鄧 帥，周桂香，郭小峰，譚 寶

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030024；2.山西省中醫(yī)院，山西 太原 030000）

胃癌在人類消化系統(tǒng)癌癥中較為普遍，其發(fā)病率和死亡率均高居不下。在全球范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)生率約占全部腫瘤病例的5.6%，排于世界第五位；死亡率低于肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌，位列世界第四位[1]。近年來，研究[2]發(fā)現(xiàn)丹參內(nèi)的生物活性成分具有抗腫瘤的作用，并對(duì)胃癌也有較好的抑制效果。丹參素是丹參內(nèi)的生物活性成分之一，在體內(nèi)能夠發(fā)揮抗氧化、消炎、抑癌、活血化瘀等藥理作用[3]。已有實(shí)驗(yàn)證明丹參素對(duì)胃癌具有抑制作用，但對(duì)其作用機(jī)制尚不清楚[4]，本研究旨在探討丹參素對(duì)人胃腺癌AGS細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人胃腺癌AGS細(xì)胞株，受贈(zèng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)課題組。

1.2 試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：MA0212）、CCK8試劑盒（批號(hào)：SC119-02）均購買于正合生物公司；順鉑注射液（批號(hào)：601210605）購買于江蘇豪森藥業(yè)；丹參素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：MUST-21060920）購買于成都曼斯特生物科技公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑（批號(hào)：16H10A46）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（變性）（5X)（批號(hào)：16J20B12）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號(hào)：16J27C38）均購買于博士德生物公司；胎牛血清（批號(hào)：21090706）購買于四季青生物公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：Jan-18G）、Mei Lunbio飛克特超敏EGL發(fā)光液（批號(hào)：MA0186-Sep-17G）均購買于大連美倫公司；細(xì)胞周期染色試劑盒（批號(hào)：A10734）購買于北京聯(lián)科公司；Bax、BCL-2抗體（批號(hào)：3560006120、3560138106）均購買于thermo公司。

TD5A-WS型低速離心機(jī)（中科中佳有限公司）；DYY-2C型電泳儀（北京六一公司）；RT-6100型酶標(biāo)儀（MoLecuLar Devices公司）；BD-C6型流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫爾特公司）；DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一公司）；3111型細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（thermo公司）；CJ-2F型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾公司）。

1.3 藥物配制 于電子天平上準(zhǔn)確稱取4 mg丹參素標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于DMEM培養(yǎng)基中，配得200 μg/mL的丹參素溶液，按濃度稀釋，得到丹參素濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的溶液。

1.4 胃癌AGS細(xì)胞培養(yǎng) 用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）培養(yǎng)人胃癌AGS細(xì)胞，將其放于恒溫箱中生長(zhǎng)（溫度為37 ℃，CO2含量為5%），傳代條件為培養(yǎng)液顏色變淺或細(xì)胞貼至瓶底70%～100%。

