李 歡, 馬武生, 孫長花

(揚州職業(yè)大學(xué), 江蘇 揚州 225009)

RIPK2是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,可介導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng),參與病原相關(guān)分子模式引起的天然和獲得性免疫反應(yīng),產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。早期研究顯示RIPK2主要通過NOD/RIPK2通路進(jìn)行免疫調(diào)節(jié),是NOD/RIPK2通路關(guān)鍵且核心的基因[1]。激活NOD2:RIPK2 復(fù)合物可引起細(xì)胞自噬、抗原呈遞以及信號通路的激活等一系列級聯(lián)反應(yīng)。這些級聯(lián)反應(yīng)中,NF-κB信號通路研究的最多,是NOD/RIPK2通路影響下游信號的最佳模型[2]。研究表明敲除RIPK2的巨噬細(xì)胞在LPS刺激時,NF-κB、JNK、p38信號通路被抑制,炎癥細(xì)胞因子IL6和TNF-α以及趨化因子IP10表達(dá)量明顯減少[3]。高表達(dá)RIPK2時可激活p38 MAPK通路,能更有效地清除大腸桿菌[4]。此外,RIPK2還可參與肺炎、連鎖淋巴組織增生綜合征、Blau 綜合征、多發(fā)性硬化、哮喘等疾病,在呼吸系統(tǒng)免疫中發(fā)揮著重要作用。缺失RIPK2可導(dǎo)致肺臟中載菌量顯著性增加[5],表明RIPK2在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。而過多的免疫反應(yīng)可引起不同程度的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致組織器官的不同損傷。有研究表明過高表達(dá)RIPK2可導(dǎo)致破壞性炎癥反應(yīng),常見于繼發(fā)性細(xì)菌感染[6]。因此,對RIPK2基因調(diào)控機(jī)制的研究將會有助于解釋NOD/RIPK2通路參與宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)以及對過度炎癥的緩解機(jī)制。

表觀遺傳修飾是影響基因表達(dá)的一個重要因素。DNA甲基化作為一種常見的表觀遺傳修飾方式,可在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,使CpG二核苷酸5’-胞嘧啶變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化會改變DNA構(gòu)象,使DNA的大溝無法與DNA結(jié)合蛋白正常結(jié)合,使這些非編碼區(qū)長期保持無表達(dá)活性的狀態(tài),從而控制基因表達(dá)。啟動子DNA甲基化可通過阻礙轉(zhuǎn)錄因子與識別序列結(jié)合、結(jié)合甲基化CpG結(jié)合蛋白并募集輔阻遏復(fù)合物而形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物等方式抑制基因的轉(zhuǎn)錄?；騿幼訁^(qū)甲基化通常被認(rèn)為是阻礙轉(zhuǎn)錄起始的抑制性表觀遺傳學(xué)標(biāo)記。例如,TFPI-2基因啟動子區(qū)甲基化可沉默或下調(diào)基因表達(dá),且啟動子甲基化狀態(tài)可以作為急性髓系白血病病情進(jìn)展的指標(biāo)[7]。此外,免疫應(yīng)答及疾病相關(guān)基因啟動子DNA甲基化與免疫系統(tǒng)功能和疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系。TSP1基因啟動子區(qū)的高甲基化與TGF-β1高表達(dá)相關(guān),降低細(xì)胞免疫功能,可能參與賁門腺癌的發(fā)生[8]。因此,探尋雞RIPK2基因甲基化水平的調(diào)控機(jī)理有助于控制過度炎癥反應(yīng),緩解應(yīng)激性病理損傷和提高家禽健康,具有一定的理論價值和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要試劑

本研究中所涉及的材料和試劑如表1所示。

表1 試驗材料和試劑

1.2 主要儀器

本研究中主要涉及的儀器有:CO2恒溫培養(yǎng)箱,潔凈工作臺,倒置顯微鏡(IX51),臺式離心機(jī)(TGL-16c),熒光酶標(biāo)儀(Spark 10M),紫外儀(WD-9403C),核酸電泳儀(DyCP-31DN),PCR儀(TC-XP),核酸蛋白測定儀(ND-ONEW),熒光定量RT-PCR儀(QuantStudio 6 Flex System)。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和試驗分組

雞巨噬細(xì)胞HD11復(fù)蘇后添加至含10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日觀察細(xì)胞生長情況傳代培養(yǎng)。將干粉狀5-氮雜胞苷溶解于DMSO中,PBS稀釋至10 μmol·L-1濃度。處理前一天,將細(xì)胞鋪至24孔培養(yǎng)板上,LPS(10 μg·mL-1)、5-氮雜胞苷(10 μmol·L-1)、CpG甲基轉(zhuǎn)移酶M. SssI(50 U·mL-1)和PBS(2 μL)分別加入培養(yǎng)基中,孵育48 h后收集細(xì)胞。

