趙金兵，王莫離，王鐵軍，石建州，姚倫廣

（1.南陽師范學院，河南 南陽 473061；2.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南 南陽 473000）

趙金兵，王莫離，王鐵軍，等.非洲豬瘟病毒pS273R 蛋白的生物信息學分析［J］.畜牧與飼料科學，2023，44（2）：32-38.

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家豬和野豬引起的一種急性、出血性、烈性傳染病。該病于1921 年首次報道在肯尼亞暴發(fā)，百年來一直在世界各地流行蔓延。2018 年在我國遼寧省沈陽市首次出現(xiàn)ASF 疫情，之后迅速席卷全國。ASFV 屬于核質巨DNA 病毒（nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDVs）超家族［1］，是ASF 病毒科（Asfarviridae）ASF 病毒屬（Asfivirus）唯一成員。ASFV 病毒粒子的直徑260～300 nm，是線性雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）囊膜病毒，基因組大小為170～194 kbp［2］，含有150～167 個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）［3］，成熟病毒粒子的基因組依次包裹著內核芯殼 （core shell）、內膜（inner envelope）、衣殼（caspid）和外囊膜（inner envelope）4 層蛋白殼［4］。

ASFV 結構特征復雜、蛋白功能多樣，導致ASFV 逃逸適應性免疫應答和干擾宿主天然免疫系統(tǒng)，易于抑制和逃避宿主的免疫，便于增殖，使這種巨型病毒難以控制。ASFV 基因組編碼的蛋白參與病毒生命周期的調控以及免疫逃逸［5-6］。病毒蛋白是解析抗原結構、認識蛋白功能、尋找藥物靶點、制備抗體、建立檢測方法、研制疫苗的基礎和前提，因此，分析ASFV 抗原蛋白是ASFV 免疫學和疫苗學研究的關鍵。ASFV 內核芯殼蛋白主要包括CP2475L 基因編碼的多聚蛋白前體pp220 和CP530R 基因編碼的多聚蛋白前體pp62，二者在蛋白酶pS273R 切割加工下，水解成多個成熟的病毒結構蛋白產(chǎn)物，分別為p150、p37、p34、p14、p5、p35、p15、p8［7］，均是ASFV 內核芯殼的重要組分，影響蛋白核心包裝與成熟［6］。pS273R 具有重要的生物學功能，介導ASFV 的復制和宿主的炎癥反應等過程，通過非典型切割Gasdermin-D （GSDMD）的途徑抑制細胞焦亡［8］。pS273R 蛋白主要的結構域有核心結構域與新穎的能夠維持酶活性的N-端手臂結構域；C 端結構域包含由催化三聯(lián)體Cys-His-Asn 組成的核心結構域，在結構相似度上，與半胱氨酸類蛋白酶高度相似［9］。pS273R 蛋白屬于半胱氨酸蛋白酶家族，具有SUMO-1 樣蛋白酶保守的催化基序特征，合成于病毒感染早期，主要定位在胞質 “病毒工廠”。pS273R 蛋白是探究ASFV 內核芯殼蛋白結構組成、分布位置、作用功能的前提和基礎，在研制ASFV 抑制劑等抗病毒藥物方面具有潛在的應用價值。

ASF 對養(yǎng)豬業(yè)構成重大威脅，是全球養(yǎng)豬業(yè)的災難性疾病，防控形勢十分嚴峻。目前尚無商業(yè)化疫苗和治療藥物［10］，撲殺成為控制ASF 疫情的首選方法。2020 年我國出現(xiàn)了低致死率的ASF 基因Ⅱ型自然變異流行株，水平傳播能力強，潛伏期長，具有一定的隱蔽性，變異株和經(jīng)典株共存、共流行，使早期診斷難度增加，監(jiān)測和精準清除更加困難，給ASF 的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)［11］。探索解析ASFV 感染、致病、免疫逃逸等機制是亟須闡明的科學問題，了解與ASFV 基因組復制、侵染、免疫逃逸等環(huán)節(jié)相關的關鍵蛋白的結構和功能，篩選抑制劑的有效靶標，研發(fā)疫苗和藥物，對ASF 的防治具有重要意義。

廣泛應用于各個領域的生物信息學（bioinformatics）是一門新興于20 世紀末的交叉學科。生物信息學主要通過生命科學和計算機科學綜合處理并解析采集獲得的生物學信息大數(shù)據(jù)，是一種高效的預測分析手段。隨著科學技術的快速發(fā)展和各類數(shù)據(jù)庫的不斷完善，生物信息學在生命科學研究領域的重要性越加凸顯，在促進生命科學發(fā)展方面是一種必不可少的研究工具。近年來，生物信息學在免疫學和獸醫(yī)學領域也受到廣泛的關注與應用。利用生物信息學的分析結果能夠減少前期試驗的隨機性和盲目性，有助于有針對性地開展驗證性試驗，減少不必要的研究試驗，節(jié)省時間，加速試驗進程，提高試驗效率。

