李邐 賈婉萍 崔高笛 李萌 楊昭霞

口腔黏膜下纖維性變(oral submucosal fibrosis carcinogenesis,OSF)是一種慢性、隱匿性、進行性且具有癌變傾向的黏膜炎新疾病,其主要病理表現(xiàn)為口腔黏膜下固有膠原異常堆積,其病因主要為嚼檳榔,可能與細胞自噬水平異常、免疫失調(diào)、膠原代謝紊亂等有關(guān)[1]。報道顯示,該病癌變率高達7%～13%,且OSF與口腔癌共存是因OSF癌變所致,目前臨床上關(guān)于OSF癌變的發(fā)病機制不明確[2]。lncRNA H19是首個被發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的lncRNA,其表達于胚胎組織,未表達于成年組織,可在組織再生與腫瘤發(fā)生時被激活,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[3]。人β-防御素-3(hBD-3)為先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在修復(fù)損傷,調(diào)節(jié)局部免疫與腫瘤的形成中發(fā)揮重要的作用[4]。Survivin為凋亡抑制因子,參與多種生物學(xué)功能調(diào)節(jié),主要表達于胚胎與腫瘤組織,可能成為腫瘤早期診斷的靶點[5]。目前臨床上對lncRNA H19、hBD-3、Survivin與OSF癌變的相關(guān)性研究較少,為此,在本文研究中分析lncRNA H19、hBD-3、Survivin在OSF癌變中的表達,并分析三者與OSF癌變的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年2月至2021年10月在我院接受治療的OSF患者80例作為OSF組,另外選取OSF癌變的患者90例作為OSF癌變組,同期選取在我院進行口腔健康檢查的70例健康人作為對照組。OSF組中,男49例,女41例;年齡18～67歲,平均年齡(40.38±6.68)歲。OSF癌變組中,男42例,女48例;年齡19～68歲,平均年齡(41.33±6.51)歲;其中舌癌21例,頰癌19例,牙齦癌24例,口底癌26例。對照組中,男45例,女45例;年齡16～65歲,平均年齡(40.61±6.91)歲。3組患者性別和年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組患者本次研究所有研究對象及家屬均知情同意,且簽署了知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①所有患者未接受放療、化療;②患者無其他系統(tǒng)性疾病;③患者全身無其他腫瘤,健康人無口腔黏膜疾病,無檳榔、煙、酒等嗜好。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):①患者患有合并扁平苔蘚、白斑等其他合并性疾病;②患者精神異常;③患有其他腫瘤。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測lncRNA H19、hBD-3、Survivin表達:切取所有研究對象頰黏膜上皮組織,放入液氮中冷凍,-80℃保存,采用免疫組化檢測頰黏膜上皮組織中l(wèi)ncRNA H19、hBD-3、Survivin表達情況,使用PBS沖洗采集到的組織,放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內(nèi)固定12 h,經(jīng)脫水、透明、包埋處理后制作5～7 μm組織切片,于50℃水中展開,用干凈的載玻片撈片,放入68℃恒溫箱內(nèi)烘烤2 h,在二甲苯中脫蠟浸泡25 min,之后浸在梯度乙醇各2 min,再用PBS沖洗2～3次/5 min。用80%甲醇孵育10 min,重復(fù)上方?jīng)_洗步驟。之后放入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中煮沸,自然冷卻>20 min,并重復(fù)上方?jīng)_洗步驟。加入山羊血清封閉液,室溫孵育20 min,甩去多余液體。滴加一抗50 μl,室溫靜置1 h,取出后37℃復(fù)溫45 min,并重復(fù)上方?jīng)_洗步驟。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗40～50 μl,室溫靜置1 h,并重復(fù)上方?jīng)_洗步驟后滴加SP,室溫孵育30 min,之后重復(fù)上方?jīng)_洗步驟。加入DAB顯色5～10 min,顯微鏡下掌握染色程度,用自來水沖洗10 min終止反應(yīng)。加入蘇木素給予復(fù)染,在經(jīng)過鹽酸酒精分化后,采用自來水沖洗10～15 min,通過梯度乙醇脫水后給予二甲苯?jīng)_洗片2～3次一直到透明,然后實施中性樹脂封片處理,顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。根據(jù)染色程度和染色細胞百分比進行評估:陽性細胞數(shù)<10%為(-),10%～25%為(+),25%～75%為(++),>75%為(+++)。

