許 晶，李冬云，吳潔雅，代 忠，吳俊汎，姚夢(mèng)丹，侯 麗

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2.北京市朝陽(yáng)區(qū)桓興腫瘤醫(yī)院，北京 100023）

胃癌是胃黏膜上皮細(xì)胞常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。在中國(guó)，惡性腫瘤中胃癌發(fā)病率和死亡率均居第三位[1-2]。2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，胃癌發(fā)病率和死亡率在全球惡性腫瘤中分別居第五位和第四位；其中中國(guó)胃癌新發(fā)病例為48萬(wàn)例，死亡病例37萬(wàn)例，約分別占全球的44.04%和48.05%；早期胃癌5年生存率可超過(guò)95%，但中國(guó)80%患者在診斷時(shí)已為晚期，總體5年生存率＜50%，治療效果欠佳，且不良反應(yīng)大，嚴(yán)重影響患者身心健康[3-4]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾胃虛弱是胃癌發(fā)病之關(guān)鍵，氣、血、瘀、痰、毒等為重要的病理因素。其治療手段多樣，包括中藥湯劑、中成藥、針灸等，可有效提高患者臨床療效和生活質(zhì)量，并減輕不良反應(yīng)，延長(zhǎng)生存期。目前，關(guān)于中醫(yī)藥治療晚期胃癌的機(jī)制研究較少，較少?gòu)幕?、分子等微觀層面闡述其作用機(jī)制。數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)是利用現(xiàn)代技術(shù)從大量數(shù)據(jù)中獲取有用信息的手段，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從系統(tǒng)層面展現(xiàn)中藥的活性成分和作用機(jī)制。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘方法分析135例晚期胃癌患者的中藥處方規(guī)律，綜合運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和基因芯片技術(shù)分析核心處方治療胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用機(jī)制，并探索關(guān)鍵靶點(diǎn)與胃癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，以期為中醫(yī)藥防治胃癌及新藥研發(fā)提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 本研究遵循《赫爾辛基宣言》中的倫理準(zhǔn)則。收集2015年1月1日至2020年12月31日就診于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院和北京市桓興腫瘤醫(yī)院晚期胃癌患者病歷，并從中篩選出晚期胃癌中醫(yī)治療受益人群。此受益人群為接受現(xiàn)代醫(yī)學(xué)規(guī)范化治療與同步中醫(yī)藥治療后，生存期超過(guò)循證醫(yī)學(xué)證據(jù)下中位生存期的晚期胃癌患者。將2010年ToGA研究中單純化療組的中位生存期11.1個(gè)月作為循證醫(yī)學(xué)的中位生存期，故受益人群定義為Ⅳ期生存時(shí)間≥11.1個(gè)月的患者[5-6]。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）病理診斷明確為胃癌，參照WHO（2019年）《消化系統(tǒng)腫瘤分類》胃癌定義[附錄（二）][7]；（2）TNM分期為Ⅳ期，參照UICC及AJCC胃癌TNM分期系統(tǒng)（第8版，2016）[附錄（三）][8]；（3）晚期胃癌中醫(yī)治療受益人群，即Ⅳ期生存時(shí)間≥11.1個(gè)月的患者；（4）至少接受1個(gè)月的中醫(yī)藥湯劑辨證治療；（5）年齡18周歲以上，性別不限。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）既往或合并2種及以上原發(fā)惡性腫瘤；（2）心、肝、腎等臟器存在嚴(yán)重的非腫瘤性疾?。唬?）未口服中藥湯劑者；（4）孕期、哺乳期婦女等。

1.4 數(shù)據(jù)錄入和分析 分析軟件為中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院自主研發(fā)的中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)（TCMICS）V 3.0軟件。首先使用Excel錄入相關(guān)病歷信息，規(guī)范中醫(yī)處方藥名后根據(jù)模板錄入處方信息，一人負(fù)責(zé)信息錄入，兩人負(fù)責(zé)信息核對(duì)，以確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。所有納入病歷均選擇錄入患者首次就診時(shí)的處方。最后，通過(guò)TCMICS V 3.0軟件對(duì)藥物頻數(shù)和組方規(guī)律進(jìn)行分析。

