馬 玥,張 瑩,孫 琦,史振偉,黃轉(zhuǎn)青,楊 飛,石浩源,楊亞龍,徐風(fēng)華

在軍事行動(dòng)和平時(shí)創(chuàng)傷中,大出血是導(dǎo)致院前死亡的主要原因之一[1-3]。近年來(lái),有研究發(fā)現(xiàn)礦物質(zhì)沸石具有一定生物活性,可用于機(jī)體止血且效果顯著[2]。為解決緊急止血問(wèn)題,項(xiàng)目組研發(fā)了一種低產(chǎn)熱納米沸石顆粒敷料[4],以紗布棉纖維作為結(jié)構(gòu)支架,采用無(wú)模板生長(zhǎng)方式,將介孔單晶菱沸石緊密結(jié)合在棉纖維表面的止血材料上,錨定在棉纖維上的沸石顆粒平均尺寸為5 μm,單個(gè)顆粒是由納米晶體[(148±37)nm]聚集而成。前期項(xiàng)目組使用豬股骨交界動(dòng)脈破裂槍擊模型比較沸石止血紗布與其他止血材料的功效,發(fā)現(xiàn)新型沸石止血紗布不僅能有效控制出血,還解決了沸石產(chǎn)品止血局部放熱的副作用[5]。盡管新型沸石止血紗布是外用急救止血材料,性能穩(wěn)定,但其在傷口按壓止血過(guò)程中的生物安全性尚不清楚。本研究參照我國(guó)GB/T16886醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和GB/T 14233.2-2005《中華人民共和國(guó)藥典》,對(duì)納米沸石止血紗布的生物安全性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià),為今后在臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 新型沸石止血紗布(杭州沸創(chuàng)醫(yī)療科技有限公司,批號(hào)20200901);DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(美國(guó)Gibco公司),青霉素-鏈霉素(北京百靈克生物科技有限公司);UV-2550紫外分光光度計(jì)(日本島津);酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀)。

1.2 浸提液的制備 參照GB/T 16886醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6],稱(chēng)量6.045 g無(wú)菌沸石紗布置于30 ml DMEM培養(yǎng)液中,37 ℃環(huán)境下浸提24 h,并用0.22 μm濾膜過(guò)濾得相對(duì)濃度為100%的浸提液,稀釋成不同濃度備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)新西蘭純種雄兔6只,體重2～2.5 kg;清潔級(jí)豚鼠20只,體重(300±20)g;昆明系小鼠20只,體重17～20 g,由北京圣水金蟾養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社提供[許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010]。試驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn),授權(quán)編號(hào)為2019-X15-90。L929小鼠成纖維細(xì)胞株由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 采用CCK8法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)[7]。試驗(yàn)分組:A、B、C、D組分別為相對(duì)濃度100%、75%、50%、25%沸石紗布浸提液,培養(yǎng)12、24、48、72 h后,加入含10% CCK-8溶液,酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值(490 nm),并計(jì)算相對(duì)增殖率(relative growth rate, RGR)。RGR(%)=試驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值×100%。

1.4.2 溶血試驗(yàn) 分為試驗(yàn)組(沸石紗布浸提液)、陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(蒸餾水),依據(jù)文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行溶血試驗(yàn),計(jì)算溶血率。溶血率(%)=(樣品吸光度-陰性對(duì)照吸光度)/(陽(yáng)性對(duì)照吸光度-陰性對(duì)照吸光度)×100%。

1.4.3 熱原試驗(yàn) 按照GB/T 14233.2-2005《中華人民共和國(guó)藥典》[9],篩選3只體溫在38.0～39.6 ℃波動(dòng)不超過(guò)0.4 ℃的白兔。自兔耳緣靜脈注射紗布浸提液(約38 ℃),注射劑量10 ml/kg。每隔1 h測(cè)量肛溫,連續(xù)測(cè)3次,計(jì)算兔體溫的升高度數(shù)。

1.4.4 急性全身毒性試驗(yàn) 將20只小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組,每組10只,記錄初始體重,分別經(jīng)尾靜脈注射沸石紗布浸提液和生理鹽水,注射劑量0.05 ml/g,注射速度0.1 ml/s。參照評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)觀(guān)察注射后24、48、72 h動(dòng)物一般狀態(tài)、體重變化、毒性表現(xiàn)和死亡情況。

1.4.5 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn) 取新西蘭白兔(n=3),試驗(yàn)前24 h背部4 cm×8 cm區(qū)域去毛。在脊柱兩側(cè)皮膚試驗(yàn)區(qū)各距離脊柱2 cm處各設(shè)計(jì)5個(gè)注射點(diǎn),每點(diǎn)之間間隔2 cm進(jìn)行皮內(nèi)注射,每點(diǎn)注射0.2 ml。觀(guān)察注射后24、48、72 h的皮膚反應(yīng),根據(jù)紅斑及水腫反應(yīng)進(jìn)行計(jì)分,并計(jì)算原發(fā)刺激指數(shù),確定刺激反應(yīng)類(lèi)型。

1.4.6 致敏試驗(yàn) 將豚鼠隨機(jī)分為3組,每組6只。按照皮內(nèi)誘導(dǎo)階段、局部誘導(dǎo)階段和激發(fā)階段的試驗(yàn)[10],觀(guān)察24、48、72 h貼敷部位有無(wú)紅斑、水腫、焦痂發(fā)生。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),各濃度浸提液OD值均有所增加,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,且于48 h后顯著增加,相對(duì)增殖率均在0～1級(jí),無(wú)顯著細(xì)胞毒性(表1)。培養(yǎng)72 h后,顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,多呈梭形,試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量無(wú)明顯差異(圖1)。

表1 CCK-8法細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及相應(yīng)毒性等級(jí)

