毛亞浩，張彤彤，余君，李道宇，陳雄，楊春雷，姚蘭

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030）

雪茄煙葉經(jīng)采收晾制后無(wú)法直接用于雪茄的生產(chǎn)，必須經(jīng)過(guò)發(fā)酵才能達(dá)到工業(yè)加工的需求，未經(jīng)發(fā)酵的煙葉青雜氣重且刺激性較大，這是因?yàn)樵谘┣褵熑~內(nèi)存在多種大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)含量在燃燒過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量難聞氣體，影響雪茄煙葉整體品質(zhì)［1］。發(fā)酵是改善雪茄煙葉品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，一般分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵，與自然發(fā)酵相比，人工發(fā)酵具有成本低、周期短的優(yōu)點(diǎn)，雪茄煙葉發(fā)酵中常采用人工發(fā)酵的方法［2-4］。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中人工添加部分微生物可以減少煙葉內(nèi)大分子物質(zhì)含量，進(jìn)而提高雪茄煙葉吸食品質(zhì)，使煙葉口感更加協(xié)調(diào)［5］。

酵母菌是一類可以產(chǎn)生香氣物質(zhì)的真菌，由于其產(chǎn)生香味物質(zhì)種類繁多，常被用于食品行業(yè)［6-8］，Assi-clair等［9］研究結(jié)果表明，釀酒酵母發(fā)酵可可豆可以促進(jìn)酯、醛、酮和吡嗪等香味物質(zhì)的形成，使其具有強(qiáng)烈的果香和花香。近年來(lái)，部分研究結(jié)果表明混菌發(fā)酵相比于單菌發(fā)酵更有利于產(chǎn)品風(fēng)味的形成［10］，Singracha等［11］使用嗜鹽四聯(lián)球菌、魯氏接合酵母和季也蒙畢赤酵母混合發(fā)酵制備醬油，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，乙醇、2-甲基-1-丙醇和麥芽酚等揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量顯著提高；Xu等［12］研究發(fā)現(xiàn)，使用混合發(fā)酵劑（季也蒙畢赤酵母、畢赤酵母和舊金山乳桿菌）發(fā)酵面包可以增強(qiáng)其感官品質(zhì)，促進(jìn)2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、糠醛和乙酸等芳香化合物的形成。Hou等［13］研究表明，接種葡萄園有孢漢遜酵母P5 和釀酒酵母P1 發(fā)酵后的蘋果酒中2-苯基乙酸乙酯（玫瑰和蜂蜜香味）是對(duì)照的4.6倍，經(jīng)感官分析發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵后的蘋果酒香味明顯改善。

酵母菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)香能力，但將酵母菌應(yīng)用于雪茄煙葉發(fā)酵中以提高雪茄煙葉香氣的報(bào)道較少。本研究以從雪茄煙葉表面篩選出來(lái)的一株纖維素降解菌C1 與5 種具有產(chǎn)香能力的酵母共同處理雪茄煙葉，探究復(fù)合微生物對(duì)雪茄煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量以及品質(zhì)的影響，同時(shí)也能為酵母菌在雪茄煙葉發(fā)酵中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙葉來(lái)源于湖北省十堰市丹江口市習(xí)家店煙草站CX-014 晾制結(jié)束的雪茄茄芯中部煙葉。

供試菌株C1 篩選自雪茄煙葉表面；庫(kù)德畢赤酵母、費(fèi)比恩酵母、漢遜酵母、Starmerella bacillaris、拜爾接合酵母均使用由本實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株。

纖維素產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白棟10 g，酵母粉10 g，CMC-Na 10 g，NaCl 5 g，KH2P041 g，去離子水1 000 mL，pH 5.8～6.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

YPD 培養(yǎng)基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，115 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵方法 參考覃明娟等［14］的方法并修改，供試煙葉回潮至適當(dāng)水分后切成煙絲，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌株C1 與4.5‰葡萄糖、2.25‰谷氨酸混合后，加入無(wú)菌水充分溶解制成接種液，將接種液均勻噴灑在煙絲上，平衡水分后，保持煙葉水分為30%，然后放入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵6 d 后接種酵母菌，30 ℃繼續(xù)發(fā)酵6 d，其中菌株C1 的單菌發(fā)酵條件為單獨(dú)接入菌株C1 和上述濃度的葡萄糖、谷氨酸37℃發(fā)酵6 d，酵母菌單菌發(fā)酵條件為單獨(dú)接種酵母菌30 ℃發(fā)酵6 d，發(fā)酵結(jié)束后，40 ℃烘干制樣。