1.5 篩選核心組合成分和靶點(diǎn) 首先檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[9]并以口服生物利用度（OB）＞30%和類藥性（DL）＞0.18為篩選條件獲得了核心組成藥物的有效活性成分[10]，同時(shí)檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普數(shù)據(jù)庫(kù)和Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)以補(bǔ)充藥物的活性成分，時(shí)間截至2021年1月15日。去重后，利用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[11]獲得有效化學(xué)成分的2D或3D結(jié)構(gòu)，通過(guò)將其結(jié)構(gòu)“SDF”格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction平臺(tái)（http://www.swisstargetprediction.ch/）[12]預(yù)測(cè)活性化合物的潛在靶點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的有效成分靶點(diǎn)對(duì)所有藥物靶點(diǎn)進(jìn)行匯總。

1.6 獲取胃癌靶點(diǎn) 以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞，以“Series”“Expression profiling by array”“Homo sapiens”為限定條件檢索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，截止時(shí)間為2021年1月15日，最終得到277個(gè)胃癌相關(guān)基因芯片。使用GEO2R篩選胃癌和胃正常組織樣本之間的差異表達(dá)基因（DEGs），其中|lgFC(fold change)|＞1和校正P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用limma包和pheatmap繪制DEGs火山圖和熱圖。

1.7 構(gòu)建相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò) 首先利用Venn在線數(shù)據(jù)獲得藥物和疾病共同靶點(diǎn)，STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，分別獲取疾病DEGs、共同靶點(diǎn)及“有效成分-共同靶點(diǎn)“的PPI網(wǎng)絡(luò)。隨后，利用Cytoscape 3.8.1軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，其插件MCODE和Bisogenet被用來(lái)識(shí)別各PPI網(wǎng)絡(luò)中的最顯著modules，參數(shù)設(shè)置均為默認(rèn)參數(shù)。

1.8 富集分析 通過(guò)R軟件的“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”等安裝包獲取GO和KEGG富集分析結(jié)果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，得到共同靶點(diǎn)的主要生物學(xué)過(guò)程和可能性較大的通路，并進(jìn)一步篩選與胃癌相關(guān)的信號(hào)通路，利用Cytoscape軟件對(duì)通路和涉及的基因進(jìn)行可視化分析。

1.9 關(guān)鍵靶點(diǎn)與胃癌關(guān)聯(lián)性分析 通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步探尋關(guān)鍵靶點(diǎn)與胃癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 本研究最終納入135例患者，其中男性81例，女性54例，男女比例約為3∶2。最大者為85歲（3例），最小者為26歲（1例），平均年齡為59.33歲。平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為21.13 kg/m2。（見(jiàn)表1）

表1 一般資料

2.2 藥物頻數(shù)統(tǒng)計(jì) 研究所納入的135份處方涉及251味中藥，藥物頻數(shù)前10的中藥依次為黃芪、黨參、半夏、陳皮、茯苓、雞內(nèi)金、白術(shù)、甘草、麥芽、雞血藤。（見(jiàn)表2）

表2 中藥使用頻數(shù)分布（頻數(shù)≥33）

2.3 藥物性味歸經(jīng)功效統(tǒng)計(jì) 四氣總頻數(shù)為2 472，頻數(shù)由高到低依次為溫、平、寒、涼、熱，其中溫、平、寒共占94.38%；五味總頻數(shù)為3 805，頻數(shù)由高到低依次為甘、苦、辛、酸、咸，其中甘、苦、辛共占90.41%。（見(jiàn)表3～4）