1.5 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 將胃癌AGS細(xì)胞按6×104/mL的密度接種在96孔板內(nèi)，每孔放置100 μL細(xì)胞懸液，待其貼壁后，分別給予濃度為0 μg/mL（空白組）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹參素溶液及濃度為5 μg/mL的順鉑注射液溶液（陽性組）各100 μL，另取5個(gè)副孔只加入100 μL培養(yǎng)基，設(shè)為空白對(duì)照組，放于恒溫箱24、48 h后，加入110 μL的CCK-8工作混合液，放于恒溫箱孵育30 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)出450 nm處光密度（opticaL density，OD）值后，計(jì)算其抑制率。抑制率=[OD（Ac）-OD（As）]/[OD（Ac）-OD（Ab）]×100。As（含藥組，含有藥物、細(xì)胞、CCK8溶液、培養(yǎng)基），Ab（空白對(duì)照組，含有培養(yǎng)基、CCK8溶液，不含藥物及細(xì)胞），Ac（空白組，含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK8溶液，不含藥物）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 將胃癌AGS細(xì)胞按2×105/mL的密度接種在6孔板內(nèi)，每孔放置2 mL細(xì)胞懸液，待其貼壁后，分別給予濃度為0 μg/mL（空白組）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹參素溶液各2 mL，干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24 h、48 h后，胰酶消化、離心、PBS重懸、最后使用預(yù)冷的無水乙醇固定細(xì)胞。在檢測(cè)時(shí)離心細(xì)胞，棄去含有無水乙醇的上清液，加入2 mL的PBS靜置15 min后離心，吸出上清液并丟棄，加入1 mL DNA staining solution后放于暗處避光30 min后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將胃癌AGS細(xì)胞按2×105/mL的密度接種在6孔板內(nèi)，每孔放置2 mL細(xì)胞懸液，待其貼壁后，分別給予濃度為0 μg/mL（空白組）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹參素溶液各2 mL，干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24 h、48 h后，分別進(jìn)行以下步驟操作：胰酶消化、離心、棄上清液、加預(yù)冷PBS后離心、棄上清液、加200 μL Bing Buffer重懸細(xì)胞、吸取一半重懸細(xì)胞放于流式管中、加入5 μL AV和10 μL PI、避光15 min、加入400 μL Bing Buffer后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)情況 將胃癌AGS細(xì)胞按4×105/mL的密度接種在6孔板內(nèi)，每孔放置2 mL細(xì)胞懸液，待其貼壁后，分別給予濃度為0 μg/mL（空白組）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹參素溶液及濃度為5 μg/mL的順鉑注射液（陽性組）各2 mL干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞，放于恒溫箱培養(yǎng)24 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集，于冰上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，裂解完成后在低溫離心機(jī)上進(jìn)行離心，待結(jié)束后對(duì)蛋白進(jìn)行提取并對(duì)所得蛋白定量分析，煮沸并收集變性蛋白，計(jì)算上樣量。然后按照配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜這一順序收集轉(zhuǎn)膜成功的PVDF膜，將膜放于牛奶中封閉，于2h后用TBST每隔10 min對(duì)其進(jìn)行清洗，共計(jì)3次，加入稀釋500倍的一抗后放于4 ℃冰箱過夜，第2天依法洗膜3次放于稀釋5 000倍的二抗中，1 h后依法洗膜3次，最后加入ECL發(fā)光液行顯影分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 從Excel數(shù)據(jù)表中導(dǎo)入數(shù)據(jù)信息，用SPSS 25.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)使用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丹參素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖抑制率的影響 除空白組外，丹參素同一濃度不同時(shí)間段對(duì)胃癌AGS細(xì)胞均具有抑制作用，其抑制率隨著藥物的作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高（P<0.05），說明丹參素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的抑制具有時(shí)間依賴關(guān)系；與空白組比較，低、中、高濃度組的丹參素干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24 h，可使胃癌AGS細(xì)胞抑制率從8.10%上升到24.21%，干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞48h，可使胃癌AGS細(xì)胞抑制率從15.24%上升到47.45%（P<0.05），說明丹參素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的抑制具有濃度依賴關(guān)系。陽性組對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的抑制率明顯高于高濃度組（P<0.05)。結(jié)果表明丹參素干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24、48 h，能呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制胃癌AGS細(xì)胞的生長(zhǎng)。而陽性組對(duì)胃癌AGS的抑制率優(yōu)于丹參素。（見表1）

表1 丹參素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞增殖抑制率的影響 （x±s,%）

2.2 丹參素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響 丹參素干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24 h凋亡率如圖1所示，與空白組比較，低、中、高濃度組丹參素干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞后凋亡率分別為6.4%、12.2%、23.8%；干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞48 h凋亡率如圖2所示，與空白組比較，低、中、高濃度組丹參素干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞后凋亡率分別為12.7%、21.1%、52.5%。結(jié)果表明，丹參素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞有促凋亡作用，其凋亡率隨著丹參素濃度的增加而升高（P<0.05）。

圖1 丹參素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞凋亡的影響（24 h）

圖2 丹參素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞凋亡的影響（48 h）

2.3 丹參素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞周期的影響 丹參素干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞24 h，對(duì)其周期影響如圖3所示，與空白組比較，低、中、高濃度組的丹參素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞G2/M期具有抑制作用，能夠使G2/M期細(xì)胞數(shù)目顯著增加，其抑制率從27.14%上升到50.26%（P<0.05）。丹參素干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞48 h，對(duì)其周期影響如圖4所示，與空白組比較，低、中、高濃度組的丹參素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞G2/M期具有抑制作用，能夠顯著抑制G2/M期的細(xì)胞數(shù)，其抑制效果從40.94%上升到73.55%（P<0.05）。結(jié)果表明，丹參素干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞后能將其周期阻滯于G2/M期。

