蘇全琳,楊 萍,師 聲,張 靜,蘭文軍

齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物醫(yī)學工程研究所,山東 濟南 250353

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)作為消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率位列第二[1]。近二十年間,發(fā)達國家中結(jié)直腸癌的發(fā)生率已顯著減少,但在中國呈上升趨勢[2]。CRC在早期是無癥狀或癥狀不明顯的,伴有間歇性腸胃不適、消化不良、大便潛血等癥狀,易被患者忽略,導致癌癥繼續(xù)發(fā)生發(fā)展、擴散轉(zhuǎn)移[3]。CRC患者進展為較明顯的癌前病變或發(fā)展成為癌需要5到10年甚至更長的時間[4],因此根據(jù)身體狀況在這期間進行早期定期篩查尤為重要。本文對CRC早期定期篩查相關(guān)研究進展進行概述。

1 血液標志物

1.1 蛋白質(zhì)標志物

CRC腫瘤標志物(tumor marker,TM)是由腫瘤細胞分泌對其生長發(fā)育有利或患者身體受腫瘤細胞脅迫所產(chǎn)生的一類物質(zhì),可用于衡量腫瘤細胞所處的生長分期。臨床常見的TM主要有CA199、CA50、CA724、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)等。ATTALLAH 等[5]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定患者血清CEA、碳水化合物抗原19-9(CA19-9)、CK1和MUC1,用曲線下面積法(area under the curve,AUC)評估對腫瘤的診斷價值,結(jié)果顯示血清四項指標均升高,且CRC>良性疾病>健康對照組,能夠反應腫瘤的分期、淋巴結(jié)浸潤和遠處器官轉(zhuǎn)移的情況。DOU等[6]開發(fā)了用于血液II型半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CST4)檢測的抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 分析系統(tǒng),采用實時熒光定量PCR和Western blotting蛋白質(zhì)印記法分析了CST4在胃腸道腫瘤組織和細胞系中的表達情況,并純化CST4重組蛋白,制備了抗CST4單克隆抗體,建立抗體夾心的ELISA分析系統(tǒng)檢測CST4,發(fā)現(xiàn)在CRC患者中CST4-mRNA及其表達蛋白在胃腸道腫瘤組織和細胞系中的含量明顯上調(diào),ELISA檢測CST4、胃癌(GC)和CRC的靈敏度和特異性明顯優(yōu)于臨床常用的標志物CEA、CA19-9、CA72-4和CA125,表明了血液標志物CST4在早期篩查結(jié)直腸癌的臨床診斷應用價值。NING等[7]使用電化學發(fā)光法檢測癌抗原CA19-9、CEA、胸腺嘧啶激酶1(TK1)和糖類抗原72-4(CA72-4)的水平,評估聯(lián)合檢測對CRC的意義,發(fā)現(xiàn)TK1水平與腫瘤分化程度、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及年齡顯著相關(guān)。利用二維電泳,串聯(lián)質(zhì)譜及印記法對結(jié)直腸癌和晚期腺瘤性息肉的蛋白組學分析顯示[8]:HPR、HP、ALB、KRT 1、APOA 1、FGB、IGJ、C4a等蛋白在息肉組織中的表達明顯低于正常人;血漿中FGB和C4A蛋白與結(jié)直腸癌的發(fā)展呈明顯相關(guān)性,提示其可作為早期診斷結(jié)直腸癌的血漿潛在生物標志物。

綜上所述,血液抗原標志物可應用于腫瘤分期、術(shù)后檢測和預后判斷等方面,但由于早期分泌水平較低,還應進一步提升檢測的靈敏度和特異性,以增加早期篩查的準確性。

1.2 核酸標志物

血液標本核酸檢測主要以循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)腫瘤細胞(CTC)和循環(huán)游離DNA(cfDNA)中BRAF(表1)、KRAS(表2)、NRAS等特定基因的突變和部分基因的甲基化(表3)、微小RNA及微衛(wèi)星改變作為檢測目標[9]。