表3四氣頻數(shù)分布

表4 五味頻數(shù)分布

中藥歸經(jīng)總頻數(shù)為6 832，其中脾經(jīng)頻數(shù)最高，其次為肺經(jīng)、胃經(jīng)、肝經(jīng)、腎經(jīng)、心經(jīng)等。（見(jiàn)表5）

表5 中藥歸經(jīng)頻數(shù)分布

藥物功效分類總頻數(shù)為2 504，頻數(shù)最高為補(bǔ)虛類（696），其次為理氣類（234）、清熱類（218）、消食類（197）、化痰止咳平喘類（171）、利水滲濕類（169）等。（見(jiàn)表6）

表6 藥物功效分類

2.4 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 本研究設(shè)置支持度為30%，置信度為0.7，得到29個(gè)核心組合，其中黃芪與半夏、黃芪與黨參、黨參與半夏、黨參與陳皮等為排名靠前的藥物組合。（見(jiàn)表7）圖1為藥物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。將支持度個(gè)數(shù)設(shè)置為40，置信度≥0.7，得到23個(gè)核心關(guān)聯(lián)組合。（見(jiàn)表8）

表7 高頻藥物組合表（支持度≥0.3，置信度≥0.7）

圖1 藥物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（支持度≥0.3，置信度≥0.7）

表8 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析表（支持度≥0.3，置信度≥0.7）

2.5 藥物組方規(guī)律分析 本研究通過(guò)無(wú)監(jiān)督的聚類算法，將聚類個(gè)數(shù)設(shè)定為3進(jìn)行聚類分析。第一類：以黃芪、黨參、陳皮、半夏、茯苓為主的處方有72份；第二類：以黃芪、黨參、陳皮、半夏、白術(shù)為主的處方有33份；第三類：以黃芪、雞內(nèi)金、甘草、麥芽、雞血藤為主的處方有30份。（見(jiàn)表9）結(jié)合藥物頻數(shù)、關(guān)聯(lián)規(guī)則及聚類分析可知，“黃芪-黨參-陳皮-半夏-茯苓”為治療晚期胃癌的核心藥物組合。

表9 無(wú)監(jiān)督聚類核心組合（聚類個(gè)數(shù)為3）

2.6 “黃芪-黨參-陳皮-半夏-茯苓”的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.6.1 “黃芪-黨參-陳皮-半夏-茯苓”有效活性成分和靶點(diǎn) 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選藥物有效活性成分，結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充了黃芪[13-14]中的黃芪皂苷Ⅰ（astragaloside Ⅰ）、黃芪皂苷Ⅱ（astragaloside Ⅱ）、黃芪皂苷Ⅲ（astragaloside Ⅲ）、黃芪皂苷Ⅳ（astragaloside Ⅳ）；陳皮[15]中的橙皮甙（Hesperidin）。去重后得到有效活性成分77個(gè)（黃芪23個(gè)，黨參20個(gè)，陳皮6個(gè)，半夏12個(gè)，茯苓14個(gè)，黨參、半夏共同成分1個(gè)，黃芪、茯苓共同成分1個(gè)）。（見(jiàn)表10）

表10 “黃芪-黨參-陳皮-半夏-茯苓”有效活性成分

通過(guò)Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)排除5個(gè)無(wú)2D和3D結(jié)構(gòu)的化合物及3個(gè)Swiss Target Prediction平臺(tái)無(wú)法預(yù)測(cè)的化合物，最終通過(guò)該平臺(tái)獲取可預(yù)測(cè)有效化合物69個(gè)。將該平臺(tái)屬性為“homo sapiens”，可信度≥0.1，篩重后得到藥物靶點(diǎn)579個(gè)，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到了283個(gè)有效成分靶點(diǎn)，篩重后最終得到藥物靶點(diǎn)862個(gè)。

2.6.2 胃癌作用靶點(diǎn) 以GSE63089和GSE118916數(shù)據(jù)集中的胃癌樣本組織為研究對(duì)象，最終共獲得520個(gè)胃癌DEGs，包含366個(gè)上調(diào)基因和154個(gè)下調(diào)基因。圖2A為差異基因熱圖,圖2B為火山圖，圖中紅色和綠色分別代表為上調(diào)和下調(diào)基因，黑色為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因。