1.3.2 引用設(shè)計與合成

登錄NCBI數(shù)據(jù)庫下載雞RIPK2基因(NM-001030943.1)mRNA序列和基因組轉(zhuǎn)錄起始位點上游3000bp和下游200bp啟動子序列。采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計qRT-PCR引物序列(表2);利用EMBOSS Cpgplot在線軟件對雞RIPK2基因啟動子區(qū)域進(jìn)行CpG島預(yù)測。利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計焦磷酸PCR測序的引物,由武漢金開瑞生物工程有限公司合成,引物序列見表3。

表2 雞RIPK2基因qRT-PCR引物

表3 雞RIPK2基因啟動子區(qū)焦磷酸測序引物

1.3.3 總RNA提取和熒光定量PCR

利用試劑盒TRIpure Total RNA Extraction Reagent提取雞巨噬細(xì)胞HD11總RNA,核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度和純度,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA產(chǎn)物。使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測。反應(yīng)體系為10 μL: 2×Master Mix 5 μL,引物工作液(2.5 μM)1μL,模板1 μL,ROX 1μL,ddH2O 2 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次。以雞RIPK2為檢測基因,GAPDH為內(nèi)參基因。每組3次重復(fù)。

1.3.4 基因組提取和亞硫酸氫鹽處理

利用基因組DNA試劑盒提取雞巨噬細(xì)胞HD11基因組,核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度和純度。亞硫酸氫鹽DNA甲基化采用Methylation-Gold Kit試劑盒進(jìn)行(基因組DNA 500 pg-2 μg)。亞硫酸氫鹽反應(yīng)體系中,DNA 樣品20 μL,緩沖液130 μL。反應(yīng)條件:98 ℃,10 min;64 ℃,2.5 h;4 ℃,放置20 h。

1.3.5 雞RIPK2基因啟動子區(qū)CpG島片段PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增雞RIPK2基因啟動子區(qū)-421 ～+21 bp CpG島。擴(kuò)增體系為20 μL: 2×HieffTM PCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,亞硫酸氫鹽處理后的基因組DNA 2 μL,ddH2O 16 μL。PCR擴(kuò)增程序為95 ℃預(yù)變性4 min,95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(35個循環(huán)),72 ℃末段延伸10 min。

1.3.6 測序

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序,利用在線軟件QUMA分析測序結(jié)果,判斷目的片段中CpG島位點是否發(fā)生甲基化。

1.3.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 雞RIPK2基因啟動子區(qū)甲基化分析

在線軟件EMBOSS Cpgplot預(yù)測結(jié)果顯示,雞RIPK2基因啟動子區(qū)存在一個CpG島,長度為513 bp,位于-421～+92 bp 處(符合CpG島標(biāo)準(zhǔn):觀察者/期望值>0.6,C%+G%>50%,CpG島長度>200 bp),具體見圖1。

圖1 雞RIPK2基因啟動子區(qū)CpG島預(yù)測

2.2 LPS誘導(dǎo)雞HD11細(xì)胞前后RIPK2表達(dá)量變化

定量qRT-PCR檢測LPS誘導(dǎo)雞HD11細(xì)胞前后RIPK2基因表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示:相對于空白對照組,10 μg·mL-1LPS誘導(dǎo)雞HD11細(xì)胞48 h后,雞RIPK2基因mRNA表達(dá)量差異極顯著(P<0.05);雞RIPK2基因在LPS誘導(dǎo)48 h后,其表達(dá)量提高了4倍(圖2)。

圖2 LPS誘導(dǎo)前后雞RIPK2在HD11細(xì)胞中的表達(dá)量注:不同小寫字母表示組間差異顯著,P<0.05

2.3 LPS誘導(dǎo)前后雞RIPK2基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

提取雞巨噬細(xì)胞HD11基因組DNA,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示提取的基因組DNA條帶明亮,整齊單一,無雜帶(圖3);且樣品DNA濃度為258 ng·μL-1,OD260/OD280比值在1.8～2.0之間。結(jié)果說明樣品DNA完整、質(zhì)量較高,可用于后續(xù)試驗。設(shè)計BSP引物對CpG島進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增片段長度為221 bp。瓊脂糖凝膠電泳顯示約在250 bp處有1條特異性條帶(圖4),與目標(biāo)片段長度一致;后進(jìn)行切膠回收,TA克隆后測序結(jié)果與預(yù)期序列一致。

圖3 基因組DNA的電泳檢測結(jié)果注:M:DL-2000 DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:陽性對照;2:LPS誘導(dǎo)組RIPK2基因片段

圖4 雞RIPK2基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增片段電泳圖注:M:DL-2000 DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:陽性對照;2:LPS誘導(dǎo)組RIPK2基因片段