1.3.2 實時熒光定量法檢測lncRNA H19、hBD-3、Survivin表達:實時熒光定量RT-PCR檢測頰黏膜上皮中l(wèi)ncRNA H19、hBD-3、Survivin表達水平,Trizol法提取樣本RNA,使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得總cDNA,采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物序列,反應(yīng)體系:0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green,加蒸餾水至20 μl。反應(yīng)條件:95℃10 min,1個循環(huán),95℃ 5 s、60℃ 1 min,40個循環(huán),使用2-ΔΔCt方法計算出lncRNA H19、hBD-3、Survivin表達量。重復(fù)測量3次,取平均值,lncRNA H19上游引物序列:5’-CCGTCTCCACAACTCCAACCAG-3’,下游引物序列:5’-TCAAAGCCTCCACGACTCTGTTT-3’;hBD-3上游引物序列:5’-TTCTGTTTGCTTT-GCTCTTCCTG-3’,下游引物序列:5’-ACTTGCCGATCTGTTCCTCCTT-3’;Survivin上游引物序列:5’-AGAACTGGCCCTTCTTGGA-3’,下游引物序列:5’-AAGGAAAGCGCAACCGGACG-3’;內(nèi)參U6引物序列:上游:5’-TTCCAGCCTTCCTTCCTGGGG-3’,下游:5’-GCTCAGGAGGAGCAAT-3’。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA H19、hBD-3、Survivin在對照組、OSF組、OSF癌變組中的表達 與對照組比較,OSF組、OSF癌變組中l(wèi)ncRNA H19、hBD-3、Survivin表達量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與OSF組比較,OSF癌變組中l(wèi)ncRNA H19、hBD-3、Survivin表達量升高(P<0.05)。見表1,圖1。

圖1 lncRNA H19、hBD-3、Survivin在對照組、OSF組、OSF癌變組中的表達(免疫組化×400)

表1 lncRNA H19、hBD-3、Survivin在對照組、OSF組、OSF癌變組中的表達

2.2 lncRNA H19、hBD-3、Survivin表達與子OSF癌變患者疾病演進的關(guān)系 lncRNA H19、hBD-3、Survivin表達與OSF癌變患者腫塊大小與癌變部位無關(guān),與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度表達相關(guān),Ⅲ期、Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、≥1/2肌層浸潤OSF癌變患者lncRNA H19、hBD-3、Survivin表達升高(P<0.05)。見表2。

表2 lncRNA H19、hBD-3、Survivin表達與子OSF癌變患者疾病演進的關(guān)系

2.3 ROC曲線分析lncRNA H19、hBD-3、Survivin對OSF癌變的診斷價值 ROC曲線顯示,與lncRNA H19、hBD-3、Survivin單項診斷相比,三項聯(lián)合對OSF癌變的預(yù)測價值較高(P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 lncRNA H19、hBD-3、Survivin診斷OSF癌變的ROC曲線

表3 ROC曲線分析lncRNA H19、hBD-3、Survivin對OSF癌變的診斷價值

2.4 lncRNA H19、hBD-3、Survivin之間相關(guān)性分析 lncRNA H19、hBD-3、Survivin之間Pearson相關(guān)性分析顯示,lncRNA H19與hBD-3呈正相關(guān)(r=0.513,P=0.001);lncRNA H19與Survivin呈正相關(guān)(r=0.563,P=0.001);hBD-3與Survivin呈正相關(guān)(r=575,P=0.001)。見圖3。

圖3 lncRNA H19、hBD-3、Survivin與OSF癌變之間相關(guān)性分析

3 討論

OSF是一種口腔黏膜發(fā)生進行性硬化的疾病,主要表現(xiàn)為口腔黏膜刺激性疼痛,張口受限,進食困難,嚴(yán)重可導(dǎo)致舌功能障礙與聽力下降[6]。嚼檳榔為臨床上OSF的主要致病因素,目前OSF癌變的機制可能與檳榔的致癌成分,細胞因子的改變與細胞免疫的密切相關(guān)[7,8]。

