王宏偉，袁善奎，侯玉霞，宋偉華

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100125；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100193)

搖蚊是一類重要的水生昆蟲，目前發(fā)現(xiàn)的種類超過5 000種，其在水生生態(tài)環(huán)境中的重要作用已被大量研究證實(shí)[1-2]。搖蚊幼蟲又稱紅蟲，是種類最多，分布最廣，密度和生物量最大的淡水底棲動物類群，其生物量約占底棲生物量的70%～80%[3]。搖蚊幼蟲是水生食物鏈中重要的營養(yǎng)層級，是魚類和水鳥的重要食物來源，也是污染物在營養(yǎng)層級間傳遞的重要媒介[4]。由于搖蚊具有對污染物敏感、生命周期短、易于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)等諸多優(yōu)勢，使其成為水環(huán)境監(jiān)測的優(yōu)良指示生物[5]。

速滅威是我國使用較多的氨基甲酸酯類殺蟲劑之一，具有觸殺、熏蒸作用和一定的內(nèi)吸活性，主要用于防治水稻上的飛虱、葉蟬[6]。速滅威微溶于水，如果施用不當(dāng)或者施藥后管理不善，極易導(dǎo)致周邊水體污染，從而對水生生態(tài)系統(tǒng)造成影響。目前，有關(guān)速滅威的研究主要圍繞檢測方法、生物活性、殘留和降解特性等方面，但在速滅威對水生生物毒理效應(yīng)方面的研究報道甚少[7]。本文以我國南方地區(qū)優(yōu)勢物種花翅搖蚊為受試生物[8]，研究速滅威對底棲生物搖蚊幼蟲的急慢性毒性，旨在為系統(tǒng)評價速滅威的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx 花翅搖蚊(Chironomuskiiensis)引種于北京市疾病預(yù)防與控制中心，用曝氣除氯3 d以上的自來水(pH 8.24，溶解氧8.16 mg/L，總硬度290 mg/L)飼養(yǎng)于玻璃缸中，水溫(24±1)℃，每7 d換1次水，每2 d投喂0.5～1 g熱帶魚飼料，自然光照，并用氧氣泵供氧，使用50目紗布罩住玻璃缸防止搖蚊成蟲逃逸。

1.1.2 供試農(nóng)藥 93%速滅威原藥。

1.1.3 沉積物 依據(jù)《化學(xué)品 沉積物-水系統(tǒng)中搖蚊毒性試驗(yàn)加標(biāo)于水法》[9](GB/T 27858-2011)中附錄B配制均勻的沉積物，其中石英砂干重占比75%，高嶺石粘土(高嶺石含量≥30%)干重占比20%，泥炭(顆粒尺寸≤1 mm)干重占比5%。

1.2 急性毒性試驗(yàn) 參照OECD方法測定速滅威對搖蚊幼蟲的急性毒性[10]。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置1齡幼蟲組和4齡幼蟲組，分別將速滅威用曝氣水配成2.50、3.00、3.60、4.32、5.18 mg/L和5.00、6.50、8.45、10.99、14.28 mg/L 2個系列濃度梯度，以曝氣水為空白對照，分別選取生理活動能力正常且一致的1齡期和4齡期搖蚊幼蟲置于盛有75 mL藥液的小燒杯中，每個處理5頭幼蟲，4個重復(fù)。試驗(yàn)期間不投喂食物，溫度(24±1)℃，光暗時間比=16 h∶8 h，于試驗(yàn)開始后的24和48 h統(tǒng)計(jì)搖蚊幼蟲生存狀況，輕晃燒杯，幼蟲在15 s內(nèi)無法改變姿勢(爬行或者“8”字?jǐn)[動)視為活動抑制。

1.3 慢性毒性試驗(yàn)