圖2 胃癌差異基因的熱圖

2.6.3 構(gòu)建“藥物-疾病”共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖 本研究利用Venn在線數(shù)據(jù)庫(kù)將862個(gè)藥物靶點(diǎn)和520個(gè)胃癌DEGs取交集后可得到58個(gè)“藥物-疾病”共同靶點(diǎn)。（見(jiàn)圖3）通過(guò)Cytoscape軟件中的CytoNCA插件，對(duì)獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化分析以獲得最顯著的靶點(diǎn)子網(wǎng)絡(luò)。以度中心性（Degree Centrality，DC）＞61和介度中心性（betweenness centrality, BC）＞600作為篩選條件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化分析。將共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖4-A，12 563個(gè)節(jié)點(diǎn)，63 587條邊）經(jīng)degree（＞61）過(guò)濾后得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖4-B，666個(gè)節(jié)點(diǎn)，28 308條邊），經(jīng)BC（＞600）得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖4-C中146個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 683條邊）。NTRK1、TP53、MCM2、CUL3、CDK2、FN1、ESR1、ITGA4、UBC、NPM 1、CUL1等為排名靠前的靶點(diǎn)。（見(jiàn)表11）

表11 排名前20 的核心靶點(diǎn)拓?fù)浞治霰?/p>

圖3 藥物靶點(diǎn)與胃癌DEGs 交集韋恩圖

圖4 共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.6.4 構(gòu)建“有效成分-共同靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖 通過(guò)Cytoscape 3.8.1軟件構(gòu)建“有效成分-共同靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。圖5中紫色倒三角形為靶點(diǎn)，橢圓形為有效成分，共涉及105個(gè)節(jié)點(diǎn)（58個(gè)基因和47個(gè)藥物成分），280條邊。MOL000098[quercetin，（槲皮素）]、MOL000006[luteolin，（木犀草素）]、MOL000354[isorhamnetin（異鼠李素）]、MOL000422[kaempferol，（山奈酚）]、MOL002714[baicalein，（黃芩素）]等為度值排名靠前的有效成分。

圖5 “有效成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.6.5 GO 和KEGG 富 集 分 析 通 過(guò)R 軟 件 的“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”包對(duì)58個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。共獲得485條GO功能富集通路，其中BP涉及細(xì)胞外基質(zhì)代謝、DNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控有絲分裂過(guò)程等，MF涉及金屬內(nèi)肽酶活性、氧化還原酶活性、蛋白酶活性等，CC涉及染色體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、蛋白激酶復(fù)合物等。

通過(guò)R軟件構(gòu)建58個(gè)共同靶點(diǎn)的KEGG通路富集圖，其涉及的通路包括細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、p53信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。（見(jiàn)圖6）此外，本研究利用Cytoscape構(gòu)建了靶基因與富集通路的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。此圖形共涉及41個(gè)節(jié)點(diǎn)（29個(gè)靶基因、12條富集通路），66條邊。圖7顯示，紅色倒三角形代表富集通路，綠色矩形代表靶基因，面積越大表示通路富集程度越顯著，基因參與富集通路越多。

圖6 KEGG 通路富集分析圖

圖7 KEGG 通路可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)與胃癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)性 本研究分析了Degree值排名前3的關(guān)鍵靶點(diǎn)（NTRK1、TP53、MCM2）與胃癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中，Meta分析納入10項(xiàng)研究，結(jié)果顯示：胃癌組織中NTRK1表達(dá)與正常組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Meta分析納入7項(xiàng)研究，結(jié)果顯示：TP53在所有差異表達(dá)基因中其中位數(shù)值排名為3 465.0（P＜0.05）。Meta分析納入12項(xiàng)研究結(jié)果顯示：MCM2在所有差異表達(dá)基因中的中位數(shù)值排名為2 386.0（P＜0.05）。（見(jiàn)圖8）表12為9項(xiàng)研究中3個(gè)關(guān)鍵靶基因所在研究的樣本量、過(guò)表達(dá)倍數(shù)、P值等。