表1 BRAF基因常見致癌突變類型

表2 RAS基因常見突變

表3 常見的甲基化位點

利用ddPCR技術(shù)對ctDNA中的RAS和BRAF的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進行檢測,JUNCA等[10]報道,RAS和BRAF的SNP對晚期突變型CRC的敏感性高,但對進展期腺瘤(AA)不敏感。XU等[11]采用real-time PCR技術(shù),對CRC ctDNA樣本中的Septin9、Syndecan-2(SDC2)和branched-chain amino acid transaminase 1(BCAT1)基因的甲基化進行檢測,發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸息肉患者與正常對照組ctDNA甲基化水平差異顯著,預示對CRC的早篩診斷有較好的診斷價值。WANG等[12]利用基因組學分析和焦磷酸測序,進行了全基因組DNA甲基化分析,建立了一個基于CpG甲基化的CRC篩查模型,結(jié)果顯示:基于cg09239744和cg12587766兩個CpG位點的診斷模型對CRC和結(jié)直腸腺瘤患者的鑒別有意義,可用于結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺癌的早期定期篩查。ZHAO等[13]報道了以循環(huán)外泌體miRNA為結(jié)直腸癌生物標志物的研究,從165例CRC患者和153例健康人群血清中分離外泌體miR-99b-5p和miR-150-5p,用透射電鏡、免疫印跡、新型外泌體粒徑分析儀和RT-PCR進行驗證,并對循環(huán)外泌體進行基因測序,結(jié)果顯示:與健康人群和良性疾病人群相比,CRC患者的外泌體miRNA水平顯著下調(diào),結(jié)直腸癌術(shù)后又顯著升高,因此血清循環(huán)外泌體miR-99b-5p和miR-150-5p可能可以用于結(jié)直腸癌的早期篩查。CAI等[14]篩選了六種在血漿和組織中具備更好待檢測能力的標志物,建立了對CRC和進展期腺瘤的血液多基因位點甲基化檢測方法,結(jié)果表明:相比于FIT、癌胚抗原和Septin 9單位點基因甲基化檢測,這六種基因甲基化標志物聯(lián)檢具有顯著的優(yōu)勢。

與單一標志物檢測相比,多個CRC標志物聯(lián)檢的特異性和靈敏度更好,結(jié)果也更加精準。采用real-time PCR、ddPCR、基因測序等技術(shù)對血液標本中的基因突變、甲基化進行聯(lián)檢,具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點,是未來CRC早期篩查的發(fā)展趨勢。

2 糞便標志物

2.1 潛血相關(guān)標志物

糞便潛血現(xiàn)象是由于腫瘤破裂、直腸息肉破裂、消化道出血、消化道潰瘍、痢疾和痤瘡等原因?qū)е录S便中含少量血液[15]。在結(jié)直腸癌早期,約有20%的患者可能出現(xiàn)便潛血檢測陽性的現(xiàn)象,而CRC晚期病人的便潛血陽性概率可達到90%以上[16],所以糞便潛血檢測是早期篩查結(jié)直腸癌的有效手段。目前,已被臨床認可的糞便潛血檢測方法主要有:化學法、免疫法、膠體金免疫層析及質(zhì)譜等。

化學法是通過亞鐵血紅素來檢測糞便潛血現(xiàn)象,其中愈創(chuàng)木酯法(gFOBT)應用最廣[17]。據(jù)報道,gFOBT對結(jié)直腸癌的檢測靈敏度和特異性可達79.4%和97.7%[18],但化學法檢測受限條件較多,易導致結(jié)果假陰性或假陽性,目前已逐漸被糞便潛血免疫分析(faecal immunochemical test,FIT)所取代[19]。FIT是通過單克隆或多克隆抗體識別糞便中人血紅蛋白抗原等血液成分,以此監(jiān)測患者創(chuàng)口輕微出血的狀況,且不受飲食、藥物的干擾[16]。GUO等[20]研究表明,gFOBT檢測出晚期腫瘤的頻率低于FIT。對于晚期腫瘤,gFOBT的陽性檢測值低于FIT,與gFOBT陰性組相比,FIT陰性組患間期癌的可能性降低77%。WIETEN等[21]研究表明,gFOBT陰性組比FIT陰性組的間期結(jié)直腸癌(iCRC)發(fā)生率更高,FIT陰性組和gFOBT陰性組分別每100 000人每年約有20和34個CRC漏檢患者出現(xiàn),因此FIT比gFOBT的檢測價值更高。

免疫法糞便潛血檢測,主要包括以免疫層析技術(shù)為基礎的膠體金試紙法的定性FIT和免疫比濁法定量FIT。李佩等[22]對定性FIT和定量FIT檢測性能進行了評估。其中,定性免疫法糞便潛血檢測組陽性率比理論陽性率高,靈敏度可達100.00%;定量免疫法糞便潛血檢測組陽性率與理論陽性率的差異無統(tǒng)計學意義,其血紅蛋白水平與理論濃度高度相關(guān),靈敏度為86.21%。這表明,定性FIT靈敏度高,但特異性低于定量FIT;定性FIT由于其操作簡便、成本便宜更加適合廣泛使用,而定量FIT可對病情做出更精準的判斷。H?GBERG等[23]研究發(fā)現(xiàn):①使用定性FIT檢測直腸出血的606例患者,其靈敏度為96.2%,特異性為60.2%,陽性預測值為9.8%,陰性預測值為99.7%;②1421例無直腸出血患者的相應數(shù)字分別為100%、73.6%、8.3%和100%,但FIT對高危腺瘤(HRA)的檢出率不高,只有42%。FIT聯(lián)合糞便鈣衛(wèi)蛋白(fecal calprotectin,FC)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TF)等標志物的檢測,有助于提高檢測靈敏度和特異性[24]。LIANG等[25]研究發(fā)現(xiàn),從糞便嗜鉻梭菌中分離出來的基因標志物Lachnoclostridium(m3)比FIT的效能更高,聯(lián)合FIT和m3對晚期腺瘤的靈敏度可提升至56.8%,提示m3對基于糞便的腺瘤檢測有良好的效果。

