薛彩紅，劉 睿，滕 明

（南寧市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530001）

復方紫草解毒軟膏是南寧市中醫(yī)醫(yī)院的特色院內(nèi)制劑，全方由紫草、黃連、大黃、雞血藤、白及、珍珠粉、冰片7味中藥組成[1]。方中紫草清熱涼血，解毒透疹[2]；黃連瀉火解毒[3]；白及消腫生肌[4]；大黃涼血止血，活血祛瘀[5]；雞血藤行血補血[6]；珍珠粉收斂生肌[7]；冰片清熱止痛[8]。全方共奏活血解毒、去腐生肌的功效，對臨床上常見的瘡瘍流膿、創(chuàng)面難愈、新肌難生具有良好的治療作用，在我院皮膚科和外科得到了較為廣泛的應用。紫草清熱涼血，解毒透疹[9]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有抗炎作用[10]。紫草的有效成分紫草素可通過抑制人體炎癥反應、促進細胞增殖及抑制瘢痕的形成，從而對皮膚創(chuàng)傷愈合有明顯的療效[11]。紫草體外對金黃色葡萄球菌、流感病毒、單純皰疹病毒、多種真菌均有抑制作用[12]。紫草素是從紫草根部提取的一種蒽醌衍生物[9，13]，適用于濕疹、水火燙傷等[14-16]。紫草油已被2020年版《中華人民共和國藥典》一部收載，臨床上用于治療燒傷、燙傷等。

為了有效控制復方紫草解毒軟膏的質(zhì)量，本課題組采用薄層色譜（TLC）法對復方紫草解毒軟膏中紫草、黃連、大黃、雞血藤進行鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定復方紫草解毒軟膏中芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的含量，為復方紫草解毒軟膏的質(zhì)量標準提供定性和定量的檢測方法，以期為控制與評價復方紫草解毒軟膏的質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1 主要儀器 Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；ME155DU型電子天平（北京中恒日鑫科技有限公司梅特勒）；PHG-9206A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；MP511型PH計（上海三信儀表廠）；AR-300Y型密度測試儀（廣東宏拓儀器科技有限公司）；Simplicity超純水系統(tǒng)（密理博中國有限公司）。

1.2 試藥與試劑 復方紫草解毒軟膏（批號：20210501，20210502，20210503）均由南寧市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供；紫草（批號：20210801）、黃連（批號：20211102）、大黃（批號：20210701）、雞血藤（批號：20201201）、白及（批號：20210902）、珍珠粉（批號：20210501）、冰片（批號：20210901）均購于廣西仙茱中藥科技有限公司，經(jīng)南寧市中醫(yī)醫(yī)院藥學部薛彩紅副主任中藥師鑒定均為正品；左旋紫草素對照品（批號：110769-200506，含量：98.5%）、芒柄花素對照品（批號：111703-201504，含量：99.2%）、大黃素對照品（批號：110756-201913，含量：97.8%）、大黃酸對照品（批號：110757-201607，含量：98.2%）、大黃素甲醚對照品（批號：110758-202218，含量：97.3%）鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-202015）均購于中國食品藥品檢定研究院；硅膠G板（批號：20200912）購于青島海洋化工廠；甲醇（色譜純）（批號：208502）購于瀘天化（集團）有限責任公司；磷酸（分析純）（批號：T200110324）購于國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）（批號：190060）購于賽默飛世爾科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜（TLC）鑒別

2.1.1 紫草的薄層色譜（TLC）鑒別 取復方紫草解毒軟膏樣品10 g，加甲醇60 mL，60 ℃超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，加硅膠10 g，研勻，裝柱，用300 mL甲醇洗脫，洗脫液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取紫草對照藥材1 g，加石油醚（60～90 ℃）30 mL，超聲25 min，濾紙過濾，濾液濃縮到1 mL，作為紫草對照藥材溶液。按照制備供試品溶液的方法，制得缺紫草藥材的陰性對照品溶液。按照2020年版《中華人民共和國藥典》一部薄層色譜法，吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各4 μL、紫草對照藥材溶液3 μL，分別點于硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙醚-甲酸（6∶7∶0.5）為展開劑，展開，取出，自然晾干。結(jié)果供試品在與紫草對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照品無干擾。（見圖1）

2.1.2 黃連的薄層色譜（TLC）鑒別 取復方紫草解毒軟膏樣品10 g，加20 g硅膠，混勻，裝柱，用300 mL甲醇沖柱洗脫，洗脫液置于蒸發(fā)皿內(nèi)在水浴鍋上濃縮到2 mL，作為供試品溶液。取適量的鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為每毫升含0.80 mg的溶液，作為鹽酸小檗堿對照品溶液。按照制備供試品溶液的方法，制成缺黃連的陰性對照品溶液。按照2020年版《中華人民共和國藥典》一部薄層色譜法，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各4 μL、鹽酸小檗堿對照品溶液3 μL，分別點于硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水（6∶5∶1∶2∶0.5）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)展開，小心取出，自然晾干，置紫外光燈（360 nm）下檢視。結(jié)果供試品在與鹽酸小檗堿對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照品無干擾。（見圖2）