1.2.2 發(fā)酵方案 由于在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)菌株C1與酵母菌同時(shí)發(fā)酵雪茄煙葉過(guò)程中無(wú)法共同生長(zhǎng)，因此采用分段發(fā)酵的方法進(jìn)行雪茄煙葉的發(fā)酵，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1.2.3 煙葉主要化學(xué)成分測(cè)定 參照Yao等［15］的方法進(jìn)行測(cè)定，取烘干后的煙葉粉末0.25 g，加入25 mL萃取液（1%乙酸，2%乙醇）震蕩1 h后，使用連續(xù)流動(dòng)分析儀對(duì)過(guò)濾后的上清液進(jìn)行化學(xué)成分測(cè)定。

1.2.4 同時(shí)蒸餾萃?。⊿DE）煙草揮發(fā)性香氣物質(zhì) 將煙葉去除主脈，烘干粉碎過(guò)篩后，準(zhǔn)確稱取10.0 g，放入1 000 mL 圓底燒瓶中，并加入200 mL 飽和食鹽水；稱取60 mL 二氯甲烷于100 mL 圓底燒瓶中，分別連接在SDE 裝置兩側(cè)。有機(jī)相（二氯甲烷）使用55 ℃水浴加熱，水相使用160 ℃油浴加熱。待水相和有機(jī)相達(dá)到液液分層后，繼續(xù)反應(yīng)5 h，收集有機(jī)相萃取液，同時(shí)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至2 mL，加入50 μL 1.202 8 mg/mL 乙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)。干燥后，使用0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾后裝入Agilent進(jìn)樣瓶中。

1.2.5 GC/MS 條件 氣相色譜：Agilent Techologies 7890A；色譜柱：HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量：1 μL；載氣：氦氣；流速：1 mL/min；分流比：10∶1；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：40 ℃保持2 min，以2 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min，然后10 ℃/min升至280 ℃；質(zhì) 譜：Agilent Techologies 5975C；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；電離方式EI：70 eV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行，采用Origin 2019 作圖、Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中雪茄煙葉主要化學(xué)成分的變化

煙葉主要化學(xué)成分是影響雪茄煙品質(zhì)的重要指標(biāo)，決定了煙葉吸食的協(xié)調(diào)性［16］。雪茄煙發(fā)酵過(guò)程中主要化學(xué)成分變化如圖1 至圖4 所示。由圖1 可以看出，在雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中，還原糖含量總體呈下降趨勢(shì)，但還原糖降低速率有較大差異，說(shuō)明在雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中微生物利用還原糖作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育。其中在單菌發(fā)酵方案中，雪茄煙葉發(fā)酵結(jié)束后還原糖含量在0.28%～0.32%，而在混合發(fā)酵方案中，其還原糖含量在0.21%～0.26%，這可能是由于接種微生物種類不同，其在雪茄煙葉固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)情況不同所致。圖2 是發(fā)酵過(guò)程中雪茄煙葉總糖含量的變化趨勢(shì)，可以看出在發(fā)酵過(guò)程中總糖含量變化趨勢(shì)與還原糖基本一致，其中單菌方案中，發(fā)酵結(jié)束雪茄煙葉總糖含量在0.70%～0.83%，而混合方案總糖含量在0.60%左右。

圖1 雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化

圖2 雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中總糖含量的變化

煙堿是雪茄煙中重要的植物堿，煙堿含量決定了煙葉的勁頭，也是煙葉中主要有害物質(zhì)之一［17］。圖3 和圖4 分別是雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中煙堿和總氮含量的變化曲線圖，可以看出在雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中煙堿和總氮含量基本保持不變，其中煙堿含量為5.24%～5.71%，而總氮含量為2.71%～3.20%，這與張銳新等［18］的研究結(jié)果一致。

