王艾琳，謝 瑜，王 青，聶孝平，譚文波，張文云

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.長沙新林制藥有限公司，湖南 長沙 410203）

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)[Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.]的干燥根。防風(fēng)性微溫，味辛、甘，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效[1]。防風(fēng)中含有色原酮、香豆素、揮發(fā)油[2-3]等成分，其中色原酮作為主要活性成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等[2-5]作用。防風(fēng)臨床常用于治療感冒頭痛[6]等疾病。防風(fēng)藥材炮制工藝是否合理直接影響飲片質(zhì)量及其臨床療效?！逗槭霞灧健肥驾d防風(fēng)趁鮮“切薄片”[7]。2008年版《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》[8]和1997年版《內(nèi)蒙古自治區(qū)中藥飲片切制規(guī)范》[9]提及“悶潤”，且有多省份生產(chǎn)企業(yè)使用該工藝。2020年版《中華人民共和國藥典》中沿用《太平惠民和劑局方》[10]中防風(fēng)的傳統(tǒng)加工方式“藥材洗凈，潤透，切厚片，干燥”[1]。2021年內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)提倡防風(fēng)產(chǎn)地趁鮮加工，減少鮮藥干燥，避免復(fù)潤切制時部分有效成分水解?，F(xiàn)代關(guān)于防風(fēng)傳統(tǒng)加工方法中切制、干燥等工序[11-13]研究較深入，但忽略了潤藥工序的重要性。潤藥方法的選擇不僅決定藥材切制的難易程度及后續(xù)干燥時間，對減少藥材有效成分流失也具有重要影響。因此，防風(fēng)鮮藥材趁鮮加工和傳統(tǒng)潤藥加工方式對其有效成分含量影響如何有待進(jìn)一步比較研究。

本研究通過收集多個產(chǎn)區(qū)的防風(fēng)鮮藥材，以升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量為評價指標(biāo)，采用綜合加權(quán)評分及層次分析法[14-15]，比較趁鮮加工與傳統(tǒng)加工方法對防風(fēng)飲片外觀性狀及內(nèi)在成分含量的影響，探討防風(fēng)的不同炮制工藝，旨在為指導(dǎo)各產(chǎn)區(qū)防風(fēng)實際生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 防風(fēng)藥材樣品采集于俄羅斯、內(nèi)蒙古、東北、河北、安徽、甘肅6個地區(qū)。防風(fēng)樣品采集表見表1。經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院王青主任藥師鑒定為傘形科防風(fēng)[Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.]的干燥根。

表1 不同產(chǎn)地防風(fēng)樣品采集表

1.2 儀器與試藥 Aigent-1260高效液相色譜儀（安捷倫儀器設(shè)備有限公司）；KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；AG-285型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler公司）；B23ZH型水分測定儀[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；CT-C-Ⅲ型熱風(fēng)循環(huán)烘箱（臺州博大制藥機(jī)械科技有限公司）；BP200B型刨片機(jī)（亳州康華制藥設(shè)備有限公司）；常壓蒸煮池自制。

升麻素苷對照品（批號：MUST-22022704，純度：98.42%）、升麻素對照品（批號：MUST-22062117，純度：99.33%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（批號：MUST-22072610，純度：99.66%）、亥茅酚苷對照品（批號：MUST-220071618，純度：98.69%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇為色譜純；實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為依利特C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-水為流動相，梯度洗脫程序見表2。流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素苷、升麻素適量，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，制成5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素苷、升麻素質(zhì)量濃度分別為0.825 7、0.775 3、0.810 6、0.849 9 mg/mL對照品儲備液。分別精密吸取各對照品儲備液，制備成5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素苷、升麻素質(zhì)量濃度分別為24.771、11.631、64.852、29.747 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取防風(fēng)細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，50 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，收集續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗 按照“2.1”項下的色譜條件，分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定并記錄色譜圖。在上述條件下，升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷與其他雜質(zhì)峰無干擾，相鄰色譜峰分離度大于1.5，理論板數(shù)不少于4 000。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別吸取“2.2”項下對照品儲備液，加適量甲醇逐級稀釋到不同濃度。制成升麻素苷質(zhì)量濃度依次為16.213、64.852、81.065、121.598、162.130、202.663 μg/mL 的溶液，升麻素質(zhì)量濃度依次為8.499、29.747、42.495、67.992、84.990、101.988 μg/mL的溶液，亥茅酚苷質(zhì)量濃度依次為3.877、7.753、11.631、23.262、31.016、38.770 μg/mL的溶液；5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量濃度依次為8.257、24.771、41.285、66.056、82.570、99.084 μg/mL的溶液。分別精密吸取10 μL進(jìn)樣，按照“2.1”項下色譜條件，測定峰面積，以對照品濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得升麻素苷的線性回歸方程：Y=18.377X-27.796（r=0.999 9）；5-O-甲基維斯阿米醇苷的線性回歸方程：Y=20.409X-18.606（r=0.999 6）；亥茅酚苷的線性回歸方程：Y=25.462X-24.905（r=0.999 6）；升麻素的線性回歸方程：Y=29.12X-41.587（r=0.999 7）。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取“2.3”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定并記錄峰面積，結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和升麻素峰面積的RSD分別為0.49%、0.49%、0.50%、0.47%。表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.3”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，常溫條件下分別于0、2、4、8、12、24 h依次進(jìn)樣，測定并記錄峰面積。結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和升麻素峰面積的RSD分別為0.85%、0.18%、1.03%、0.30%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同一供試品細(xì)粉6份，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別測定，結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和升麻素的平均含量分別為0.315%、0.133%、0.051%、0.098%，RSD分別為1.27%、1.23%、0.95%、1.36%。表明該測定方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 稱量已知含量的同一樣品細(xì)粉約0.25 g，精密稱定，共6份，分別精密加入升麻素苷對照品1.0 mL、升麻素對照品0.4 mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品0.3 mL、亥茅酚苷對照品0.16 mL。按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行含量測定，計算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷的平均加樣回收率分別為98.85%、98.34%、99.16%、98.13%，RSD分別為0.97%、1.33%、1.28%、1.08%。表明該方法的準(zhǔn)確度良好。（見表3）