該研究采用生物信息學方法分析不同ASFV毒株的pS273R 基因序列同源性以及遺傳進化關系，預測pS273R 蛋白的理化性質、二級結構、磷酸化位點、糖基化修飾、亞細胞定位、三級結構等，以期為pS273R 蛋白結構和功能的深入解析以及ASFV 抑制劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 pS273R 基因序列同源性及遺傳進化分析

從非洲豬瘟病毒數(shù)據(jù)庫 （The African Swine Fever Virus Database，ASFVdb）（http：//asfvdb.popgenetics.net/）中下載43 個不同毒株的pS273R 基因序列，使用DNAMAN 6.0 和DNAStar 7.0 軟件分析其核苷酸序列同源性以及遺傳進化關系。

1.2 pS273R 蛋白理化性質預測

利用ExPASy-ProtParam 在線軟件（http://web.expasy.org/protparam/）分析pS273R 基因編碼蛋白的氨基酸組成及理化性質。

1.3 pS273R 蛋白二級結構、磷酸化位點、糖基化修飾分析及亞細胞定位

利 用SOPMA （http://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page =npsa_sop -ma.html）對pS273R 蛋白二級結構進行在線分析。使用Net-Phos 3.1 軟件（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）分析磷酸化位點。應用NetNGlyc 1.0 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc -1.0）在 線 軟 件 分 析pS273R 蛋白糖基化修飾。通過在線分析軟件PSORTII（https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl）預測分析pS273R 蛋白亞細胞定位。

1.4 pS273R 蛋白三級結構預測

利用在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預測分析pS273R 蛋白的三級結構。

2 結果與分析

2.1 不同毒株的pS273R 基因序列同源性及遺傳進化關系分析

分離自中國的5 個ASFV 毒株（China_HLJ_20 18、China_ASFV-SY18_2018、China_AnhuiXCGQ_2018、China_wbBS01_2018、China_LN_2018）的pS2 73R 基因序列同源性為100%，與分離自其他國家的38 個不同ASFV 毒株的pS273R 基因序列同源性在93.60%～100%（見圖1）。

圖1 43 株ASFV 的pS273R 基因序列同源性比較

通過構建進化樹發(fā)現(xiàn)，43 株ASFV 的pS273R基因序列總體分為2 類，即歐洲分支和非洲分支，中國的ASFV 毒株與歐洲分支的親緣關系較近，提示中國毒株可能來源于歐洲（見圖2）。

圖2 43 株ASFV 的pS273R 基因序列遺傳進化分析

2.2 pS273R 蛋白理化性質預測

pS273R 蛋白由4 415 個原子組成，分子式為C1410H2196N386O407S16，相對分子質量為31.58 kDa。由273 個氨基酸組成，賴氨酸（lysine）、蘇氨酸（threonine）、亮氨酸（leucine）所占比例較高，分別為8.4%、7.7%、7.3%。其中，帶正電荷的殘基（arginine+lysine）總數(shù)為38 個，帶負電荷的殘基（aspartic acid+glutamate）總數(shù)為30 個。理論等電點（pI）為8.96。在哺乳動物體外網(wǎng)織紅細胞中的半衰期是30 h，脂肪系數(shù)為72.45，不穩(wěn)定系數(shù)為44.89，總平均親水性 （grand average of hydropathicity，GRAVY）是-0.447。

疏水性和親水性是蛋白質的重要特性，這2項指標對于預測分析蛋白質二級結構具有參考性。利用ExPASy（https://www.expasy.org/）網(wǎng)站中的ProScale 在線工具分析pS273R 蛋白，獲得pS273R 蛋白親疏水性序列分析圖譜。以0 為界，正值和負值分別指氨基酸的疏水性與親水性。正值越大疏水性越強；反之，負數(shù)絕對值越大，則其親水性越強。預測值在-0.5～0.5 時，推測氨基酸可能屬于兩性氨基酸。ASFV 的pS273R 蛋白分析結果表明，第172 位的異亮氨酸（isoleucine）疏水性最強，分值為1.311；位于第228 位的絲氨酸（serine）是親水性最強的氨基酸，分值為-2.411（見圖3）。分析結果顯示，pS273R 蛋白存在數(shù)量不少的親水域，該結果和理化性質中總平均親水性（GRAVY）的結果是一致的，綜合分析數(shù)據(jù)表明pS273R 蛋白是一種親水性蛋白。

