祁媛媛,崔 林,張 莉,姜 瑤,紀(jì)莉莉,邱媛媛,閆春曉,張立軍

0 引言

抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)藥物被廣泛應(yīng)用于治療眼底各類血管性疾病,如新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性[1](neovascular age-related macular degeneration,nARMD)、糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)[2]、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion,RVO)引起的黃斑水腫[3]。因其在臨床中需反復(fù)眼內(nèi)注射才能穩(wěn)定視功能的改善,因此,反復(fù)玻璃體腔注射引起的眼部及全身并發(fā)癥已得到普遍關(guān)注[4-5]。研究證實(shí),貝伐單抗注射1d可在前房和角膜基層出現(xiàn)免疫標(biāo)記[6],說明其可以被動(dòng)擴(kuò)散到角膜基質(zhì),可能影響角膜神經(jīng)。本研究利用角膜共聚焦顯微鏡對反復(fù)玻璃體腔注射雷珠單抗或阿柏西普治療的眼底血管性疾病患者的角膜神經(jīng)纖維長度和密度進(jìn)行測量分析和比較,以評價(jià)反復(fù)玻璃體腔注射抗VEGF藥物對角膜的安全性。

1 對象和方法

1.1 對象前瞻性研究。選取2021-06/2022-06在我院進(jìn)行玻璃體腔注射抗VEGF藥物治療的患者64例64眼,其中男33例,女31例;平均年齡59.7±8.065歲;DME患者20例20眼,nARMD患者19例19眼,RVO患者25例25眼;接受玻璃體腔注射阿柏西普治療者29例29眼(阿柏西普組),接受玻璃體腔注射雷珠單抗治療者35例35眼(雷珠單抗組);經(jīng)過連續(xù)3次玻璃體腔注射治療的患者54例54眼,經(jīng)過4次連續(xù)玻璃體腔注射治療的患者10例10眼。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床確診為nARMD、DME、RVO,并因黃斑水腫需要進(jìn)行抗VEGF治療;(2)既往未接受任何眼內(nèi)注射治療;(3)無角膜接觸鏡配戴史;(4)無角膜屈光手術(shù)或內(nèi)眼手術(shù)史;(5)玻璃體腔注射前3mo內(nèi)無眼部激光治療史。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并角膜疾病、眼表疾病;(2)合并其他視網(wǎng)膜或視神經(jīng)疾病;(3)患有免疫系統(tǒng)疾病。本研究符合《赫爾辛基宣言》,并獲得醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):2022-001-001),所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法玻璃體腔注射方法:充分清洗結(jié)膜囊后使用鹽酸丙美卡因連續(xù)點(diǎn)眼3次,每次間隔5min,常規(guī)消毒、鋪巾,使用聚維酮碘浸泡結(jié)膜囊,30G針頭于角膜緣后3.5～4.0mm將雷珠單抗(0.5mg/0.05mL)/阿柏西普(2mg/0.05mL)注射至玻璃體腔。術(shù)后使用左氧氟沙星滴眼液,每日4次,連續(xù)使用7d。納入患者均采取3+PRN治療方案,3針起始注射后隨訪過程中,若視力下降大于5個(gè)字母或中心視網(wǎng)膜厚度增加大于100μm或再次出現(xiàn)視網(wǎng)膜內(nèi)液、視網(wǎng)膜下液或黃斑新鮮出血,需再次行玻璃體腔注射。

1.2.2 觀察指標(biāo)注藥前和每次玻璃體腔注藥后1mo時(shí)行最佳矯正視力(BCVA)、眼壓(IOP)、裂隙燈、眼底鏡、光學(xué)相干斷層掃描(SD-OCT)等檢查,評估治療效果并擬定下一步治療方案,同時(shí)行角膜共聚焦顯微鏡檢查測量角膜神經(jīng)纖維長度(cornea nerve fiber length,CNFL)和角膜神經(jīng)纖維密度(cornea nerve fiber density,CNFD)。本研究使用的HRTⅢ共聚焦顯微鏡采用波長670nm的紅色激光,通過高數(shù)值孔徑物鏡聯(lián)合反射顯微鏡和熒光顯微鏡的反射激光束及固有光束進(jìn)行觀察,平均放大約800倍,拍攝范圍400μm×400μm(384像素×384像素),對整個(gè)角膜的不同位置進(jìn)行拍攝,最終選擇角膜上皮下中央?yún)^(qū)6mm范圍內(nèi)上皮基底膜下神經(jīng)叢(subbasal nerve plexus,SBNP)的圖像,采用Image J圖像處理軟件分析。每次檢查均由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的檢查人員操作,選取中央?yún)^(qū)SBNP圖像質(zhì)量最清晰的3張圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,取平均值。角膜神經(jīng)纖維長度指每平方毫米內(nèi)神經(jīng)纖維的總長度;角膜神經(jīng)纖維密度指每平方毫米范圍內(nèi)神經(jīng)纖維的數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較根據(jù)玻璃體腔注射藥物不同將納入患者分為兩組,阿柏西普組患者29例29眼,其中男17例,女12例,年齡61.03±1.025歲,包括nARMD患者11例11眼,DME患者11例11眼,RVO患者7例7眼;雷珠單抗組患者35例35眼,其中男16例,女19例,年齡58.60±1.627歲,包括nARMD患者8例8眼,DME患者9例9眼,RVO患者18例18眼。兩組患者性別構(gòu)成、年齡、疾病類型等基線資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。納入患者均隨訪3～6mo,期間未發(fā)生系統(tǒng)性或眼部不良事件。