表12 NTR1/TP53/MCM2 在不同研究中的表達(dá)情況

圖8 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中TP53/NTRK1/MCM2在胃癌組織中的表達(dá)

通 過(guò)Kaplan-Meier Plotter 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 發(fā) 現(xiàn)，NTRK1、TP53、MCM2高表達(dá)組的OS和FP均低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示NTRK1、TP53、MCM2表達(dá)水平越低，胃癌患者生存期越長(zhǎng)。（見(jiàn)圖9～10）

圖9 NTRK1/TP53/MCM2 的表達(dá)水平與胃癌總生存期（OS）的關(guān)系

圖10 NTRK1/TP53/MCM2 的表達(dá)水平與胃癌首次進(jìn)展時(shí)間（FP）的關(guān)系

3 討 論

胃癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在中國(guó)乃至全球惡性腫瘤中位居前列。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘的方法分析了135例晚期胃癌中醫(yī)治療受益人群，發(fā)現(xiàn)晚期胃癌男性發(fā)病率明顯高于女性，男女比例約為3∶2，此結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道男性發(fā)病率約為女性的2.22倍一致[22]。135例患者中超過(guò)85%患者的年齡在50歲以上。既往流行病學(xué)調(diào)查顯示，胃癌發(fā)病率隨年齡的增加逐漸升高，尤其是45歲以后，與本研究結(jié)果基本一致[23]?！包S芪-黨參-陳皮-半夏-茯苓”為治療晚期胃癌的核心藥物組合。黃芪和黨參是臨床上常用的補(bǔ)益類藥物。黃芪多糖可通過(guò)干擾細(xì)胞周期過(guò)程，抑制并殺傷人胃癌細(xì)胞MKN45、MGC-803的生長(zhǎng)，發(fā)揮抗胃癌作用[24]。黨參多糖可顯著抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[25]。半夏和陳皮為常用的燥濕化痰藥對(duì)。半夏總生物堿可通過(guò)損傷細(xì)胞DNA抑制人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞的增殖來(lái)發(fā)揮抗胃癌作用[26]。陳皮提取物可通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路，下調(diào)STAT3的磷酸化表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲[27]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茯苓可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，活化巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[28]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，“黃芪-黨參-陳皮-半夏-茯苓”共含有效活性成分為77個(gè)?！坝行С煞?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖顯示，黃芪中的槲皮素、異鼠李素、山奈酚、熊竹素，黨參中的木犀草素，半夏中的黃芩素，陳皮中的橙皮素、柚皮素，以及茯苓中的16α-羥基脫氫甲基丙烯酸等成分均為抗胃癌的主要有效成分。其中槲皮素、異鼠李素、山奈酚、木犀草素、黃芩素、橙皮素、柚皮素等均為黃酮類化合物。黃酮類化合物可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤新生血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[29-30]。有研究采用不同濃度的槲皮素處理胃癌細(xì)胞SGC-7901后發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)降低Cav-1表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲[31]。此外，槲皮素可通過(guò)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)Bax的表達(dá)、降低Bcl-2/Bax的水平，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[32]。朱棟良等[33]發(fā)現(xiàn)異鼠李素可通過(guò)p53等凋亡相關(guān)蛋白抑制人胃癌細(xì)胞MKN28的增殖，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗胃癌作用。SONG H等[34]發(fā)現(xiàn)山奈酚可通過(guò)下調(diào)CCNB1、CDK1、CDC25C的水平抑制胃癌MKN28和SGC7901細(xì)胞的增殖和小鼠移植瘤的生長(zhǎng)。REN L Q等[35]發(fā)現(xiàn)木犀草素聯(lián)合奧沙利鉑可通過(guò)改變細(xì)胞周期比例以抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HE P等[36]發(fā)現(xiàn)橙皮素可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，上調(diào)PTEN表達(dá)而誘導(dǎo)線粒體通路以增強(qiáng)順鉑對(duì)胃癌的抗腫瘤作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，核心藥物和疾病共同靶點(diǎn)為58個(gè)，其中NTRK1、TP53、MCM2、CUL3、CDK2、FN1、ESR1等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體酪氨酸激酶基因1（Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1，NTRK1）負(fù)責(zé)編碼TRK家族蛋白中高親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（TRKA蛋白），是NTRK基因家族成員之一，與EGFR、KRAS 基 因 突 變 和ROS1 融 合 基 因 不 同 時(shí) 存 在[37]。NTRK1基因融合廣泛存在于多種實(shí)體瘤中，但發(fā)生率因腫瘤類型不同而差異較大。其在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等常見(jiàn)腫瘤中發(fā)生率不足1%，在分泌性乳腺癌、嬰兒型纖維肉瘤等罕見(jiàn)腫瘤中則超過(guò)90%[38]。SHINOZAKI-USHIKU A等[39]于2020年首次報(bào)道了NTRK1基因重排發(fā)生在胃癌中，可能與侵襲性表型及廣泛的淋巴管浸潤(rùn)等組織學(xué)特征有關(guān)。腫瘤抑制因子p53（tumor suppressor p53, TP53）是一種重要的抑癌基因，約50%腫瘤存在TP53突變，且與腫瘤患者不良預(yù)后密切相關(guān)[40]。微小染色體維持蛋白2 （minichromosome maintenance complex component 2，MCM2）為微小染色體維持蛋白家族成員之一，過(guò)表達(dá)于增殖細(xì)胞以反映細(xì)胞增殖活性，可作為細(xì)胞增殖標(biāo)記物[41]。KATO H等[42]研究發(fā)現(xiàn)，MCM2在食管鱗癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理分期等有關(guān)，其在預(yù)后價(jià)值方面可能會(huì)成為比Ki-67更可靠和有用的標(biāo)記。