lncRNA H19是最早發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA,位于染色體UP15.5區(qū)。研究表明,H19在多種腫瘤中異常表達,可影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,細胞的增殖分化與血管的形成促進腫瘤的發(fā)展,lncRNA H19在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,在部分腫瘤中起致癌基因作用,而在部分腫瘤中起抑癌基因作用,其具體生物學(xué)功能取決于癌癥的組織學(xué)類型與細胞微環(huán)境[9-11]。臨床上關(guān)于lncRNA H19與OSF癌變的報道較少,僅有蘇花等[12]研究顯示,H19的表達在不同病理狀態(tài)下逐漸升高。本文研究結(jié)果顯示,lncRNA H19在口腔健康患者體內(nèi)低表達,隨著OSF及OSF癌變lncRNA H19的表達逐漸升高,表明lncRNA H19和OSF的發(fā)生與癌變具有一定的聯(lián)系,其lncRNA H19可成為OSF發(fā)生發(fā)展的標(biāo)記物,證實lncRNA H19參與OSF的發(fā)生與癌變,為臨床上OSF潛在的標(biāo)記物,以上述蘇花等[12]研究保持一致。

hBD-3是人先天免疫屏障的重要組成部分,在正常狀態(tài)下呈低表達,機體發(fā)生炎癥或感染時,其表達水平明顯升高[13]。臨床研究顯示,hBD-3在多種腫瘤組織中高表達,例如陰部惡性腫瘤,宮頸癌,hBD-3高表達可影響腫瘤細胞的增殖、凋亡與侵襲遷移等過程,可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14-16]。楊琴等[17]研究顯示,OSF為癌前狀態(tài),可發(fā)展為空腔鱗狀細胞癌,長期嚼檳榔可損傷口腔黏膜,使上皮屏障受損,使機體分泌炎性細胞導(dǎo)致hBD-3表達上調(diào)。在本文研究中,OSF組織與OSF癌變組織hBD-3表達水平逐漸升高,表明hBD-3的升高與OSF癌變有關(guān),與上述研究結(jié)果保持一致,其原因可能為口腔黏膜受損導(dǎo)致黏膜下炎性滲出,機體hBD-3表達升高,hBD-3高表達可激活腫瘤相關(guān)通路,導(dǎo)致OSF癌變。

Survivin是IAP家族中成員,其表達具有依賴性,且具有多種生物學(xué)功能,可調(diào)節(jié)線粒體水平,抑制內(nèi)源細胞通路,抗凋亡。研究顯示,Survivin表達于惡性腫瘤,與惡性演進的病理特征顯著相關(guān),是腫瘤潛在的診斷指標(biāo)與抗腫瘤分子干預(yù)靶,Survivin在不同組織中表達表達不同,在惡性腫瘤與胚胎組織中高表達,在良性腫瘤中不表達[18-20]。牛媛瑕等[21]研究顯示,Survivin陽性表達率與淋巴結(jié)的產(chǎn)生,臨床分期與浸潤深度有關(guān),且Survivin參與細胞的有絲分裂與增殖,促進腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移與血管內(nèi)生成。本文研究表明,在健康人中Survivin不表達,在OSF患者體內(nèi)低表達,在OSF癌變患者體內(nèi)高表達,且隨著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移逐漸升高,與上述牛媛瑕等[21]究保持一致,表明OSF癌變與Survivin具有一定關(guān)系,可能參與OSF癌變的演進。

另外本文采用分析lncRNA H19、hBD-3、Survivin是否與OSF癌變相關(guān),Logistic回歸分析顯示,lncRNA H19、hBD-3、Survivin為OSF癌變的危險因素,且ROC曲線顯示,三項聯(lián)合預(yù)測OSF癌變的價值明顯高于單項預(yù)測,提示著,臨床上可根據(jù)上述指標(biāo)表達情況早期評估此病。雖然本文發(fā)現(xiàn)三者與OSF癌變相關(guān),參與疾病演進,但并未深入分析其作用機制,因此還需后續(xù)研究進一步明確其參與演進的具體作用機制,為臨床上此病的研究提供新方向。

綜上所述,本文研究發(fā)現(xiàn),OSF癌變組織中l(wèi)ncRNA H19、hBD-3、Survivin表達升高,隨著疾病的演進,lncRNA H19、hBD-3、Survivin表達升高加劇,參與疾病的演進,臨床上可根據(jù)其表達預(yù)測此病。