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

續(xù)表3：

2.6 不同加工工藝評價

2.6.1 綜合加權(quán)評分法[16]根據(jù)層次分析法，運(yùn)用SPSS Statistics 27軟件，將綜合評分設(shè)為目標(biāo)，將升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷的評分權(quán)重設(shè)為方案層，通過判斷矩陣率（CR）<0.1，數(shù)據(jù)合理，符合邏輯，權(quán)重分配結(jié)果見表4。確定升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷的權(quán)重系數(shù)分別36.825%、28.817%、26.039%、8.319%，再利用加權(quán)法，計算綜合OD值。

表4 成分指標(biāo)準(zhǔn)則層判斷矩陣

2.6.2 防風(fēng)藥材不同潤藥工藝對比 取同一批野生品防風(fēng)鮮藥材（JG3），分4份，每份500 g，分別以10 ℃冷水淋潤2 h、30 ℃溫水淋潤1 h、10 ℃冷水悶潤1 h、常壓直通蒸汽潤藥10 min將防風(fēng)潤藥至合適軟度，機(jī)切厚片后用60 ℃鼓風(fēng)干燥。所得4份防風(fēng)飲片按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下進(jìn)樣，測得升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷的含量，并計算4種色原酮（升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷）總含量及綜合OD值。結(jié)果顯示，10 ℃冷水悶潤1 h工藝加工后的防風(fēng)飲片皮部顏色加深，呈棕紅色，其升麻素苷、升麻素含量、色原酮總含量及綜合OD值最高；10 ℃冷水淋潤2 h工藝加工后的防風(fēng)飲片中5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量最高；潤藥的溫度及時間與升麻素苷、升麻素的含量成反比。經(jīng)比較，10 ℃冷水悶潤1 h或10 ℃冷水淋潤2 h工藝優(yōu)于其他潤藥工藝。（見表5）

表5 不同潤藥工藝指標(biāo)成分含量

2.6.3 防風(fēng)鮮藥材趁鮮切制不同干燥工藝對比 取同一批栽培品防風(fēng)鮮藥材（JG9），分4份，每份500 g，測得水分為（70±5）%。其中3份鮮藥材洗凈，機(jī)切至約5 mm，分別以60 ℃鼓風(fēng)干燥法、冷凍干燥法、曬干法制成飲片；第4份鮮藥材洗凈，曬至水分約50%，機(jī)切至約5 mm，60 ℃鼓風(fēng)干燥法制成飲片。上述4份防風(fēng)飲片，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下進(jìn)樣，測得升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷的含量，并計算4種色原酮總含量及綜合OD值。結(jié)果顯示，冷凍干燥法綜合OD值最高，且采用冷凍干燥法干燥的防風(fēng)飲片中升麻素苷含量和色原酮總含量最高；60 ℃鼓風(fēng)干燥法干燥的防風(fēng)飲片中5-O-甲基維斯阿米醇苷含量最高；與曬干法比較，冷凍干燥法干燥的防風(fēng)飲片升麻素苷含量提高了15.2%。研究發(fā)現(xiàn)，藥材先曬，外表皮水分快速揮發(fā)，造成外硬內(nèi)軟的質(zhì)地，切制過程中易產(chǎn)生連刀、外皮破碎及切面不平整的現(xiàn)象，影響外觀質(zhì)量并使飲片得率降低約15%，故曬法+60 ℃鼓風(fēng)干燥法不建議使用。經(jīng)比較，防風(fēng)鮮藥材趁鮮切片后經(jīng)冷凍干燥法或60 ℃鼓風(fēng)干燥法干燥優(yōu)于其他干燥方法。