2.2 兩組患者治療前后角膜神經(jīng)的變化注藥前后,阿柏西普組患者術(shù)眼角膜神經(jīng)纖維密度無顯著變化(P>0.05),但第2、3次注藥后角膜神經(jīng)纖維長度均低于注藥前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);注藥前后,雷珠單抗組患者術(shù)眼角膜神經(jīng)纖維密度和長度均無顯著變化(P>0.05)。注藥前、第3次注藥后,兩組患者術(shù)眼角膜神經(jīng)纖維密度和長度組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(注藥前:t=0.986、1.222,P=0.328、0.226;第3次注藥后:t=0.010、-0.728,P=0.992、0.470),見表1。

表1 兩組患者注藥前后角膜神經(jīng)的變化

2.3 不同疾病患者治療前后角膜神經(jīng)的變化注藥前,不同疾病類型患者術(shù)眼角膜神經(jīng)纖維密度和長度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);第3次注藥后,不同疾病類型患者術(shù)眼角膜神經(jīng)纖維密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但DME患者術(shù)眼角膜神經(jīng)纖維長度明顯低于nARMD和RVO患者(P<0.05),且nARMD和RVO患者術(shù)眼角膜神經(jīng)纖維長度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 不同疾病患者注藥前后角膜神經(jīng)的變化

3 討論

角膜是人體中神經(jīng)分布最密集的組織,其透明和無血管的生理特性確保了清晰的視力。角膜主要由三叉神經(jīng)的眼支支配,其在角膜基質(zhì)中形成上皮下神經(jīng)叢,其上升分支穿過前彈力層并廣泛終止于表面上皮層內(nèi)[7-8]。角膜神經(jīng)通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子維持完整和健康的眼表結(jié)構(gòu)和功能,發(fā)揮重要的神經(jīng)營養(yǎng)作用,是維持眼表穩(wěn)態(tài)、角膜敏感性、上皮健康和傷口愈合的主要決定因素[9]。角膜神經(jīng)支配損傷或喪失會(huì)導(dǎo)致角膜神經(jīng)纖維密度降低、角膜敏感性減弱、干眼、傷口愈合延遲,隨后發(fā)展為角膜潰瘍、穿孔,甚至失明[10]。

雷珠單抗(Ranibizumab)是一種人源化單克隆抗體片段,可中和所有已知活性形式的VEGF-A。阿柏西普(Aflibercept)是人VEGF受體1和受體2胞外區(qū)結(jié)合域與人免疫球蛋白Fc段重組形成的融合蛋白,可與VEGF-A的所有亞型、VEGF-B及PIGF結(jié)合,抑制其與VEGF受體的結(jié)合和激活。這兩種藥物現(xiàn)已廣泛通過玻璃體腔注射治療眼底血管性疾病[11-13]。然而,VEGF的作用并不局限于誘導(dǎo)血管生成和增加血管通透性。研究顯示,VEGF通過介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)活性的神經(jīng)元表達(dá)[14-16],并且VEGF對小鼠角膜周圍三叉神經(jīng)叢的生長有顯著影響,提示VEGF信號(hào)通路的阻斷會(huì)損害損傷后SBNP再生[17]。因此,反復(fù)玻璃體腔注射抗VEGF藥物可能會(huì)對角膜SBNP產(chǎn)生不利影響。Dong等[18]對正常鼠結(jié)膜下注射貝伐單抗進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),貝伐單抗會(huì)明顯引起角膜神經(jīng)衰退、感覺變遲鈍、上皮修復(fù)延遲、影響角膜神經(jīng)再生。Polat等[19]使用共聚焦顯微鏡觀察多次玻璃體腔注射抗VEGF藥物對角膜神經(jīng)纖維和角膜敏感度的影響,發(fā)現(xiàn)多次玻璃體腔注射抗VEGF藥物對角膜SBNP有影響,也會(huì)使角膜敏感度降低。但也有研究發(fā)現(xiàn),雷珠單抗對nARMD患者的角膜敏感性和SBNP無明顯影響[20]。