圖1紫草的薄層色譜圖

圖2 黃連的薄層色譜圖

2.1.3 大黃的薄層色譜（TLC）鑒別 取復方紫草解毒軟膏樣品10 g，加20 g硅膠，研均勻，上柱，用300 mL甲醇沖洗，收集洗脫液蒸干；然后加60 mL純水12 000 r/min離心10 min，取上清液濾過后加10 mL稀鹽酸，超聲30 min，再使用乙醚萃取2次，每次40 mL，合并乙醚液，水浴蒸干；加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取1g的大黃對照藥材，加30mL甲醇，超聲30min，過濾，濾液蒸干；殘渣加水30 mL使溶解，再加稀鹽酸2 mL，回流提取30 min，冷卻室溫；用乙醚萃取2次，每次30 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加1 mL的三氯甲烷使溶解，作為大黃對照藥材溶液。分別取適量的大黃酸、大黃素對照品，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為每1 mL含大黃酸0.70 mg、大黃素0.80 mg的對照品溶液。按照制備供試品溶液的方法，制備缺大黃的陰性對照品溶液。按照2020年版《中華人民共和國藥典》一部薄層色譜法，吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各5 μL、大黃酸和大黃素對照品溶液各3 μL、大黃對照藥材溶液4 μL，分別點于硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶3∶0.5）為展開劑，展開到合適位置，小心取出，自然晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品與大黃素對照品、大黃酸對照品和大黃對照藥材色譜相應位置上顯相同的斑點，且陰性對照品無干擾。（見圖3）

圖3 大黃的薄層色譜圖

2.1.4 雞血藤的薄層色譜（TLC）鑒別 取復方紫草解毒軟膏樣品10 g，加甲醇60 mL，水浴加熱25 min，邊加熱邊攪拌，趁熱濾過，濾液濃縮至2 mL；加入硅膠5 g拌勻，揮干溶劑，置硅膠柱（內(nèi)徑為1.0 cm，干法裝柱）上，依次用60 mL石油醚（60～90 ℃）、200 mL三氯甲烷-甲醇（10:1）洗脫，收集三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脫液，水浴蒸干；殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。取2 g雞血藤對照藥材，加入60 mL甲醇，超聲30 min，然后過濾，濾液水浴蒸干，加2 mL甲醇使殘渣溶解，加入3 g硅膠拌勻，揮干溶劑，置硅膠柱（內(nèi)徑為1.0 cm，干法裝柱）上，依次用30 mL石油醚（60～90 ℃）、60 mL三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脫，收集三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脫液，水浴蒸干；加1 mL三氯甲烷使殘渣溶解，作為雞血藤對照藥材溶液。另取適量的芒柄花素對照品，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為每1 mL含1.00 mg的芒柄花素溶液，作為芒柄花素對照品溶液。按照2020年版《中華人民共和國藥典》一部薄層色譜法，吸取供試品溶液和陰性樣品溶液各4 μL、芒柄花素對照品溶液3 μL、雞血藤對照藥材溶液3 μL，分別點于硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（10∶1）為展開劑，展開缸展開，小心取出，自然晾干；置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品與芒柄花素對照品和雞血藤對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照品無干擾。（見圖4）

圖4 雞血藤的薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為GeminiR-C18110?（4.6mm×250mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，芒柄花素檢測波長為260 nm[17]，左旋紫草素檢測波長為516 nm[18]，大黃酸、大黃素和大黃素甲醚檢測波長為254 nm[19]，進樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫程序表

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取芒柄花素對照品、左旋紫草素對照品、大黃酸對照品、大黃素對照品、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇制成每毫升含芒柄花素62.00 μg、左旋紫草素95.00 μg、大黃酸70.00 μg、大黃素51.00 μg、大黃素甲醚67.00 μg的溶液，即得混合對照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取復方紫草解毒軟膏5 g，精密稱定，加入60 mL石油醚（60～90 ℃）超聲使溶解，加入30 mL 0.25 mol/L氫氧化鈉溶液，萃取3次，合并3次萃取液，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)使其pH為2～3，用三氯甲烷萃取2次，每次50 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，用微孔濾膜（孔徑0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 陰性對照品溶液的制備 按照復方紫草解毒軟膏處方及生產(chǎn)工藝分別制備缺紫草、大黃、雞血藤的陰性對照品，并按“2.2.2.2”項下方法制備各陰性對照品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取供試品溶液、混合對照品溶液和3種陰性樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖5。結(jié)果色譜峰分離度均達到1.5以上，且陰性對照無干擾；理論塔板數(shù)以芒柄花素峰計算應不低于5 000。復方紫草解毒軟膏樣品中的芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素和大黃素甲醚成分都能與其他成分明顯分離，樣品中其他成分對測定成分沒有影響。

