷酸化位點發(fā)現(xiàn),Vc3GT可能含有37個磷酸化位點,包括25個絲氨酸磷酸化位點,8個蘇氨酸磷酸化位點,和4個酪氨酸磷酸化位點。

對蛋白質(zhì)的親/疏水性的預測可以反映蛋白質(zhì)內(nèi)部結構的折疊情況和蛋白質(zhì)中區(qū)域跨膜的傾向與結合蛋白傾向。利用ProtScal在線分析網(wǎng)站預測Vc3GT的親水性和疏水性,大于0.5的區(qū)域為疏水區(qū),小于-0.5的區(qū)域為親水區(qū),在0.5和-0.5之間的區(qū)域為兩性區(qū)域(圖3-A)。親水指數(shù)越大,說明該氨基酸疏水性越強,小于零為親水蛋白,Vc3GT蛋白總平均親水指數(shù)為-0.029,推測為親水蛋白。信號肽一般是由15～30個氨基酸組成的肽鏈,在蛋白的亞細胞定位中起重要的作用,采用在線工具SignalP 5.0預測Vc3GT的信號肽,結果顯示,該蛋白可能無信號肽(圖3-B)。利用TMHMM進行蛋白跨膜結構域分析,結果顯示,Vc3GT無明顯跨膜域(圖3-C)。

A.預測Vc3GT為親水性蛋白;B.Vc3GT蛋白無信號肽;C.Vc3GT蛋白無跨膜結構域。A.Vc3GT is predicted to be a hydrophilic protein;B.Vc3GT has no signal peptide;C.Vc3GT has no transmembrane region.圖3 Vc3GT蛋白親/疏水性、蛋白信號肽和跨膜結構域預測Fig.3 Hydrophilic/hydrophobic analysis, signal peptide prediction and transmembrane region prediction of Vc3GT

2.2.3 Vc3GT蛋白質(zhì)的結構預測 利用SOPMA在線網(wǎng)站分析Vc3GT的二級結構,結果顯示,該蛋白質(zhì)二級結構由α-螺旋(Hh)、延伸鏈(Ee)、β-轉(zhuǎn)角(Tt)和無規(guī)則卷曲(Cc)4種結構形式組成,其中α-螺旋占比最高,達40.13%,其次為無規(guī)則卷曲,占37.72%,延伸鏈占16.67%,β-轉(zhuǎn)角占5.48%,這些結構散布于整個蛋白質(zhì)中(圖4-A)。

A:藍色.α-螺旋,紅色.延伸鏈,綠色.β-轉(zhuǎn)角,黃色.無規(guī)則卷曲;B.葡萄3GT蛋白質(zhì)三級結構(PDB ID:2C1X);C.Vc3GT蛋白質(zhì)的三級結構預測。A:Blue.α-helix, Red.Extended chain, Green.β-turn, Yellow.Random coiling;B.Tertiary structure of grape 3GT(PDB ID: 2C1X);C.Prediction of tertiary structure for Vc3GT.圖4 Vc3GT蛋白質(zhì)的結構預測Fig.4 Structure prediction of Vc3GT

利用SWISS-MODLE在線網(wǎng)站預測Vc3GT的三級結構(圖4-B),Vc3GT蛋白模型未形成多聚體和配體結構,且與葡萄中的3GT蛋白質(zhì)結構(PDB ID:2C1X)(圖4-C)最為相似,相似性為 56.70%。

2.2.4 Vc3GT氨基酸聚類分析 通過MEGA 7.0軟件的鄰近結合法(Neighbor-Joining,NJ)比較不同植物中的3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)和5-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(5GT)之間的親緣關系,構建系統(tǒng)進化樹,Bootstrap初始值設定為1 000。節(jié)點數(shù)字為自展值(Bootstrap value),用于評估該分支的可信度,數(shù)值越大表示可信度越高(圖5)。這些蛋白可以聚類為兩個大類:第一類為3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶,第二類為5-O-糖基轉(zhuǎn)移酶。另外,蘋果、馬鈴薯和水稻中3GT具有2個拷貝。結果顯示,Vc3GT與雙子葉植物中3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶同源性高于單子葉植物(水稻、玉米、大麥)。Vc3GT與獼猴桃同源關系最近,同源性為67%。蘋果和馬鈴薯中3GT的雙拷貝之間的同源性反而較低,說明在部分物種中,3GT并不是通過直接復制實現(xiàn)的多拷貝。