綜上所述,結(jié)直腸癌患者FIT法比gFOBT法早期篩查效果更佳,擁有更好的進展期腺瘤檢出敏感度,是CRC大規(guī)模篩查的最佳選擇。

2.2 核酸標志物

CRC腫瘤細胞生長發(fā)育迅速,細胞分裂快且粘附性差,導致腫瘤細胞不斷地脫落到腸腔中。與此類似,糞便核酸檢測主要是測定腸道脫落細胞中的KRAS、NRAS、BRAF等特定基因位點的突變和BMP3、NDRG4、p33ING1b等基因甲基化的表觀遺傳生物標志物的異常變化[26],從而判斷CRC的發(fā)生發(fā)展狀況[17],指導患者個性化治療。

核酸在糞便和血液中的存在是微量的,因此需要利用實時熒光定量PCR、數(shù)字PCR和基因測序等高靈敏度高特異性的技術(shù)進行檢測[27]。未知的突變致癌基因位點核酸序列的檢測一般采用全基因組甲基化測序、全基因組測序、外顯子測序以及RNA末端平行分析法等。對已知突變致癌基因位點的檢測一般采用數(shù)字PCR技術(shù)、磁珠乳液擴增技術(shù)[28]、擴增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應、基于深度測序的腫瘤個體化指紋圖譜、雙向焦磷酸解激活的聚合反應、標記擴增深度測序和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)樸等[29]。

糞便核酸檢測在CRC無創(chuàng)篩查中應用前景廣闊。LIU等[30]研究顯示,SFRP2、SFRP1、TFPI2、BMP3、NDRG4、SPG20和BMP3+NDRG4基因甲基化水平對CRC檢測的敏感性為70%,特異性為80%,鑒別性與區(qū)分度良好,這些發(fā)現(xiàn)驗證了DNA甲基化作為糞便中微創(chuàng)生物標志物診斷CRC和腺瘤的可行性。CARETHERS等[31]研究發(fā)現(xiàn),多靶點糞便DNA(mt-sDNA)檢測CRC的靈敏度為92%,且mt-sDNA檢測對晚期腺瘤和無柄鋸齒狀息肉的檢出率均比FIT檢出率要高,同時總體特異性略低。通過對KRAS突變、NDRG4/BMP3啟動子甲基化和血紅蛋白的檢測,CRC早期篩查研究也顯示:mt-sDNA和FIT檢測的特異性分別為89%和93%,mt-sDNA的靈敏性較優(yōu)[31-32]。據(jù)報道[33],FIT-DNA聯(lián)檢對CRC、癌前病變和高危腺瘤的靈敏度和陽性率均高于定性膠體金法和定量免疫法,對正常健康腸道和其他性質(zhì)的疾病假陽性比率也小于定性膠體金法和定量免疫法,這提示:多靶點糞便FIT-DNA聯(lián)檢是早期篩查CRC經(jīng)濟有效的方法,對提高腸鏡檢查的依從性和檢出率有幫助。無創(chuàng)診斷FIT-DNA聯(lián)檢CRC最為準確,但對高危腺瘤(HRA)的檢出率僅有42%,有極大的隱患。BARNELL等[34]研究發(fā)現(xiàn),糞便真核RNA序列(stool-derived eukaryotic RNA,seRNA)是檢測高危腺瘤的絕佳標志物,采用二代測序聯(lián)合靶向擴增的方法,檢測HRA的靈敏度為45%,特異性為87%,相較于FIT-DNA聯(lián)檢法具有明顯的優(yōu)勢。

綜上所述,糞便核酸標志物的檢測靈敏度較高,但因存在的干擾因素較多,核酸含量較低,特異性較免疫法糞便潛血檢測略低。

3 討論與展望

結(jié)腸鏡檢是結(jié)直腸癌篩查的金標準,但不宜進行常規(guī)定期早篩檢查。雖然基于核酸擴增和膠體金免疫層析的FIT-DNA聯(lián)檢在CRC早期篩查中展現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度和特異性(≥90%),但多靶點表觀遺傳學液體活檢以其取材潔凈、良好的特異性和靈敏度而逐漸得到認可,后者可能成為未來CRC早期定期篩的首選方法,而DNA-RNA聯(lián)檢是CRC早期篩查及腺瘤鑒別的發(fā)展趨勢。