2.4 LPS誘導(dǎo)前后雞RIPK2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化檢測

對測序結(jié)果進(jìn)行甲基化分析,計算不同處理組中DNA甲基化的概率,黑色圓圈表示甲基化的CpG位點,空心圓圈表示未甲基化的CpG位點,圖5顯示GpG島位點甲基化狀態(tài)。不同處理狀態(tài)下,雞RIPK2基因甲基化狀態(tài)不同,且差異顯著(P<0.05)。對照組中雞RIPK2基因CpG位點甲基化水平為53.8%,而LPS誘導(dǎo)后甲基化水平為15.4%;下降了40.4%(圖6)。這表明LPS刺激會降低雞RIPK2基因甲基化狀態(tài),使RIPK2基因從抑制狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。

圖5 LPS誘導(dǎo)前后雞RIPK2基因啟動子區(qū)甲基化圖譜 注:黑色圓圈表示甲基化的CpG位點;空心圓圈表示未甲基化的CpG位點

圖6 LPS誘導(dǎo)前后雞RIPK2基因啟動子區(qū)甲基化水平分析注:不同小寫字母表示組間差異顯著,P<0.05

2.5 5-氮雜胞苷和M. SssI對雞RIPK2啟動子活性及基因表達(dá)的影響

實時熒光定量qRT-PCR檢測5-氮胞雜苷DNA甲基化抑制劑組、CpG甲基轉(zhuǎn)移酶過甲基化組和對照組中雞RIPK2基因啟動子活性以及LPS誘導(dǎo)后這些組中RIPK2基因表達(dá)水平(圖7、圖8)。圖7結(jié)果顯示相比于對照組和CpG甲基轉(zhuǎn)移酶組,5-氮胞雜苷組極顯著性提高雞RIPK2基因啟動子活性(P<0.01);相比于加入RIPK2啟動子質(zhì)粒的對照組,CpG甲基轉(zhuǎn)移酶組極顯著性降低雞RIPK2基因啟動子活性(P<0.01)。圖8結(jié)果顯示相比于LPS誘導(dǎo)組,LPS誘導(dǎo)后加入DNA甲基化抑制劑顯著性提高了雞RIPK2基因的表達(dá)水平;而LPS誘導(dǎo)后加入CpG甲基轉(zhuǎn)移酶M. SssI顯著性降低了雞RIPK2基因的表達(dá)水平。以上結(jié)果表明DNA甲基化抑制劑和CpG甲基轉(zhuǎn)移酶可分別調(diào)控雞RIPK2基因啟動子活性,進(jìn)而調(diào)控雞RIPK2基因的表達(dá)水平。

圖7 不同試劑對雞RIPK2基因啟動子活性的影響注:不同小寫字母表示組間差異顯著,P<0.05

圖8 不同試劑對雞RIPK2基因表達(dá)水平的影響注:不同小寫字母表示組間差異顯著,P<0.05

3 討論與結(jié)論

本試驗檢測了LPS誘導(dǎo)前后調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)的RIPK2基因表達(dá)水平及甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)前雞RIPK2高甲基化;誘導(dǎo)后RIPK2低甲基化,激活基因表達(dá),表明甲基化參與細(xì)菌感染前后基因的表達(dá)調(diào)控。同時,此結(jié)果與RIPK2基因的功能在理論上保持一致,即受外界刺激前RIPK2低表達(dá)(高甲基化抑制基因表達(dá)),受刺激后RIPK2基因被激活以有助于發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)(低甲基化激活基因表達(dá))。

基于此結(jié)果甲基化影響RIPK2基因表達(dá),檢測了甲基化相關(guān)試劑對RIPK2表達(dá)的影響。5-氮雜胞苷,DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑,可在DNA復(fù)制時有效結(jié)合DNA鏈與5-胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶形成共價化合物,從而阻礙基因發(fā)生甲基化[9]。CpG甲基轉(zhuǎn)移酶M.SssI可有效識別雙鏈DNA上的二核苷酸序列,特異性模擬高等真核生物基因組甲基化修飾,甲基化所有胞嘧啶殘基(未甲基化和半甲基化)[10]。本試驗結(jié)果顯示5-氮雜胞苷可顯著性提高雞RIPK2基因表達(dá)(或啟動子活性),而M.SssI作用相反。研究結(jié)果表明雞RIPK2基因的表達(dá)確實與DNA 甲基化狀態(tài)有關(guān),且受DNA甲基化抑制劑和CpG甲基化轉(zhuǎn)移酶調(diào)控。因此,在細(xì)菌感染的實踐中,通過DNA甲基化激活劑或抑制劑調(diào)節(jié)RIPK2基因的表達(dá)水平可以提高家禽免疫能力并控制過度炎癥反應(yīng)。

總之,LPS誘導(dǎo)可顯著性影響雞RIPK2基因甲基化狀態(tài)。DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷可降低雞RIPK2基因上游部分CpG位點甲基化水平,使其啟動子區(qū)低甲基化,從而促進(jìn)基因表達(dá)。而CpG甲基轉(zhuǎn)移酶M.SssI使雞RIPK2基因啟動子區(qū)甲基化水平升高,抑制基因表達(dá)。研究結(jié)果對提高家禽免疫和控制過度性炎癥反應(yīng)具有十分重要的現(xiàn)實意義。