吳夢帆，吳利敏＊

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

近幾年來，對Wnt/β-catenin信號通路在人類和動物胚胎發(fā)育、細(xì)胞命運(yùn)和疾病發(fā)病率調(diào)節(jié)作用的研究和報(bào)道越來越多。Wnt/β-catenin信號通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路，廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物[1]。在正常的體細(xì)胞中，β-catenin只是作為一種細(xì)胞骨架蛋白在胞膜處與E-cadherin形成復(fù)合體對維持同型細(xì)胞的黏附、防止細(xì)胞的移動發(fā)揮作用。只有當(dāng)細(xì)胞外Wnt信號分子與細(xì)胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結(jié)合激活胞內(nèi)的散亂蛋白導(dǎo)致GSK-3β失活，使β-catenin避免被磷酸化而遭降解的命運(yùn)，β-catenin才能在胞質(zhì)中積累起來。當(dāng)胞質(zhì)中β-catenin的濃度達(dá)到一定水平時(shí)，就可向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。在胞核中β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子家族LEF/TCF結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化、成熟。顯然，在這條信號通路中β-catenin發(fā)揮了重要作用，其在胞質(zhì)中積累繼而向胞核的轉(zhuǎn)位，被認(rèn)為是該信號通路被激活的標(biāo)志[3]。

已有研究表明，Wnt信號通路中β-catenin的過表達(dá)或抑制會導(dǎo)致脊椎動物的發(fā)育異常。例如：在斑馬魚胚胎中，過表達(dá)β-catenin會導(dǎo)致斑馬魚第二體軸的形成[4]，β-catenin的抑制物過表達(dá)會降低背部基因的表達(dá)，產(chǎn)生腹部化的胚胎[5]；在爪蟾胚胎早期發(fā)育過程中抑制β-catenin的表達(dá)最終會破壞背部組織的形成[6]。在小鼠中，β-catenin缺失會損害代謝性肝分區(qū)和肝臟增殖[7]，而β-catenin過表達(dá)會導(dǎo)致代謝分區(qū)蛋白不受控制地表達(dá)，并導(dǎo)致小鼠肝臟生長不受控制[8]；βcatenin的缺失也會導(dǎo)致小鼠的低骨量表型[9]和眼組織上皮層異常和缺陷[10]。以上結(jié)果暗示，β-catenin參與脊椎動物組織胚胎發(fā)育和器官發(fā)生過程。

淇河鯽（Carassius auratus in Qihe river)屬鯉形目（Cypriniformes)鯉科（Cyprinidae)鯉亞科（Cyprinidae)，是天然的三倍體魚類，具有兩性生殖和雌核發(fā)育兩種繁殖方式。通過異源精子刺激，進(jìn)行雌核發(fā)育，可產(chǎn)生全雌性個(gè)體。本研究用免疫組化法檢測βcatenin在淇河鯽各組織如眼、腦、鰓、軟骨、脾、肝、腸、腎和卵巢細(xì)胞中細(xì)胞定位。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究Wnt/β-catenin途徑在硬骨魚發(fā)育和器官發(fā)生中的作用提供理論和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地的淇河鯽作為實(shí)驗(yàn)材料。養(yǎng)殖采用帶有循環(huán)曝氣淡水養(yǎng)殖系統(tǒng)的大型養(yǎng)殖池。環(huán)境溫度保持在24℃左右，光照周期為14 h光照、10 h黑暗。在繁殖季節(jié)將雌性淇河鯽與雄性鯉魚按8:1的比例放入親魚池，人工誘導(dǎo)產(chǎn)卵。受精卵在23℃的環(huán)境下孵育，直至發(fā)育成幼魚。

1.2 免疫組化分析

采集10 dah幼魚（全魚）和120 dah的卵巢組織固定在波恩式液中用于制備組織學(xué)切片。室溫靜置過夜。脫水透明后，石蠟包埋切片，片厚7 μm。石蠟切片脫蠟，復(fù)水處理后，用一級抗體和二級抗體孵育，蘇木精染色，梯度酒精脫水后，中性樹膠封片。顯微鏡觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)是否完整，是否具有陽性信號，并用顯微鏡采集分析系統(tǒng)鏡鑒，拍照保存以待分析。以正常家兔血清為陰性對照。