富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NTRK1、TP53、MCM2、CUL3、CDK2等58個(gè)共同靶點(diǎn)通過(guò)參與細(xì)胞外基質(zhì)代謝、DNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控有絲分裂、金屬內(nèi)肽酶活性、氧化還原酶活性、染色體結(jié)構(gòu)等過(guò)程，以及調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、p53信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等途徑發(fā)揮抗胃癌作用。細(xì)胞周期在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程中起重要作用，細(xì)胞周期進(jìn)程的異?；蛑袛鄷?huì)打亂細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡間的平衡，繼而導(dǎo)致腫瘤。CDK2是重要的細(xì)胞周期依賴性蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)使CDK2過(guò)表達(dá)以阻滯胃癌SGC-7901細(xì)胞周期于S期，發(fā)揮抗癌效應(yīng)[43]。有研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可通過(guò)細(xì)胞周期通路阻斷細(xì)胞G0期轉(zhuǎn)換為S期，且可阻斷細(xì)胞DNA合成和復(fù)制，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[44]。p53信號(hào)通路是以腫瘤抑制基因p53為核心且與許多基因相互作用而構(gòu)成的信號(hào)通路，其在調(diào)控細(xì)胞正常生命活動(dòng)中有重要作用。柚皮素可通過(guò)調(diào)控microRNA34a/Sirt1/p53信號(hào)通路發(fā)揮抗癌作用，而槲皮素可通過(guò)促進(jìn)p53的表達(dá)及增加p53的穩(wěn)定性以抑制腫瘤細(xì)胞增殖[45-46]。糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是由一系列復(fù)雜化學(xué)過(guò)程形成的異源性大分子物質(zhì)。RAGE是首個(gè)AGEs的受體，屬于免疫球蛋白超家族受體，在肝癌、直腸癌、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)。AGEs結(jié)合RAGE共同構(gòu)成了糖尿病中的AGE-RAGE信號(hào)通路[47-48]。AGEs可通過(guò)使RAGE過(guò)表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[49]。腫瘤壞死因子（TNF）可通過(guò)與特異性受體結(jié)合誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、分化、凋亡等過(guò)程[50]。TNF可通過(guò)激活NF-κB、JNK、細(xì)胞凋亡3條下游信號(hào)通路發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能。木犀草素可通過(guò)抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活性以抑制NF-κB靶定抗凋亡基因的表達(dá)，其尚可通過(guò)抑制NF-κB放大并延長(zhǎng)TNF-α誘導(dǎo)的JNK活性以發(fā)揮抗癌效應(yīng)[51]。