表6 不同干燥工藝指標(biāo)成分含量

2.7 防風(fēng)鮮藥材趁鮮加工與藥材傳統(tǒng)加工工藝對比 取12批不同產(chǎn)地的防風(fēng)鮮藥材，測得水分為（65±3）%，每批分4等份，每份200 g。其中2份防風(fēng)鮮藥材按趁鮮加工流程：趁鮮機(jī)切至厚度約5 mm，分別以冷凍干燥法、60 ℃鼓風(fēng)干燥法制成飲片；剩余2份將鮮藥材按傳統(tǒng)加工流程：洗凈，曬干[測得水分為（8±0.5）%]，再分別采用10 ℃冷水悶潤1 h、10 ℃冷水淋潤2 h，潤至水分為（15±1.0）%，切厚片，60 ℃鼓風(fēng)干燥法制成飲片。上述經(jīng)不同炮制工藝加工成的40份防風(fēng)飲片，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見表7。結(jié)果表明，防風(fēng)鮮藥材趁鮮加工后采用冷凍干燥法干燥或防風(fēng)藥材經(jīng)傳統(tǒng)10 ℃冷水悶潤1 h后采用60 ℃鼓風(fēng)干燥法干燥，對防風(fēng)飲片含量影響較小。經(jīng)過不同加工工藝，各成分平均含量有差異，主要成分含量見雷達(dá)圖2。其中以升麻素苷、升麻素及5-O-甲基維斯阿米醇苷差異較大。防風(fēng)鮮藥材經(jīng)趁鮮加工后冷凍干燥制得的飲片中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量最高。防風(fēng)藥材經(jīng)10 ℃冷水悶潤1 h后切制，再經(jīng)60 ℃鼓風(fēng)干燥制得飲片較鮮藥材趁鮮加工或藥材經(jīng)10 ℃冷水淋潤2 h后切制，再經(jīng)60 ℃鼓風(fēng)干燥制得飲片中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量分別提高了3.86%、1.02%。

圖2 不同加工方法主要成分含量雷達(dá)圖

表7 不同產(chǎn)地加工工藝各成分含量結(jié)果

3 討 論

本研究通過比較不同傳統(tǒng)潤藥加工工藝與鮮藥材趁鮮加工工藝對防風(fēng)飲片質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)10 ℃冷水悶潤1 h后切制，用60 ℃鼓風(fēng)干燥制得的防風(fēng)飲片中升麻素苷、升麻素含量及色原酮總含量明顯高于趁鮮加工經(jīng)60 ℃鼓風(fēng)干燥制得的防風(fēng)飲片。冷水悶潤工藝與傳統(tǒng)“發(fā)汗”[17]工藝原理類似，利用堆積時藥材本身散發(fā)的熱量，可加速藥材內(nèi)部水分的擴(kuò)散[18]，利于軟化切片及提高后續(xù)干燥速度。10 ℃冷水悶潤1 h時自行產(chǎn)熱，可能與提高POD活性有關(guān)[19]，從而使升麻素苷、升麻素含量和4種色原酮總含量高于10 ℃冷水淋潤2 h。防風(fēng)中色原酮類成分主要集中在皮部[20]，冷水悶潤法使其皮部由棕黃色或棕色轉(zhuǎn)變?yōu)樽丶t色，斷面皮部的顏色深淺與內(nèi)在色原酮總量，尤其是升麻素苷、升麻素呈正相關(guān)。10 ℃冷水悶潤1 h后防風(fēng)藥材中的非結(jié)合水較鮮防風(fēng)已大幅降低，切制時最大程度減少藥材與水分的接觸、保留了色原酮類成分。

防風(fēng)鮮藥材趁鮮加工，再經(jīng)60 ℃鼓風(fēng)干燥的過程中，受自身含水量、干燥溫度、干燥時間的影響。其苷類成分水解加快，加工后飲片的升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷等含量明顯低于冷凍干燥法。冷凍干燥法能將待干燥品內(nèi)部水分直接由固態(tài)升華為氣態(tài)[21]，最大限度減少防風(fēng)中色原酮類成分的流失，從而使升麻素苷、升麻素含量明顯高于60 ℃鼓風(fēng)干燥等常規(guī)干燥方法。此外，冷凍干燥使野生品防風(fēng)斷面顏色鮮亮，皮部黃白色至黃色；栽培品防風(fēng)質(zhì)地由緊實變成疏松，皮部黃色產(chǎn)生裂隙，甚至裂隙延伸至木質(zhì)部，造成“鳳眼圈、菊花心[22]”的現(xiàn)象，增加了中藥飲片經(jīng)驗鑒別的難度。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)防風(fēng)鮮藥材趁鮮加工后經(jīng)冷凍干燥制得的飲片或防風(fēng)藥材采用10 ℃冷水悶潤1 h后切制，再經(jīng)60 ℃鼓風(fēng)干燥制得的飲片，其升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量及色原酮總含量均高于其他方法，可為企業(yè)結(jié)合自身生產(chǎn)條件選擇適宜生產(chǎn)工藝提供參考。