圖3 雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中煙堿含量的變化

圖4 雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中總氮含量的變化

2.2 雪茄煙葉中揮發(fā)性中性香氣物質(zhì)的變化

對(duì)不同方案發(fā)酵過(guò)程中雪茄煙葉揮發(fā)性中性香氣成分進(jìn)行測(cè)定，共發(fā)現(xiàn)23 種香氣物質(zhì)，可分為5類：美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、西柏烷類轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以及其他香氣物質(zhì)［19］。由表2 和表3 可以看出，單菌發(fā)酵方案中，菌株C1 和費(fèi)比恩酵母發(fā)酵后的雪茄煙葉總香氣含量較高，分別為638.17 μg/g 和606.53 μg/g?；炀l(fā)酵后，雪茄煙葉香氣物質(zhì)含量顯著提高，其中菌株C1和漢遜酵母共同處理后的雪茄煙葉總香氣物質(zhì)含量最高為998.09 μg/g，與單菌發(fā)酵中香氣物質(zhì)含量最高的方案相比提高了56.4%。試驗(yàn)結(jié)果表明，雪茄煙葉在經(jīng)過(guò)菌株C1 處理后再經(jīng)過(guò)庫(kù)德畢赤酵母、漢遜酵母、費(fèi)比恩酵母和Starmerella bacillaris繼續(xù)發(fā)酵可以有效提高雪茄煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量，從而進(jìn)一步提高雪茄煙葉品質(zhì)。

新植二烯是雪茄煙葉中含量最高的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，新植二烯在雪茄煙葉燃燒時(shí)可以攜帶其他香氣物質(zhì)進(jìn)入煙氣，是煙葉的重要增香劑［19］。在單菌發(fā)酵方案中，新植二烯含量最高為471.19 μg/g，而在混菌階段發(fā)酵方案中，除拜耳接合酵母外，其余4 種酵母菌與菌株C1 共同發(fā)酵后的雪茄煙葉新植二烯含量均明顯高于單菌階段發(fā)酵，其中菌株C1 和漢遜酵母共同發(fā)酵后的雪茄煙葉中新植二烯含量高達(dá)755.38 μg/g。

雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物主要有糠醛、糠醇等呋喃類物質(zhì)［20］，由表2、表3 可知，單酵母發(fā)酵方案中，拜耳接合酵母處理后的雪茄煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量最高為4.17 μg/g，而混菌發(fā)酵后的雪茄煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量明顯提高。其中方案10 即菌株C1和Starmerella bacillaris共同發(fā)酵后的雪茄煙葉中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量最高為15.39 μg/g，約是未經(jīng)菌株C1 處理組的4 倍。在菌株C1 分別與庫(kù)德畢赤酵母和拜耳接合酵母混合發(fā)酵的雪茄煙葉中糠醇含量較高分別為7.22 μg/g 和7.78 μg/g，約是單酵母發(fā)酵煙葉中的5倍，約是單菌株C1 發(fā)酵的1.4倍。單菌發(fā)酵方案中，菌株C1 發(fā)酵后的煙葉中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量最高，除漢遜酵母外，其余酵母菌方案的雪茄煙葉無(wú)明顯差異；而混菌方案中，除菌株C1 和費(fèi)比恩酵母處理后煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物較低，其余組合差異較小。這些差異可能與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的形成有關(guān)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是由還原糖和氨基酸在一定溫度下發(fā)生的［21］，而菌株C1 在雪茄煙發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生纖維素酶，使部分纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖更有利于美拉德反應(yīng)進(jìn)行。

苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是雪茄煙重要的香氣成分，其中苯乙醇、苯甲醇等具有強(qiáng)烈的花香，可以顯著提高雪茄煙的風(fēng)味［20］。分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)菌株C1、菌株C1與漢遜酵母以及菌株C1與Starmerella bacillaris共同發(fā)酵后的雪茄煙葉苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量較高，在36.25～43.69 μg/g，是其余方案的2 倍左右。經(jīng)過(guò)復(fù)合微生物發(fā)酵的煙葉與單菌相比苯甲醇、苯乙醇含量明顯提高，這對(duì)提高雪茄煙風(fēng)味有重要作用。值得注意的是在單菌發(fā)酵后的雪茄煙葉中都檢測(cè)到苯乙醛的存在，而在混菌發(fā)酵后苯乙醛基本消失，推測(cè)可能是由于添加復(fù)合微生物導(dǎo)致雪茄煙表面微生物組成發(fā)生變化，促進(jìn)苯乙醛脫氫轉(zhuǎn)化為苯乙醇所致［22］。另外經(jīng)漢遜酵母和費(fèi)比恩酵母發(fā)酵過(guò)的雪茄煙葉苯甲醇含量均明顯提高，說(shuō)明這兩種酵母更有利于苯甲醇的合成。