本研究通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，NTRK1、TP53、MCM2在胃癌組織中均高表達(dá)；其高表達(dá)組的OS和FP均低于低表達(dá)組，表明NTRK1、TP53、MCM2表達(dá)水平越低，胃癌患者生存期越長(zhǎng)。TP53突變被證明與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，但TP53的狀態(tài)與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系并未明確[52]。HAMAKAWA T等[53]通過(guò)檢測(cè)晚期胃癌患者血漿中TP53基因后發(fā)現(xiàn)，TP53水平升高與不良預(yù)后密切相關(guān)，且術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者TP53水平均升高。此結(jié)論與本研究通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)得出的觀點(diǎn)一致。MCM2是能準(zhǔn)確反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志物，可對(duì)腫瘤患者預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。YANG C等[54]通過(guò)檢測(cè)264例患者胃癌組織和癌旁組織中MCM2的水平后發(fā)現(xiàn)，MCM2在胃癌組織中的表達(dá)水平高于正常胃黏膜（P=0.04），且MCM2表達(dá)陰性的患者生存期明顯高于表達(dá)陽(yáng)性者（P＜0.05）。此結(jié)論與本研究通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)得出的結(jié)果一致。LIU M等[55]通過(guò)MCM2表達(dá)水平預(yù)測(cè)賁門癌的診斷和預(yù)后，發(fā)現(xiàn)MCM2與Ki67和PCNA的表達(dá)相關(guān)，且MCM2敏感性和陰性預(yù)測(cè)值優(yōu)于Ki67，是一種敏感、特異、高效的賁門癌標(biāo)志物，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1項(xiàng)大規(guī)模的中國(guó)肺癌患者NTRK1融合調(diào)查[56]顯示，21 155例肺癌患者中出現(xiàn)12例NTRK1融合陽(yáng)性，最終發(fā)現(xiàn)伴有多個(gè)融合的NTRK1+肺癌病例極為罕見(jiàn)，但NTRK1+融合的出現(xiàn)可能是EGFR TKIs的耐藥機(jī)制。但目前關(guān)于NTRK1在胃癌中的研究較少，SHINOZAKI-USHIKU A等[39]在2020年首次報(bào)道了NTRK1基因重排發(fā)生在胃癌中。關(guān)于其在胃癌中的表達(dá)和預(yù)后關(guān)系目前并不明確，需要未來(lái)大樣本的研究加以證實(shí)。

4 結(jié) 論

中醫(yī)藥治療晚期胃癌使用頻率最高和關(guān)聯(lián)程度最大的5味核心藥物為“黃芪-黨參-陳皮-半夏-茯苓”；“黃芪-黨參-陳皮-半夏-茯苓”可能通過(guò)其有效成分槲皮素、異鼠李素、山奈酚、木犀草素等調(diào)控NTRK1、TP53、MCM2、CUL3、CDK2等58個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，并通過(guò)細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等途徑參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗胃癌效應(yīng)；NTRK1、TP53、MCM2在胃癌組織中均高表達(dá)，三者高表達(dá)組OS和FP均低于低表達(dá)組，表明NTRK1、TP53、MCM2表達(dá)水平越低，胃癌患者生存期越長(zhǎng)。