角膜共聚焦顯微鏡是一種詳細(xì)研究角膜神經(jīng)精細(xì)結(jié)構(gòu)的重要方法,其以無創(chuàng)的方式實(shí)現(xiàn)角膜神經(jīng)纖維的實(shí)時(shí)可視化,允許在患者和動(dòng)物模型中進(jìn)行長期縱向研究[21],獲得的角膜圖像可以通過適當(dāng)?shù)能浖M(jìn)行分析,以識(shí)別定量指標(biāo)。本研究通過角膜共聚焦顯微鏡獲得SBNP圖像,并通過Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以評價(jià)雷珠單抗及阿柏西普反復(fù)多次玻璃體腔注射對人角膜神經(jīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),阿柏西普第2、3次注射后角膜神經(jīng)纖維長度均低于注藥前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而雷珠單抗多次玻璃體腔注射后角膜神經(jīng)纖維密度和長度在各時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所以反復(fù)玻璃體腔注射抗VEGF藥物會(huì)一定程度減少角膜神經(jīng)纖維長度,注射阿柏西普相比雷珠單抗對角膜神經(jīng)纖維長度的影響可能更大。眼內(nèi)注射2mg阿柏西普的摩爾濃度為348nmol/mL,眼內(nèi)注射0.5mg雷珠單抗的摩爾濃度為208nmol/mL,也就是說,同樣注射0.05mL的阿柏西普比雷珠單抗摩爾濃度更高,同時(shí)阿柏西普的玻璃體內(nèi)活性比雷珠單抗更長[22],所以推測阿柏西普因?yàn)槟枬舛雀咔一钚愿L,使其潛在的有利和不利影響均更強(qiáng)。

本研究比較了三種不同疾病患者的角膜神經(jīng)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),基線時(shí)DME患者術(shù)眼角膜神經(jīng)纖維密度和長度均低于nARMD和RVO患者,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第3次玻璃體腔注射后,DME患者術(shù)眼角膜神經(jīng)纖維長度均低于nARMD和RVO患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而nARMD和RVO患者第3次玻璃體腔注射后術(shù)眼神經(jīng)纖維長度和密度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)報(bào)道,糖尿病患者相比其他疾病患者更易表現(xiàn)出角膜神經(jīng)纖維的漸進(jìn)性喪失和角膜敏感性下降[23]。因此多次注射抗VEGF藥物更容易引起糖尿病患者角膜神經(jīng)改變。既往研究報(bào)道,在糖尿病伴/不伴糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展4a的患者中,角膜神經(jīng)纖維長度相對于神經(jīng)纖維密度更為敏感[24]。故本研究中多次玻璃體腔注射抗VEGF藥物后,對糖尿病患者的角膜神經(jīng)纖維長度有一定影響,而對角膜神經(jīng)密度無明顯影響。

本研究顯示,反復(fù)玻璃體腔注射抗VEGF藥物會(huì)一定程度影響角膜神經(jīng),對于臨床上需多次玻璃體腔注射抗VEGF藥物治療的眼底疾病患者,需關(guān)注角膜神經(jīng)的變化,尤其是糖尿病患者,多次玻璃體腔注射后不僅會(huì)對角膜神經(jīng)產(chǎn)生一定影響,也會(huì)降低角膜敏感性,從而增加潛在的感染機(jī)會(huì)。治療后應(yīng)囑患者注意避免用力揉眼,加強(qiáng)局部抗炎,同時(shí)給予人工淚液保護(hù)眼表微環(huán)境。雷珠單抗與阿柏西普的作用靶點(diǎn)不完全相同,目前關(guān)于兩種藥物因靶點(diǎn)不同對角膜神經(jīng)產(chǎn)生影響的報(bào)道較少,我們會(huì)進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本研究結(jié)果,并探討其作用機(jī)制。此外,本研究隨訪時(shí)間較短,后續(xù)仍需要擴(kuò)大樣本量,同時(shí)延長隨訪時(shí)間進(jìn)一步觀察研究結(jié)論的準(zhǔn)確性。