1.3.1 加標(biāo)于上覆水法 參照《化學(xué)品 沉積物-水系統(tǒng)中搖蚊毒性試驗(yàn)加標(biāo)于水法》(GB/T 27858-2011)[9]的方法，在每個試驗(yàn)容器中加入250 g沉積物(濕重)和700 mL蒸餾水配制成水-沉積物系統(tǒng)，調(diào)節(jié)pH至7.4。待水-沉積物系統(tǒng)沉降完全后，選取1齡搖蚊幼蟲(搖蚊卵孵化后3 d，體長約0.2 cm)加入試驗(yàn)容器中，每個處理20頭，4個重復(fù)。加入搖蚊幼蟲后，關(guān)停曝氣泵24 h，待幼蟲全部沉入容器底部沉積物后繼續(xù)曝氣。加入搖蚊幼蟲48 h后，使用吸管取出相應(yīng)體積的上覆水，并輕微加入新配制的相應(yīng)濃度藥液。試驗(yàn)期間，控制環(huán)境中溫度為(24±1)℃，濕度≥60%，光暗時間比16 h∶8 h。每2 d喂食1次，每只幼蟲每次的飼喂量為0.5 mg，3齡期后可適當(dāng)增加喂食量。

1.3.2 加標(biāo)于沉積物法 參照《化學(xué)品 沉積物-水系統(tǒng)中搖蚊毒性試驗(yàn)加標(biāo)于沉積物法》(GB/T 27859-2011)[11]的方法，將速滅威溶于少量丙酮中制備成儲備液，吸取相應(yīng)量的儲備液加入10 g石英砂混勻，待丙酮從石英砂中揮發(fā)后，再與190 g沉積物(干重)混勻，并加入700 mL蒸餾水配制成水-沉積物系統(tǒng)。搖蚊的引入和試驗(yàn)條件的控制同1.3.1。

1.3.3 結(jié)果調(diào)查 搖蚊染毒時記為第0 d，隨后每24 h觀察1次，記錄搖蚊的羽化個數(shù)和性別，在連續(xù)7 d未觀察到新的搖蚊羽化時為試驗(yàn)終點(diǎn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS22.0中概率回歸法求得速滅威對搖蚊幼蟲急性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)的毒力回歸方程y=a+bx，計(jì)算半數(shù)效應(yīng)濃度EC50，決定系數(shù)R2及95%置信區(qū)間；利用SPSS22.0對慢性毒性試驗(yàn)組間各指標(biāo)進(jìn)行單因素分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示，采用Bonferroni方法分析組間顯著性差異(P<0.05)；運(yùn)用SigmaPlot14.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 速滅威對花翅搖蚊幼蟲的急性毒性 花翅搖蚊幼蟲在低濃度速滅威處理下，與對照組在試驗(yàn)初期相似，無明顯中毒癥狀，但在染毒12 h后開始少量出現(xiàn)中毒癥狀和死亡；高濃度處理組花翅搖蚊幼蟲在暴露2 h后就開始出現(xiàn)劇烈反應(yīng)，身軀呈“C”字型不停的翻動，并隨著暴露時間的延長，幼蟲活動逐漸減緩，體色變淡，死亡數(shù)不斷增加。

速滅威對花翅搖蚊幼蟲的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果(表1、2)。由兩表可知，試驗(yàn)48 h內(nèi)，速滅威對花翅搖蚊幼蟲的毒性作用隨著處理濃度的增加和暴露時間的延長會逐漸增強(qiáng)；四齡搖蚊幼蟲的24 h EC50、48 h EC50是一齡搖蚊幼蟲的2.5倍以上，一齡幼蟲的敏感性高于四齡幼蟲。

表1 速滅威對花翅搖蚊一齡幼蟲的急性毒性

表2 速滅威對花翅搖蚊四齡幼蟲的急性毒性

2.2 速滅威對花翅搖蚊幼蟲的慢性毒性

2.2.1 速滅威對花翅搖蚊羽化的影響 慢性毒性試驗(yàn)中搖蚊幼蟲存活個數(shù)為發(fā)生羽化的搖蚊數(shù)量與試驗(yàn)結(jié)束后沉積物中存活的幼蟲數(shù)量之和。試驗(yàn)結(jié)束后，在所有試驗(yàn)容器的沉積物中均未發(fā)現(xiàn)存活的搖蚊幼蟲，這表明存活的搖蚊幼蟲都羽化為成蚊，所以搖蚊存活率等于其羽化率。由圖1、圖2可以看出，幼蟲的羽化普遍在初次出現(xiàn)羽化2 d后出現(xiàn)高峰期，持續(xù)2 d左右。在高濃度處理組中，初次出現(xiàn)羽化時間比對照組推遲1～3 d。這表明隨著速滅威濃度的增高，搖蚊幼蟲的羽化率降低，羽化時間延后，平均發(fā)育時間延長。