圖3 pS273R 蛋白的疏水性分析結果

2.3 pS273R 蛋白二級結構分析與亞細胞定位

多肽鏈的空間局部構成與形狀是蛋白質的二級結構，蛋白質的肽鏈依靠氫鍵按照一維的方向進行排列分布，從而形成了具有周期結構特征的構象［12］。二級結構的主要類型包括4 種：α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規(guī)卷曲。通過ExPASy 網(wǎng)站的SOPMA 在線工具對pS273R 蛋白的氨基酸序列二級結構進行預測分析。結果表明，pS273R 蛋白的二級結構以α-螺旋（Hh）、延伸鏈（Ee）、β-轉角（Tt）、無規(guī)卷曲（Cc）4 種形式為主。pS273R 蛋白的α-螺旋（Hh）有118 個氨基酸，占氨基酸總數(shù)的43.22%；延伸鏈（Ee）有43 個氨基酸，占氨基酸總數(shù)的15.75%；β-轉角（Tt）有11 個氨基酸，占氨基酸總數(shù)的4.03%；無規(guī)卷曲（Cc）有101 個氨基酸，占氨基酸總數(shù)的37.00%，氨基酸的整條鏈貫穿了這4 種不同的結構（見圖4）。

圖4 ASFV 的pS273R 蛋白二級結構分析結果

通過NetPhos 3.1 軟件分析發(fā)現(xiàn) （見圖5）：pS273R 蛋白存在28 個磷酸化位點，分別為12 個絲氨酸 （serine）（紅色）、12 個蘇氨酸（threonine）（綠色）和4 個酪氨酸（tyrosine）（藍色），包含PKA、PKC、unsp、cdk5、GSK3、SRC、CKI、CKII、DNAPK、INSR、cdc2 總共11 類蛋白質激酶結合位點。

圖5 ASFV 的pS273R 蛋白磷酸化位點分析

利用NetNGlyc 1.0 Server 在線軟件分析pS273R 蛋白糖基化修飾，在第83 位和第246 位天冬酰胺殘基上各存在1 個潛在的N-糖基化修飾（見圖6）。

圖6 ASFV 的pS273R 蛋白糖基化位點分析

應用PSORTII 軟件預測pS273R 蛋白的亞細胞定位，在ASFV 感染宿主細胞后，宿主細胞內可能存在的分布位置有以下幾種可能：首先存在可能性最高的是位于細胞的胞質中（P=47.8%），其次是線粒體，可能性為26.1%，定位于細胞核的概率為13.0%，此外，存在于細胞骨架、空泡、過氧化物酶中的可能性均為4.3%。

2.4 pS273R 蛋白的三級結構分析

利用SWISS-MODEL 對pS273R 蛋白的三級結構進行預測分析，結果顯示，pS273R 蛋白的三級結構是由二級結構α-螺旋、β-轉角、β-折疊以及無規(guī)卷曲等經(jīng)過旋轉、折疊與卷曲等生物過程而形成（見圖7），與6lj9.1.A（crystal structure of Se-Met ASFV pS273R protease）的同源性為97.07%。

圖7 ASFV 的pS273R 蛋白的三級結構預測

3 討論

利用生物信息學工具分析目的蛋白質，預測蛋白質的同源性系統(tǒng)進化、理化特性、物理結構等重要信息，對探析蛋白質的結構與功能、功能與機制具有參考價值，能夠為將要開展的研究工作提供新的思路和線索［13-14］。該研究分析表明，pS273R基因相對保守，國內流行的5 個ASFV 毒株的pS273R 基因序列相同，與國外其他38 個毒株的同源性在93.60%～100%；預測pS273R 蛋白有2個潛在的N-糖基化修飾位點，糖基化對真核生物蛋白質的抗原表位和熱穩(wěn)定性具有一定程度的影響［15］。病毒蛋白質的二級結構與抗原決定簇的關系密切，線性B 細胞表位含有的親水性氨基酸數(shù)量越多，肽段區(qū)域的柔韌性能越高，更有利于抗原與抗體嵌合［16］。作為蛋白質中心的“支架”β-折疊的化學鍵，其鍵能越高，越不利于實現(xiàn)嵌合抗體；而表面的無規(guī)則卷曲結構易于識別并結合抗體，該位置成為抗原表位的潛力更大［17］。pS273R 蛋白是ASFV 復制、核成熟以及感染宿主不可缺少的酶，抑制pS273R 的酶活性，可影響水解多聚蛋白前體的加工過程，導致病毒滴度下降，抑制病毒增殖；而抑制多聚蛋白前體的表達，組裝形成的20面體空衣殼喪失感染性［18-19］。新的研究證實了pS273R 蛋白可切割GSDMD，從而阻礙了細胞焦亡的啟動，便于病毒的復制，明確了pS273R 蛋白在炎癥反應和病毒復制中的關鍵作用，揭示了一種新的ASFV 抑制細胞焦亡的作用機制［8］。pS273R 蛋白存在大量的α-螺旋和無規(guī)則卷曲結構，是具有較多潛在B 細胞抗原表位的親水性蛋白，可為抗ASFV 藥物的研發(fā)提供候選分子靶標。

4 結論

對ASFV 的pS273R 基因和pS273R 蛋白進行了生物信息學分析，揭示了不同國家ASFV 流行毒株pS273R 基因的同源性及進化關系，預測了pS273R 蛋白的理化性質、二級結構、磷酸化位點、糖基化修飾、亞細胞定位、三級結構等關鍵信息，研究結果可為進一步探究ASFV 的感染機制以及研制抗ASFV 藥物提供參考。