圖3 丹參素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞周期的影響（24 h）

圖4 丹參素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞周期的影響（48 h）

2.4 丹參素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞不同蛋白表達(dá)的影響 丹參素干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞后對(duì)不同蛋白表達(dá)的影響如圖5所示，與空白組比較，低、中、高濃度組丹參素及陽性組對(duì)胃癌AGS細(xì)胞Bax、p53、Cytochrome C蛋白的表達(dá)具有促進(jìn)作用（P<0.05），對(duì)Bcl-2蛋白的表達(dá)具有抑制作用（P<0.05）。與丹參素高濃度組比較，陽性組Bax、Cytochrome C、p53蛋白表達(dá)升高明顯，Bcl-2蛋白表達(dá)降低明顯（P<0.05）。結(jié)果表明丹參素能夠抑制胃癌AGS細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bax、p53、Cytochrome C蛋白的表達(dá)，并呈劑量依賴關(guān)系。陽性組對(duì)胃癌AGS細(xì)胞Bcl-2蛋白的抑制效果及對(duì)p53、Cytochrome C、Bax蛋白的促進(jìn)效果較丹參素好。

圖5 丹參素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞不同蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

近年來，由于中藥抗癌取得了良好的效果，丹參及其有效成分被發(fā)現(xiàn)對(duì)胃癌具有較好抑制的效果，但大多是對(duì)其脂溶性成分的研究，對(duì)其水溶性成分的研究較少[5]。由于丹參素是丹參的水溶性成分之一，因此本實(shí)驗(yàn)采用丹參素作為實(shí)驗(yàn)藥物。研究表明丹參素可以通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)因子，來抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)并對(duì)癌細(xì)胞的凋亡起著積極作用[6-8]。本實(shí)驗(yàn)通過CCK8試劑檢測(cè)證實(shí)丹參素可以對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，表明丹參素可以抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了丹參素具有抗腫瘤作用。

細(xì)胞凋亡具有獨(dú)特的生化和遺傳途徑，是細(xì)胞受到體內(nèi)多種信號(hào)分子影響所發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡，在正常組織的發(fā)育和體內(nèi)平衡中起關(guān)鍵作用[9-10]。細(xì)胞凋亡受阻可以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，調(diào)控信號(hào)分子可以使細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期是按照一定順序在細(xì)胞內(nèi)不斷發(fā)生的一組事件，細(xì)胞能夠正常進(jìn)行生長(zhǎng)與分裂是因?yàn)榧?xì)胞能夠嚴(yán)格按照G0/G1→S→G2→M這一順序進(jìn)行[11-12]。如果細(xì)胞周期被阻滯于某一階段，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖分化異常，最終凋亡，這表明周期阻滯是藥物發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制之一[13]。楊華等[4]發(fā)現(xiàn)丹參素可以通過周期阻滯來促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡；畢明慧等[14]使用丹參素作用于肝癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)p53高表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡起著積極作用；賈金靖等[15]發(fā)現(xiàn)丹參素可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白來控制銀屑樣細(xì)胞凋亡；彭汝琴等[16]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹參素能通過調(diào)控Bax、Bcl-2等凋亡蛋白來加速肝星狀細(xì)胞凋亡。這提示丹參素可以通過多種途徑來促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，將丹參素作用于胃癌AGS細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率增加，G2/M期細(xì)胞比例上升，由此推斷丹參素能夠通過G2/M期阻滯來抑制胃癌AGS細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Bax、BCL-2蛋白與線粒體凋亡有著密切關(guān)聯(lián)，在促進(jìn)或抑制線粒體功能障礙引發(fā)的內(nèi)在凋亡途徑中起關(guān)鍵作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2比值發(fā)生變化會(huì)使膜電位的穩(wěn)態(tài)受到影響，使線粒體膜電位發(fā)生改變，導(dǎo)致與線粒體凋亡密切相關(guān)的Cytochrome C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)與Apaf1結(jié)合發(fā)生寡聚化，引起Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使凋亡程序開始進(jìn)行，從而引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18-23]。有研究[24-25]發(fā)現(xiàn)，DNA的損傷會(huì)活化p53。這時(shí)p53能夠作為一個(gè)上游基因，調(diào)控Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)來強(qiáng)化線粒體凋亡途徑。這表明線粒體凋亡途徑有Bax、Bcl-2、Cytochrome C、p53蛋白參與。在本實(shí)驗(yàn)中，將丹參素作用于胃癌AGS細(xì)胞后，p53、Bax、Cytochrome C蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，這表明丹參素促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞凋亡可以通過啟動(dòng)線粒體凋亡進(jìn)行。

綜上所述，丹參素能夠抑制胃癌AGS細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與丹參素阻滯細(xì)胞于G2/M期、啟動(dòng)線粒體凋亡有關(guān)。