2 結(jié)果

通過免疫組化檢測β-catenin在淇河鯽在不同組織細(xì)胞中的免疫定位，結(jié)果顯示β-catenin在腸杯狀細(xì)胞和腎小管的上皮細(xì)胞中呈陽性信號（圖1A、B）。如圖1C所示，在鰓組織中，鰓小片的泌氯細(xì)胞中檢測到β-catenin陽性表達(dá)。在軟骨的軟骨基質(zhì)和軟骨膜中也發(fā)現(xiàn)β-catenin的陽性信號(圖1C）。在肝臟中，βcatenin在肝細(xì)胞中表達(dá)，在肝血竇中沒有發(fā)現(xiàn)βcatenin的陽性信號（圖1D）。在脾臟中，β-catenin在紅髓的巨噬細(xì)胞中有表達(dá)，而在白髓中無表達(dá)（圖1E）。β-catenin在眼內(nèi)表達(dá)的區(qū)域?yàn)槿暰W(wǎng)膜、色素層和晶狀體，而在叢狀層未檢測到陽性信號（圖1F）。

圖1 淇河鯽腸（A）、腎（B）、鰓、軟骨（C）、肝（D）、脾（E）、和眼（F）組織細(xì)胞中β-catenin的免疫定位

在卵巢中，β-catenin在Ⅰ期和Ⅱ期卵母細(xì)胞中表達(dá)，在Ⅲ期卵母細(xì)胞中不表達(dá)（圖2A）。在腦中，βcatenin在淇河鯽中腦和間腦的支持細(xì)胞中表達(dá) （圖2C、D、E、F）。

圖2 淇河鯽卵巢（A）和腦（C、D、E、F）組織細(xì)胞中β-catenin的免疫定位

3 討論

β-catenin是典型Wnt信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在動物胚胎發(fā)育和器官發(fā)生中起著重要作用。為了研究β-catenin在淇河鯽體內(nèi)各組織中的表達(dá)情況，本研究采用免疫組織化學(xué)的方法，對淇河鯽各組織中的β-catenin進(jìn)行免疫定位檢測。結(jié)果顯示β-catenin在淇河鯽多個(gè)組織都表達(dá)。

在淇河鯽的腦組織，β-catenin在中腦中部和間腦邊緣有表達(dá)，而在羅非魚中，β-catenin在中腦邊緣和間腦中部表達(dá)[11]。在成年小鼠中β-catenin主要分布于皮層、海馬、室下層、丘腦及紋狀體等區(qū)域[12]。這表明β-catenin可能參與脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，其在不同物種的腦組織中的免疫定位的差異可能是由于不同的發(fā)育時(shí)期導(dǎo)致的，也不排除β-catenin在不同脊椎動物中可能具體功能存在某些差異這種可能性。報(bào)道顯示，β-catenin在小鼠骨細(xì)胞的間質(zhì)前體細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞存活必不可少[13,14]，表明β-catenin參與了小鼠的骨骼發(fā)育，在本研究中βcatenin在軟骨的軟骨基質(zhì)和軟骨膜中的表達(dá)暗示其可能在淇河鯽的軟骨組織發(fā)育中可能有某種作用。已有研究結(jié)果表明，在小鼠中，β-catenin在眼部晶狀體纖維分化過程中起著獨(dú)特的作用，參與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和黏附相關(guān)機(jī)制，調(diào)節(jié)晶狀體上皮和早期纖維分化[10]。本研究中，β-catenin在淇河鯽眼中也有相似的表達(dá)模式，表明β-catenin在淇河鯽眼組織發(fā)育過程中可能起著相似的作用。

在120dah淇河鯽的卵巢中，β-catenin在Ⅰ期和Ⅱ期卵母細(xì)胞中表達(dá)，在Ⅲ期卵母細(xì)胞中不表達(dá)。βcatenin只在卵巢早期生殖細(xì)胞中表達(dá)的現(xiàn)象說明βcatenin可能參與早期生殖細(xì)胞的增殖和分化等過程。

β-catenin在不同物種各組織中的泛表達(dá)表明這種表達(dá)模式是脊椎動物的普遍現(xiàn)象，β-catenin在各組織發(fā)育中的起著非常重要的作用，其功能可能相似。綜上，通過對β-catenin在淇河鯽各組織細(xì)胞中的免疫定位研究，可以為以后研究Wnt/β-catenin信號通路在各器官發(fā)生中的功能研究提供參考。