圖1 速滅威對花翅搖蚊幼蟲羽化率的影響(加標(biāo)于上覆水法)

圖2 速滅威對花翅搖蚊幼蟲羽化率的影響(加標(biāo)于沉積物法)

由表3、表4可知，在加標(biāo)于上覆水法中，當(dāng)速滅威濃度高于3.72 mg/L時，試驗(yàn)組搖蚊幼蟲的羽化率和化蛹率與對照組存在顯著差異(P<0.05)。當(dāng)速滅威濃度低于3.72 mg/L時，試驗(yàn)組間搖蚊幼蟲的羽化率和化蛹率無顯著差異(P<0.05)；在加標(biāo)于沉積物法中，當(dāng)速滅威濃度高于10.00 mg/kg時，試驗(yàn)組搖蚊幼蟲的羽化率和化蛹率與對照組存在顯著差異(P<0.05)。中等濃度處理組中的羽化率要略高于化蛹率，但無顯著性差異。推測這可能是中等濃度處理組中部分搖蚊幼蟲羽化失敗造成的。根據(jù)慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的化蛹數(shù)量和羽化數(shù)量計(jì)算不同濃度處理搖蚊幼蟲化蛹率和羽化率，最終得到加標(biāo)于上覆水法中速滅威對搖蚊幼蟲的化蛹率半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)值為3.72 mg/L，對搖蚊幼蟲的羽化率半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)值為3.63 mg/L；加標(biāo)于沉積物法中速滅威對搖蚊幼蟲的化蛹率半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)值為23.71 mg/kg，對搖蚊幼蟲的羽化率半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)值為20.60 mg/kg。

表3 不同速滅威濃度處理組花翅搖蚊的存活及羽化狀況(加標(biāo)于上覆水法)

表4 不同速滅威濃度處理組花翅搖蚊的存活及羽化狀況(加標(biāo)于沉積物法)

除化蛹率和羽化率之外，本研究還對不同濃度速滅威對搖蚊羽化時間的影響進(jìn)行了記錄(表3、4)。整體來看，速滅威在一定程度上抑制了搖蚊幼蟲的羽化，使其羽化時間有了不同程度的延滯，延滯時間與速滅威濃度成正比。影響搖蚊幼蟲羽化時間的因素很多，除不同的污染物通過促進(jìn)或者抑制搖蚊幼蟲體內(nèi)的激素分泌影響搖蚊幼蟲的羽化時間之外，營養(yǎng)物質(zhì)含量、飼料、攝食習(xí)慣、生存環(huán)境[12，13，14]等外界因素的差異都可影響搖蚊幼蟲的羽化時間。因此還需要進(jìn)一步深入的研究。

在記錄羽化時間和羽化率的同時，通過觀察速滅威對羽化搖蚊性別的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組及低濃度組羽化的搖蚊個體比例接近為1∶1，而當(dāng)速滅威濃度達(dá)到2.20 mg/L或19.60 mg/kg時，速滅威對羽化搖蚊的性別比產(chǎn)生嚴(yán)重影響，但是其影響無明顯規(guī)律可循。之前也有一些關(guān)于污染物對羽化搖蚊性別影響的研究，但是結(jié)果各不相同。比如劉麗等曾研究了六氯苯乙烯對搖蚊幼蟲(Chironomuskiiensis)羽化性別比的影響，發(fā)現(xiàn)六氯苯使得羽化搖蚊雄性數(shù)量明顯減少[15]。鐘文玨等研究發(fā)現(xiàn)沉積物中五氯酚對雌性搖蚊的羽化抑制作用要顯著大于雄性搖蚊[16]。由此可見，速滅威對羽化搖蚊性別比影響的機(jī)制還需要更深入探討。