圖5 Vc3GT氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.5 The phylogenetic tree was constructed using the amino acid sequence of Vc3GT in multiple species

2.2.5 分子對接模擬 通過ATB網(wǎng)站下載的矢車菊素構象,將Vc3GT與矢車菊素進行模擬對接,獲得兩者能量最低時的結合位點(圖6-A),該模型所對應的模擬相互作用力二維平面結果顯示Vc3GT可能主要通過第17位苯丙氨酸(Phe)、第18位絲氨酸(Ser)、第51位蘇氨酸(Thr)、第84位天冬氨酸(Asp)、第85位異亮氨酸(Ile)和第282位纈氨酸(Val)殘基與矢車菊素對接(圖6-B)。從對接結果可以看出,Vc3GT與底物矢車菊素之間可能存在傳統(tǒng)的氫鍵作用力、Pi-Sigma神經(jīng)網(wǎng)絡作用力、Pi-Pi T-shaped相互作用力和Pi-Alkyl相互作用力。

A.Vc3GT酶和矢車菊素分子對接最低能量模型;B.Vc3GT酶和矢車菊素分子對接存在的模擬相互作用力及二維結果。A.The lowest energy model of molecular docking between Vc3GT and cyanidin;B.Simulated interaction and two-dimensional results were shown using molecule docking between Vc3GT and cyanidin.圖6 Vc3GT和矢車菊素分子對接模擬Fig.6 Simulation of docking between Vc3GT and cyanidin

2.2.6Vc3GT基因啟動子區(qū)順式作用元件預測 利用PLANTCARE啟動子預測網(wǎng)站,分析Vc3GT上游約1 500 bp內(nèi)的順式作用元件,發(fā)現(xiàn)Vc3GT上游區(qū)域含有啟動子轉(zhuǎn)錄因子核心元件CAAT區(qū)和TATA區(qū)。另外,還含有MYB轉(zhuǎn)錄因子結合位點, ACE、G-Box、GT1-motif、Box 4、TCCC-motif、Sp1和TCT-motif、I-box等光響應元件,DRE1、WRE3與STRE等非脅迫響應元件以及P-box、TCA-element、ABRE和TGA-element等脅迫相關激素的響應元件。根據(jù)以上分析結果可以推測,Vc3GT表達可能受到光、脅迫、激素等多種信號的調(diào)控,從而影響植物花青素的合成(表1)。

表1 Vc3GT啟動子區(qū)順式作用元件預測Tab.1 Prediction of cis-acting elements in the promoter region of Vc3GT

3 結論與討論

花青素屬黃酮類化合物,顏色鮮艷。植物中花青素的合成途徑涉及多種酶的功能,在苯丙氨酸裂解酶(PAL)、肉桂酸羥化酶(C4H)和4-香豆酰輔酶A連接酶(4CL)的連續(xù)催化下苯丙氨酸轉(zhuǎn)化形成香豆酰輔酶A[18-19]。查爾酮合成酶(CHS)催化香豆酰輔酶A,形成黃色的查爾酮[20],隨后在查爾酮異構酶(CHI)的作用下異構化,形成黃烷酮[21]。黃烷酮在黃烷酮-3-羥化酶(F3H)的作用下生成二氫黃烷酮[22],二羥黃酮醇還原酶(DFR)隨后發(fā)揮作用,催化產(chǎn)生無色花青素,即原花青素[23]。原花青素在花色素合酶(ANS)的催化作用下,轉(zhuǎn)化為有色的花青素,但此時生成的花青素結構不穩(wěn)定。最后3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)發(fā)揮作用,花青素經(jīng)糖基化形成穩(wěn)定的花色苷[24-25],這時生成的花色苷會轉(zhuǎn)移到植物液泡中,這一步驟在增加花青素的穩(wěn)定性的同時也增加了水溶性。

