成 昭,徐 玥,梁 飛,鄭 蕾,龔 婕,李 根

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021;2.西安萊伯瑞生物工程有限公司,陜西 西安 710116)

代謝過程中產(chǎn)生的自由基,因其結(jié)構(gòu)中存在未配對的自由電子,表現(xiàn)較高化學(xué)活性,常作為活性中間體廣泛參與生命體內(nèi)的各種氧化-還原反應(yīng)[1-2]。自由基過量時,甚至可能引發(fā)氧化-還原過程失衡,損傷人體器官。其中,自由基氧化應(yīng)激學(xué)說將機體衰老機制直指體內(nèi)自由基。自由基氧化應(yīng)激學(xué)說認(rèn)為,機體衰老時,體內(nèi)自由基含量增加,清除自由基的能力卻無法與之平衡,從而導(dǎo)致自由基在體內(nèi)過量積累,進(jìn)而攻擊細(xì)胞與結(jié)締組織,造成細(xì)胞損傷,引發(fā)組織與器官功能紊亂,致使機體衰老。

為維持生命體內(nèi)自由基的動態(tài)代謝平衡,降低過量積累的自由基可能產(chǎn)生的不良反應(yīng),機體依賴于各種抗氧化劑完成自由基清除。作為一種小分子,活性氫能夠?qū)崿F(xiàn)快速透皮、快速轉(zhuǎn)運,同時,能夠有效結(jié)合如羥基自由基等與氧化路徑相關(guān)的自由基,從而加快機體代謝速度,達(dá)到抗氧化、抗衰老的功效[3-4]。天然來源的珊瑚鈣,能夠以其微孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行氫儲存[5-7],為研究人員開發(fā)微孔釋氫的抗氧化材料提供了新思路。儲氫珊瑚鈣的研究,對于活性氫的抗氧化功效與機制分析、以及機體抗衰老均具有重要意義。

作者進(jìn)行天然珊瑚鈣的儲氫實驗,制備得到氫化珊瑚鈣,并對天然珊瑚鈣的主要成分碳酸鈣、活性釋氫物質(zhì)氫化鈣、珊瑚鈣與所制備的氫化珊瑚鈣,分別進(jìn)行光譜性能研究,對比分析氫化珊瑚鈣的特征光譜吸收,研究氫化珊瑚鈣的儲氫含量及其在不同溫度時的釋氫性能,進(jìn)一步評價基于天然來源物質(zhì)修飾得到的氫化珊瑚鈣的毒性與抗氧化性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

硫酸：質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%,碳酸鈣、氫化鈣、珊瑚鈣、鋅粒、還原型輔酶Ⅰ(二鈉)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(MTT)、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)：上海阿拉丁試劑有限公司,以上試劑均為AR;N,N-二甲基亞砜(DMSO)：GR,上海阿拉丁試劑有限公司。

紫外分光光度計：UV-1700,日本島津制作所;熱重法-差示掃描量熱法同步熱分析儀：STA200,日本日立制作所;倒置熒光顯微鏡：U-LH 100HG IX73,日本奧林巴斯株式會社;多功能酶聯(lián)檢測儀：1510 Multiskan Go,美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 氫化珊瑚鈣的制備及紫外可見光譜測定

通過Zn與稀硫酸的制氫反應(yīng),同步實現(xiàn)制氫與天然珊瑚鈣儲氫,制備得到氫化珊瑚鈣。

光譜分析：出射狹縫與入射狹縫寬度均為1 nm,掃描波段為350～600 nm,進(jìn)行碳酸鈣(天然珊瑚鈣的主要成分之一)[5]、氫化鈣(活性釋氫物質(zhì))、珊瑚鈣與所制備氫化珊瑚鈣的紫外可見光譜測定,分析氫化珊瑚鈣的特征光譜吸收與其在不同溫度時的釋氫性能。

1.3 氫化珊瑚鈣的熱失重分析

氫化珊瑚鈣取樣5 mg,在氮氣氛圍下,以20 ℃/min的速率進(jìn)行升溫,t=25～800 ℃測定所制備氫化珊瑚鈣的熱失重曲線,分析其儲氫含量與氫緩釋性能[5,8-9]。

1.4 氫化珊瑚鈣的體外細(xì)胞毒性實驗

以MTT比色法[10]進(jìn)行氫化珊瑚鈣的體外細(xì)胞毒性實驗,首先制備人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞懸液(對數(shù)生長期,密度為5×104個/mL),加入96孔板中,使每孔細(xì)胞數(shù)約8 000～10 000個,每組設(shè)置2個平行孔,將氫化珊瑚鈣溶于杜爾貝科改良培養(yǎng)基(DMEM)中,以梯度遞減的質(zhì)量濃度依次加入96孔板的各個分組中(1 000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL),溶劑對照為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% DMSO的DMEM完全培養(yǎng)基。加樣后,將孔板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h。實驗終止前,每孔加入MTT(5 mg/mL,20 μL),培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO,測定490 nm處的吸光度OD值,進(jìn)行HepG2細(xì)胞增殖抑制率計算,增殖抑制率=[(1-OD材料樣液/OD對照)]×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 氫化珊瑚鈣的紫外可見光譜