試驗(yàn)過程中觀察到，搖蚊幼蟲在蛹期即將羽化為成蚊時容易發(fā)生死亡，部分個體羽化中途時死亡。同時還發(fā)現(xiàn)，中高濃度速滅威處理組與對照組以及低濃度速滅威處理組相比，多出現(xiàn)翅膀畸形搖蚊，羽化成蚊的個體出現(xiàn)身體和翅膀疲軟，飛行無力等特征。試驗(yàn)過程中存活的搖蚊都成功羽化為成蚊，但中高濃度速滅威處理組對蛹期搖蚊致死作用更明顯。速滅威屬于速效性氨基甲酸酯類殺蟲劑，推測其可能在加標(biāo)早期對搖蚊幼蟲的身體機(jī)能造成不可逆的損傷，最終干擾其羽化。

2.2.2 速滅威對花翅搖蚊活動行為的影響 大多數(shù)搖蚊有筑巢的習(xí)性。巢是搖蚊幼蟲利用唾液腺分泌物粘附的淤泥或砂粒筑建的，多筑于沉積物表面或埋于淤泥中。搖蚊幼蟲棲居在巢中，頭部伸出取食，隨著搖蚊幼蟲體長增長，所筑的巢也會增長。比較幾個不同處理組中搖蚊幼蟲在沉積物表面的筑巢數(shù)量發(fā)現(xiàn)，沉積物中速滅威加標(biāo)濃度為10.00、14.00和19.60 mg/kg時，搖蚊幼蟲的筑巢行為較溶劑對照(圖3K)明顯增強(qiáng)(圖3)，這表明速滅威對搖蚊幼蟲的筑巢行為有促進(jìn)作用。

圖3 花翅搖蚊幼蟲在沉積物表面筑巢行為變化情況

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，速滅威對花翅搖蚊一齡幼蟲24、48 h的EC50分別為4.52、3.14 mg/L，與IUPAC數(shù)據(jù)中速滅威對魚的急性毒性結(jié)果相比，花翅搖蚊對速滅威的敏感性比魚更高。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一齡幼蟲對速滅威的敏感性遠(yuǎn)高于四齡幼蟲，因此在測定水環(huán)境中外源污染物對搖蚊幼蟲半數(shù)效應(yīng)濃度時，選用一齡搖蚊幼蟲作為受試生物更為嚴(yán)謹(jǐn)。

慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，加標(biāo)上覆水中速滅威對搖蚊幼蟲的羽化率半數(shù)效應(yīng)濃度EC50及化蛹率半數(shù)效應(yīng)濃度EC50分別為3.63和3.72 mg/L，加標(biāo)沉積物中速滅威對搖蚊幼蟲的羽化率半數(shù)效應(yīng)濃度EC50及化蛹率半數(shù)效應(yīng)濃度EC50分別為20.60和23.71 mg/kg。2種慢性毒性試驗(yàn)方法均顯示出，隨著處理組速滅威濃度的增加，搖蚊幼蟲的化蛹率、羽化率及存活率降低，羽化時間延滯。這與多數(shù)污染物影響效果一致，但也存在少數(shù)污染物促進(jìn)搖蚊的羽化，例如一些內(nèi)分泌干擾物如六氯苯[15]、三氯苯酚[12]、多殺霉素[17]等。本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)處理組速滅威濃度與羽化搖蚊雄雌比之間存在相關(guān)性，這可能是因?yàn)樗贉缤u蚊性別分化相關(guān)的激素影響較小。

本研究發(fā)現(xiàn)與多數(shù)污染物抑制搖蚊幼蟲筑巢行為不同，在速滅威處理組羽化搖蚊數(shù)量少于對照組羽化搖蚊數(shù)量時，速滅威處理組沉積物表面的筑巢數(shù)量反而多于對照組，這表明速滅威對搖蚊幼蟲的筑巢行為可能存在促進(jìn)作用。目前研究中發(fā)現(xiàn)多數(shù)污染物對搖蚊幼蟲的筑巢行為有抑制作用，Taylor等發(fā)現(xiàn)搖蚊幼蟲(Chironomusriparius)暴露于林丹后，其筑巢行為明顯受到抑制[18]。Macdonald等發(fā)現(xiàn)全氟辛烷磺酸(PFOS)對搖蚊幼蟲(Chironomustentans)筑巢行為有明顯的抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)搖蚊幼蟲多聚集在沉積物表面[19]。關(guān)于污染物對搖蚊幼蟲筑巢行為活動有促進(jìn)作用的報道甚少，具體的機(jī)理還需進(jìn)一步研究確認(rèn)。