本研究克隆獲得藍莓3GT基因,發(fā)現(xiàn)該基因含有3個外顯子和2個內(nèi)含子,CDS全長1 371 bp,編碼456個氨基酸。通過生物信息學預測,Vc3GT可能含有37個磷酸化位點,可能為親水性蛋白,無跨膜區(qū)和信號肽結構域,二級結構由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等組成。Vc3GT具有植物糖基轉(zhuǎn)移酶家族(GTB-型)的典型結構域,GTB蛋白具有不同的N-和C-末端結構域,每個結構域包含一個典型的Rossmann折疊,這2個結構域具有高度的結構同源性,但序列同源性很低[26]。Vc3GT C-末端含有由44個氨基酸組成的PSPG-box特征性結構域,該結構域的最后一位是組氨酸,推測Vc3GT的糖基供體是UDP-半乳糖。Vc3GT與獼猴桃中的3GT親緣關系最近,同源性為67%。通過分子對接發(fā)現(xiàn)Vc3GT和矢車菊素之間可能存在傳統(tǒng)的氫鍵作用力,Pi-Sigma神經(jīng)網(wǎng)絡作用力,Pi-Pi T-shaped相互作用力和Pi-Alkyl相互作用力。

光照、脅迫等對植物花青素的合成具有調(diào)控作用。Vc3GT是藍莓花青素合成途徑中的關鍵酶,基因的表達模式受啟動子順式作用元件的調(diào)控,Vc3GT啟動子區(qū)預測發(fā)現(xiàn)存在14個光響應元件,推測Vc3GT的表達受到光照的影響,已有研究證實光能夠誘導花青素的合成,一般來說,光照對花青素的積累具有正向調(diào)控作用,尤其是藍光和紫外光[27]。在花青素積累時期3GT基因的表達上調(diào)也間接表明,Vc3GT表達量的增加可能與光照有關。有研究表明,血橙在4 ℃貯藏時果皮中的UFGT基因表達量顯著增強,花青素的含量也隨之增多[28]。對葡萄卷葉病的研究發(fā)現(xiàn),干旱情況下,MYBA1和UFGT的表達上調(diào),導致感染葡萄卷葉病相關病毒3(GLRaV-3)后葉片變紫的癥狀增強。Vc3GT轉(zhuǎn)錄因子預測發(fā)現(xiàn)有4個脅迫響應元件,推測脅迫環(huán)境下可能會增強Vc3GT的表達,與上述研究結果一致。有研究表明,脫落酸(ABA)處理能夠促進蘋果果皮葉綠素降解和花青苷合成[29],而ABA合成抑制劑處理蘋果果實會抑制花青苷的積累[30]。適當濃度的茉莉酸[31]和細胞分裂素[32]處理也能夠促進花色苷的生物積累,高濃度的生長素[33]抑制花青苷的合成。Vc3GT上游區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子預測有6個激素響應元件,由此可見脫落酸、生長素、赤霉素和水楊酸均能影響Vc3GT的表達。此外該啟動子區(qū)序列還存在 MYB轉(zhuǎn)錄因子的識別位點,在花青素生物合成途徑中,MYB轉(zhuǎn)錄因子被認為是最重要的調(diào)控因子,所有花青素生物合成途徑中的基因均是其下游基因[34]。

3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶是催化活化糖基從UDP-葡萄糖(或UDP-半乳糖)轉(zhuǎn)移到花青素的3-羥基或5-羥基處的一類轉(zhuǎn)移酶。近年來,越來越多的研究表明3GT是花青素生物合成途徑中的關鍵酶,該基因的表達強度嚴重影響花青素的生成,與控制其他酶相比,控制3GT活性更能調(diào)控花青素的積累。本研究克隆得到了藍莓3GT基因,通過在線網(wǎng)站和預測軟件對其進行生物信息學分析和功能預測,旨在為研究該基因的特征和功能,為后續(xù)進一步研究糖基轉(zhuǎn)移酶的作用及花青素異源合成研究提供基礎。