圖5 HPLC 色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系、定量限和檢測限考察 精密稱取芒柄花素對照品9.82 mg、左旋紫草素對照品10.16 mg、大黃酸對照品8.24 mg、大黃素對照品9.15 mg、大黃素甲醚對照品8.60 mg，置于50 mL容量瓶，加甲醇并稀釋至刻度，得混合對照品儲備液。精密吸取混合對照品儲備液0.5、1、2、4、8 mL，分別置25 mL容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，配制成5個不同濃度的芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚對照品溶液，搖勻，各吸取10 μL注入高效液相色譜儀，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得線性回歸方程和線性范圍；通過連續(xù)稀釋混合對照品溶液確定定量限和檢測限，當信號和噪聲之間的比值為3時所對應的濃度確定為檢測限，信號和噪聲之間的比值為10時所對應的濃度確定為定量限。（見表2）

表2 5 種成分的線性關(guān)系、定量限和檢出限

2.2.5 精密度試驗 取復方紫草解毒軟膏（批號：20210501），按照“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，結(jié)果芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.75%、1.21%、0.84%、1.32%、0.91%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實試驗 取復方紫草解毒軟膏（批號：20210501），按照“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，結(jié)果芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為2.04%、1.81%、1.15%、1.17%、2.53%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取復方紫草解毒軟膏（批號：20210501），按照“2.2.2.2”項下方法平行制備6份供試品，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，結(jié)果芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的平均含量分別為0.098、0.216、0.125、0.172、0.139 mg/g，RSD分別為2.53%、1.42%、2.75%、2.20%、2.81%，表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的復方紫草解毒軟膏樣品（批號：20210501）2.5 g，共6份，分別精密加入芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚對照品儲備液適量，按照“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，取適量樣品溶液13 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，按照“2.2.1”項下色譜條件進行測定，計算樣品中的芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素和大黃素甲醚的含量，并計算加樣回收率，結(jié)果芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為99.71%、98.60%、99.84%、99.42%、98.92%，RSD分別為2.93%、2.57%、2.80%、2.97%、2.77%（n=6），表明方法準確度良好。（見表3）

表3 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）

2.2.9 樣品含量測定 取不同批號復方紫草解毒軟膏，按照“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.2.1”項下色譜條件測定并計算復方紫草解毒軟膏中芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的含量。（見表4）

表4 復方紫草解毒軟膏樣品測定結(jié)果 （n=3，mg/g）

3 討 論

3.1 樣品處理分析 復方紫草解毒軟膏是一種軟膏劑，軟膏中的基質(zhì)對含量測定有一定的影響，所以采用石油醚溶解軟膏劑后再用酸液、堿液萃取制備供試品溶液，可有效減少基質(zhì)對含量測定的影響。同時在操作萃取時應使其水相和有機相充分分層，使油性基質(zhì)去掉，可以避免其對色譜柱造成的損壞。

3.2 色譜條件的選擇 查閱相關(guān)文獻[20-22]發(fā)現(xiàn)，芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的色譜條件多采用乙腈-磷酸系統(tǒng)，使用的磷酸濃度有0.05%、0.1%、0.2%。預實驗發(fā)現(xiàn)選用0.1%的磷酸濃度，峰形較好無拖尾現(xiàn)象。由于復方紫草解毒軟膏為復方軟膏制劑，成分較多，本研究通過多次反復調(diào)節(jié)流動相比例，分析色譜峰最終選取乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)梯度洗脫。該方法可以使樣品中芒柄花素、左旋紫草素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚色譜峰與其他成分的色譜峰達到較好的分離。

3.3 待測成分的選擇及分析 紫草主要有效成分左旋紫草素為萘醌類化合物，具有酚羥基，呈酸性，因此能被堿性溶液提取并溶于溶液中。由此左旋紫草素與油性基質(zhì)實現(xiàn)初步分離，然后用酸性溶液酸化后又可使左旋紫草素析出。大黃的主要活性成分大黃酸、大黃素和大黃素甲醚是蒽醌類化合物，雞血藤的主要有效成分芒柄花素是一種異黃酮類成分[23]。4種成分均具有酚羥基，呈酸性，因此能被堿性溶液提取并溶于溶液中。其成分與油性基質(zhì)實現(xiàn)初步分離，酸性溶液酸化后又可使其成分析出。綜上所述，實驗中軟膏劑樣品處理先用0.25 mol/L的氫氧化鈉溶液提取，再用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為2～3，然后再用三氯甲烷進行萃取。

3.4 薄層鑒別分析 由于復方紫草解毒軟膏為乳膏制劑，紫草、黃連、大黃和雞血藤藥材的薄層鑒別在TLC鑒別分析過程中樣品的處理極其重要。為了達到干擾小、易檢出的目的，本研究首先取部分乳膏用硅膠研和并干燥，使乳膏均勻吸附在硅膠上，為進一步的供試品制備提供前提物質(zhì)。復方紫草解毒軟膏使用石油醚（60～90 ℃）超聲使其溶解，然后加入0.25 mol/L氫氧化鈉溶液提取，用稀鹽酸調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值為2～3，再用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘渣加適量甲醇溶解即為供試品。