圖1 新型沸石止血紗布72 h后試驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)(× 40)A.試驗(yàn)組;B.對(duì)照組。

2.2 溶血試驗(yàn) 試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組上清液未見(jiàn)紅色渾濁溶血狀態(tài),無(wú)明顯紅細(xì)胞破裂。試驗(yàn)組溶血率為3.37%(≤5%),陰性和陽(yáng)性對(duì)照組溶血率分別為0和100%,結(jié)果表明新型沸石止血紗布未引起明顯的溶血反應(yīng)。

2.3 熱原試驗(yàn) 測(cè)得 3 只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體溫分別升高0 ℃、0.4 ℃、0.2 ℃,均小于0.6℃;且體溫升高總數(shù)為 0.6℃,小于1.4℃,結(jié)果表明新型沸石止血紗布未引起動(dòng)物熱原反應(yīng)。

2.4 急性全身毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠在觀(guān)察時(shí)間窗內(nèi)一般狀態(tài)良好,未出現(xiàn)明顯中毒反應(yīng),無(wú)死亡。兩組小鼠體重均有增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)。

表2 新型沸石止血紗布急性全身毒性試驗(yàn)動(dòng)物體重變化

2.5 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn) 3只新西蘭白兔在72 h內(nèi)均無(wú)紅斑、水腫,未見(jiàn)任何刺激反應(yīng),計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)平均原發(fā)性刺激為0,表示新型沸石止血紗布未引發(fā)明顯的皮膚刺激反應(yīng)。

2.6 致敏試驗(yàn) 試驗(yàn)中2只陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物分別于皮內(nèi)刺激和局部誘導(dǎo)階段死亡,其余4只動(dòng)物24 h試驗(yàn)區(qū)皮膚出現(xiàn)明顯的焦痂壞死,試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組動(dòng)物激發(fā)部位皮膚均無(wú)紅斑、水腫和焦痂(圖2)。結(jié)果表明,新型沸石止血紗布未引起動(dòng)物的致敏反應(yīng)。

圖2 新型沸石止血紗布動(dòng)物致敏試驗(yàn)A.皮內(nèi)注射;B.試驗(yàn)組;C.陰性對(duì)照組;D.陽(yáng)性對(duì)照組。

3 討 論

沸石是一種存在于自然界的硅鋁酸鹽礦物,典型孔徑為0.4～1.2 nm[11],多孔結(jié)構(gòu)能夠快速有效地控制大血管出血[12]。但有研究發(fā)現(xiàn),如止血后清創(chuàng)不充分,殘留在傷口處的沸石顆?？赡軙?huì)引起熱損傷等不良反應(yīng)[13]。新型沸石止血紗布以棉線(xiàn)作為襯底,通過(guò)化學(xué)鍵使沸石涂層直接生長(zhǎng)在纖維素上,脫落率<15%[4]。前期研究發(fā)現(xiàn),在豬股動(dòng)脈槍擊模型中,新型沸石止血紗布組的出血量和止血時(shí)間均有顯著改善,且創(chuàng)面溫度未見(jiàn)明顯升高,各項(xiàng)生理指標(biāo)提示機(jī)體未出現(xiàn)血壓、凝血功能異常等不良反應(yīng)[5]。目前關(guān)于其生物安全性評(píng)價(jià)并未見(jiàn)公開(kāi)的系統(tǒng)資料報(bào)道,僅通過(guò)檢測(cè)血液指標(biāo)無(wú)法全面評(píng)估紗布應(yīng)用后皮膚局部是否發(fā)生過(guò)敏或毒性反應(yīng)。生物材料不同于藥物,由于直接與人體接觸,是否有活性成分進(jìn)入體內(nèi),以及存留時(shí)間長(zhǎng)短,都會(huì)影響臨床應(yīng)用的安全性,因此對(duì)其進(jìn)行生物安全性研究至關(guān)重要。本研究擬在止血試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)新型沸石止血紗布進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià)。

參照GB/T 16886 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),沸石止血紗布屬于Ⅱ類(lèi)醫(yī)療器械,本研究從細(xì)胞毒性、溶血、皮內(nèi)和致敏試驗(yàn)方面對(duì)沸石止血紗布的生物安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。在細(xì)胞毒試驗(yàn)中應(yīng)用不同濃度的浸提液,能反映在不同應(yīng)用情況下新型沸石止血紗布對(duì)細(xì)胞的影響。本研究結(jié)果顯示,新型沸石止血紗布的細(xì)胞毒性等級(jí)均在0～1級(jí),提示無(wú)明顯細(xì)胞毒性。新型沸石紗布主要用于急救止血,它的血液相容性是評(píng)價(jià)生物安全的一項(xiàng)重要內(nèi)容。本研究證實(shí)新型沸石與血液接觸后未引起急性溶血反應(yīng)。皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)是通過(guò)皮內(nèi)注射浸提液觀(guān)察受試樣品誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生刺激反應(yīng)的潛在性,在各種體內(nèi)特異性試驗(yàn)中應(yīng)用最廣。本試驗(yàn)中,證明沸石紗布浸提液不引起皮內(nèi)反應(yīng)刺激。致敏試驗(yàn)中加入了FCA使得豚鼠的致敏能力增強(qiáng),顯著提高了試驗(yàn)篩選接觸性致敏原的有效性。陽(yáng)性對(duì)照組的焦痂壞死提示變應(yīng)原可誘發(fā)100%的豚鼠致敏,試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組動(dòng)物,致敏反應(yīng)為陰性,證實(shí)沸石紗布浸提液沒(méi)有致敏性。

本研究參照醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),證實(shí)新型沸石止血紗布的生物相容性較好,是一種安全、快速、有效的急救止血材料。