類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是煙葉中除新植二烯外含量最高的香氣物質(zhì)種類，由表2、表3 可以看出，單酵母菌發(fā)酵后的雪茄煙葉類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量差異不大，含量在38.40～45.00 μg/g，說(shuō)明酵母菌對(duì)類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化作用不顯著。除庫(kù)德畢赤酵母外，經(jīng)過(guò)菌株C1 和其余酵母菌發(fā)酵后的雪茄煙葉類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量均明顯提高，其中菌株C1 與漢遜酵母共同發(fā)酵后的煙葉中類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量最高為80.85 μg/g，約是單酵母發(fā)酵的2 倍。與單酵母發(fā)酵相比，經(jīng)過(guò)菌株C1 發(fā)酵后的煙葉中大馬士酮、巨豆三烯酮A 以及巨豆三烯酮B 含量均明顯提高。推測(cè)可能是由于菌株C1 在發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生CCD1、CCD4 等類胡蘿卜素裂解雙加氧酶從而促進(jìn)類胡蘿卜素的降解轉(zhuǎn)化［23］。西柏烷類轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要是茄酮，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各方案中茄酮含量變化不明顯，均在20 μg/g 左右。

表2 單菌發(fā)酵揮發(fā)性中性香氣物質(zhì)含量（單位：μg/g）

表3 混菌發(fā)酵揮發(fā)性中性香氣物質(zhì)含量（單位：μg/g）

產(chǎn)香酵母在煙葉上的應(yīng)用報(bào)道較少，近年來(lái)有部分學(xué)者將產(chǎn)香酵母應(yīng)用到煙葉發(fā)酵中，得到了較好的效果。胡志忠等［24］利用產(chǎn)香酵母發(fā)酵煙葉后發(fā)現(xiàn)煙葉中新增多種致香物質(zhì)，且新植二烯含量與對(duì)照相比增加了78.07 μg/g。郭林青等［25］研究結(jié)果表明，漢遜酵母發(fā)酵煙沫后其醇類物質(zhì)含量明顯增加，與對(duì)照相比其發(fā)酵液香味明顯改善。帥瑤等［26］、薛磊等［27］研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合微生物對(duì)煙葉發(fā)酵后，煙葉中β-大馬酮等多種香氣物質(zhì)含量增加，煙氣細(xì)膩度改善，香氣質(zhì)和香氣量均有增加，雜氣減輕顯著，煙葉質(zhì)量明顯改善，這與本研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究使用階段發(fā)酵的方法處理雪茄煙葉，通過(guò)利用菌株C1 對(duì)煙葉纖維素的降解作用以及酵母的產(chǎn)香能力對(duì)雪茄煙葉進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單酵母發(fā)酵方案中費(fèi)比恩酵母發(fā)酵后的雪茄煙葉香氣物質(zhì)總量最高為606.53 μg/g，其余酵母無(wú)明顯差異，均在500 μg/g 左右。而經(jīng)過(guò)菌株C1 與酵母菌株混菌發(fā)酵后的雪茄煙葉與單菌發(fā)酵相比香氣物質(zhì)總量明顯提高，其中以菌株C1 和漢遜酵母混菌發(fā)酵后的雪茄煙葉效果最顯著，香氣物質(zhì)總量達(dá)到998.09 μg/g，為費(fèi)比恩單菌發(fā)酵的1.6 倍。

經(jīng)復(fù)合微生物混菌發(fā)酵后的雪茄煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類沒(méi)有變化，但含量顯著提高，其中漢遜酵母和費(fèi)比恩酵母處理后的雪茄煙葉苯甲醇含量明顯高于其他處理組，菌株C1 更有利于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物以及苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成。