對天然珊瑚鈣的主要成分碳酸鈣、活性釋氫物質(zhì)氫化鈣、珊瑚鈣與所制備的氫化珊瑚鈣4種物質(zhì)進(jìn)行光譜性能研究見圖1。

λ/nm圖1 碳酸鈣、氫化鈣、珊瑚鈣與氫化珊瑚鈣的紫外-可見光譜

由圖1可知,經(jīng)過儲氫活化過程,氫化珊瑚鈣與珊瑚鈣的紫外可見光譜呈現(xiàn)吸收峰位置的顯著差異,氫化珊瑚鈣的特征吸收峰為427 nm,與同為活性釋氫物質(zhì)的氫化鈣具有一定的相似性,初步證明了所制備的氫化珊瑚鈣具有一定釋氫效果。

2.2 氫化珊瑚鈣在不同溫度的紫外可見光譜與自由基清除實驗

以DPPH為對照,進(jìn)行氫化珊瑚鈣的氫緩釋、自由基清除與抗氧化性能評價[11-12],測定氫化珊瑚鈣在不同溫度的紫外可見光譜見圖2。

λ/nm圖2 氫化珊瑚鈣在不同溫度時的紫外-可見光譜

由圖2可知,t=30、35、40 ℃,氫化珊瑚鈣的紫外可見光譜與對照組DPPH無明顯差別,說明該溫度范圍內(nèi)氫化珊瑚鈣對自由基無明顯清除作用,氫化珊瑚鈣的釋氫性能較弱。t=45 ℃,氫化珊瑚鈣的譜線出現(xiàn)與對照組的顯著差別,說明氫化珊瑚鈣的有效釋氫溫度約為45 ℃,此時,氫化珊瑚鈣能夠?qū)崿F(xiàn)有效釋氫,表現(xiàn)抗氧化性與自由基清除效果。

2.3 氫化珊瑚鈣的儲氫含量研究與氫緩釋性能評價

測定25～800 ℃氫化珊瑚鈣的熱失重曲線見圖3。

t/℃圖3 氫化珊瑚鈣的熱失重分析

由圖3可知,氫化珊瑚鈣的釋氫失重段處于33.75～48.93 ℃,其w(儲氫)≈0.02%。50～600 ℃再無其他失重,t>600 ℃,珊瑚鈣骨架坍塌。

2.4 氫化珊瑚鈣的細(xì)胞毒性評價

對氫化珊瑚鈣的體外細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測,評價不同ρ(氫化珊瑚鈣)對體外HepG2細(xì)胞的24 h細(xì)胞毒性見圖4。

ρ(氫化珊瑚鈣)/(μg·mL-1)圖4 ρ(氫化珊瑚鈣)對HepG2細(xì)胞的24 h細(xì)胞毒性

由圖4可知,在梯度質(zhì)量濃度下(1 000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL),所制備的氫化珊瑚鈣對體外HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用不顯著,最大質(zhì)量濃度下細(xì)胞存活率顯著高于90%,說明經(jīng)天然珊瑚鈣修飾得到的氫化珊瑚鈣具有低毒性,對體外HepG2細(xì)胞毒性較低。

3 結(jié) 論

作者進(jìn)行天然珊瑚鈣微孔結(jié)構(gòu)的儲氫實驗,制備得到氫化珊瑚鈣,進(jìn)一步進(jìn)行氫化珊瑚鈣的光譜性能分析,分析其有效釋氫溫度與儲氫含量,并考察了氫化珊瑚鈣的抗氧化性與自由基清除效果。實驗結(jié)果顯示,一方面,氫化珊瑚鈣表現(xiàn)與活性釋氫物質(zhì)氫化鈣相似的光學(xué)吸收,具有一定釋氫效果,其釋氫失重段處于33.75～48.93 ℃,w(儲氫)≈0.02%;另一方面,氫化珊瑚鈣在不同溫度的紫外可見光譜與自由基清除實驗,也驗證了其有效釋氫溫度約為45 ℃,與熱失重分析結(jié)論基本一致。此外,氫化珊瑚鈣對體外HepG2細(xì)胞表現(xiàn)低毒性,說明經(jīng)天然珊瑚鈣修飾得到的氫化珊瑚鈣是一種生物友好的微孔釋氫與抗氧化材料,對于活性氫的抗氧化功效與機制分析、機體抗衰老等相關(guān)研究具有重要意義。